Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Podsumowanie

Eksperymenty z konkurencyjnym homingiem pozwalają na bezpośrednią ocenę właściwości migracyjnych dwóch różnych populacji komórek u jednej myszy. W niniejszym materiale ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację limfocytów T o tropizmie jelitowym i nietropowym generowanych ex vivo.

Streszczenie

Aby pełnić swoje funkcje, limfocyty muszą opuścić krew i migrować do różnych tkanek w organizmie. Adhezja limfocytów do komórek śródbłonka i ich ekstrawasacja do tkanek to wieloetapowy proces kontrolowany przez różne cząsteczki adhezyjne (receptory homingu) wykazujące ekspresję na limfocytach oraz ich odpowiadające im ligandy (adresyny) obecne na komórkach śródbłonka ^{1 2}. Chociaż funkcję tych receptorów adhezyjnych można częściowo badać ex vivo, ostatecznym testem ich znaczenia fizjologicznego jest ocena ich roli podczas adhezji i migracji limfocytów in vivo. W tym celu stosuje się dwie komplementarne strategie: mikroskopię intravitalną (IVM) oraz eksperymenty z homingiem. Choć IVM była niezbędna do zdefiniowania dokładnego wkładu konkretnych receptorów adhezyjnych w kaskadę adhezji w czasie rzeczywistym i w różnych tkankach, technika ta jest czasochłonna i pracochłonna, często wymaga opracowania zaawansowanych technik chirurgicznych, poprzedzenia analizy izolacją homogenicznych populacji komórek i pozwala na badanie tylko jednej tkanki/organu w danym czasie. Z kolei konkurencyjne eksperymenty z homingiem umożliwiają bezpośrednie i jednoczesne porównanie migracji dwóch (lub więcej) subpopulacji komórek u tej samej myszy, a także pozwalają na analizę wielu tkanek i dużej liczby komórek w ramach jednego eksperymentu.

W niniejszym opracowaniu opisujemy klasyczny protokół konkurencyjnego homingu, stosowany w celu określenia przewagi lub braku przewagi danego typu komórek w procesie homingu do konkretnych tkanek w porównaniu z kontrolną populacją komórek. Do zilustrowania właściwości migracyjnych wybraliśmy limfocyty T tropiące do jelit oraz limfocyty T nietropiące do jelit, ponieważ błona śluzowa jelit stanowi największą powierzchnię ciała w kontakcie z środowiskiem zewnętrznym i jest ponadto tkanką pozachłonniczą o najlepiej określonych wymaganiach migracyjnych. Co więcej, w niedawnych badaniach ustalono, że metabolit witaminy A, kwas all-trans-retinowy (RA), jest głównym mechanizmem molekularnym odpowiedzialnym za indukcję specyficznych dla jelit receptorów adhezyjnych (integryny a4b7 oraz receptora chemokinowego CCR9) na limfocytach. Dzięki temu możemy łatwo generować duże liczby limfocytów tropiących i nietropiących do jelit ex vivo, aktywując limfocyty T odpowiednio w obecności lub w nieobecności RA, które następnie mogą zostać wykorzystane w opisanych tutaj eksperymentach z konkurencyjnym homingiem.

Protokół

1. Generowanie ex vivo limfocytów T ukierunkowanych na jelita oraz kontrolnych limfocytów T (patrz Rysunek 1)

1. Wyizolować splenocyty poprzez rozcieranie jednej śledziony pobranej od myszy typu dzikiego. Zawiesinę komórkową resuspender w PBS i wirować przez 5' przy 400 x g. Usunąć nadsącz i poddać erytrocyty lizie, resuspender pellet komórkowy w 4 ml buforu lizującego ACK na 2-3 minuty. Następnie dodać 5 ml PBS. Wirować przez 5' przy 400 x g i usunąć nadsącz.
2. Resuspender całkowitą liczbę splenocytów w stężeniu 1 x 10⁶/mL w pożywce IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-merkaptoetanolu + penicyliny/streptomycyny (pełna pożywka IMDM). Podzielić komórki na dwie grupy, z czego jedna zostanie uzupełniona o RA (lub syntetyczne agoniści RAR, takie jak Am80 lub Am580) do stężenia końcowego 100-200 nM ³. Limfocyty T aktywowane w obecności RA lub agonistów RAR będą wykazywać nadekspresję a4b7 oraz CCR9 i przekształcą się w limfocyty T o tropizmie jelitowym, natomiast limfocyty T aktywowane bez RA będą stanowić grupę kontrolną.
3. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej, uprzednio pokrytej przeciwciałami anty-CD3 (10 mg/ml) i anty-CD28 (10 mg/ml), dodać 1,5-2,0 mL zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 37°C w 5% CO₂ (w celu pokrycia płytki dodać 500 ml/dołek anty-CD3 oraz anty-CD28 w PBS i inkubować przez 2 godziny w 37˚C, a następnie przemyć dwukrotnie 2 ml PBS).
4. Aby uniknąć nadmiernej stymulacji limfocytów T, po 2-3 dniach przenieść zawiesiny komórkowe do nowej, niepokrytej płytki 24-dołkowej. Inkubować przez kolejne 2-3 dni. W zależności od gęstości komórek i proliferacji pożywka może zakwasić się (zmienić kolor na żółty), w takim przypadku może być konieczne zastąpienie połowy pożywki świeżą pełną pożywką IMDM. Zebrać komórki po 4-5 dniach (licząc od dnia 0).
5. Typowa końcowa wydajność wynosi 1-2 x 10⁶ efektorowych limfocytów T na dołek. W związku z tym, aby uzyskać 10-20 x 10⁶ limfocytów T na każdą warunek, należy wysiać minimum 9-12 dołków limfocytów T o tropizmie jelitowym oraz 9-12 dołków limfocytów T kontrolnych.

2. Analiza receptorów homingu jelitowego na aktywowanych limfocytach T

Po 4-5 dniach hodowli powinniśmy zaobserwować wysoką ekspresję receptorów homingu jelitowego a4b7 oraz CCR9 na limfocytach T aktywowanych w obecności RA lub agonistów RAR, podczas gdy limfocyty T z grupy kontrolnej powinny wykazywać bardzo niski poziom tych receptorów ⁴.

Analiza cytometrii przepływowej (FACS).

1. Należy zebrać od 0,2 do 0,5 x10⁶ komórek i wirować przez 5 min przy 300 g w temperaturze 4°C.
2. Inkubować z przeciwciałami anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) oraz anti-CD8-PercP przez 15 min w temperaturze 4°C w ciemności.
3. Po inkubacji wirować przez 5 min przy 300 g w temperaturze 4°C. Komórki należy przemyć, resuspender w buforze do barwienia i analizować za pomocą FACS.

3. Znakowanie limfocytów T markerami komórkowymi CFSE i CMTMR

1. Przed rozpoczęciem należy utrzymać wszystkie roztwory w temperaturze 37°C. Komórki T tropiczne do jelit (a4b7^HighCCR9^High) oraz kontrolne komórki T (a4b7^Low/Neg CCR9^Low/Neg) należy przemyć dwukrotnie PBS w celu usunięcia surowicy. Stężenie komórek T należy dostosować do poziomu 10-15 x 10⁶/mL w PBS.
2. Do komórek T tropicznych do jelit i kontrolnych komórek T należy dodać fluorofory CFSE (estery sukcynimidylowe karboksyfluoresceiny) lub CMTMR (chlorometylo-benzoilo-amino-tetrametylorodaminę) do końcowych stężeń odpowiednio 5 mM i 10 mM, delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować przez 20 min w 37°C. Zaleca się zamianę etykietowania w tym samym lub osobnym eksperymencie, aby wykluczyć potencjalny wpływ wewnętrzny fluoroforów na migrację komórek T.
3. Po inkubacji proces należy zatrzymać, dodając 1 objętość FBS, a następnie inkubować przez 1-5 min w temperaturze pokojowej. Roztwór należy rozcieńczyć 10-krotnie w ciepłym PBS i odwirować przez 5 min przy 300 g. Próbkę należy przemyć dwukrotnie PBS i resuspendować w pełnej pożywce IMDM.
4. W idealnych warunkach 10-20 x 10⁶ komórek z każdej populacji T należy zmieszać w stosunku 1:1, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 min. Na koniec komórki należy resuspendować w 200-250 mL ciepłego PBS i wstrzyknąć do żyły ogonowej.
5. Aby obliczyć dokładny stosunek wprowadzonych komórek (idealnie bliski 1), należy odłożyć 5-10 mL wstrzykiwanej zawiesiny komórek, rozcieńczyć ją 300 mL PBS i przeanalizować metodą FACS.

4. Analiza homingu limfocytów T

Chociaż myszy można analizować w różnych punktach czasowych (od 1 h do kilku dni po iniekcji limfocytów T), homing limfocytów T tropicznych do jelit jest najlepiej udokumentowany między 12 a 24 h po iniekcji. Dłuższe odstępy czasu zwiększają potencjalny wpływ innych zmiennych oddziałujących na końcową liczbę lub stosunki komórek, takich jak apoptoza limfocytów T oraz ich opuszczanie tkanki. Po eutanazji myszy zawiesiny komórkowe z kilku tkanek należy wyizolować bezzwłocznie, aby ograniczyć śmierć komórek, co mogłoby wpłynąć na końcową wydajność i wyniki. Tkaniami podlegającymi analizie są jelito cienkie, jelito grube, śledziona, węzły chłonne, kępki Peyera, wątroba, płuca oraz krew. Jeśli wstrzyknięte limfocyty T są rzeczywistymi limfocytami T tropicznymi do jelit, powinny one migrować do błony śluzowej jelita cienkiego średnio 5-10 razy efektywniej (lub bardziej) w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T. Jednak w innych tkankach, takich jak krew i śledziona, nie powinna występować preferencyjna migracja limfocytów T. Izolacja limfocytów z blaszki właściwej jelit oraz z przedziału wewnątrznabłonkowego została opisana wcześniej ⁵.

1. Barwienie FACS: Próbki są resuspenderowane w zależności od liczby zebranych komórek, do gęstości nieprzekraczającej 3.0 x 10⁶ komórek/ml. Jeśli w charakterze biorców zastosowano myszy kongeniczne CD45.1⁺ lub Thy1.1⁺, komórki barwi się odpowiednim markerem kongenicznym (np. CD45.2 lub Thy1.2) w połączeniu z markerem linii (np. TCRbchain, CD4, CD8, CD45.1⁺/CD45.2⁺).
2. Podczas analizy FACS komórki są bramkowane na marker kongeniczny (np. CD45.1), a następnie na specyficzne markery linii (np. CD4/CD8) i analizowane pod kątem stosunku komórek pozytywnych dla CMTMR i CFSE.
3. Dane są zazwyczaj wyrażane jako indeks homingu (Homing Index, HI), który oblicza się jako stosunek CFSE/CMTMR (lub CMTMR/CFSE) w każdej tkance podzielony przez odpowiadający mu stosunek wejściowy (patrz poniżej). Jeśli stosunek wejściowy jest bardzo bliski 1, to stosunki tkankowe będą równoważne HI.

HI = CFSE_tissue / CMTMR_tissue : CFSE_input / CMTMR_input

Krew powinna zostać również poddana analizie w celu ustalenia, czy obie populacje limfocytów T są reprezentowane w krążeniu w równym stopniu, czy też jedna z populacji limfocytów T jest zmniejszona w stosunku do drugiej (np. wskutek preferencyjnego zatrzymania w płucach/wątrobie lub obniżonej żywotności). Może to wystąpić przy porównywaniu naiwnych lub spoczynkowych komórek pamięci T z niedawno aktywowanymi efektorowymi limfocytami T, ponieważ te ostatnie mogą być w większym stopniu zatrzymywane w płucach. Jeśli HI we krwi różni się znacząco od 1, można znormalizować HI w tkankach względem HI we krwi. Krew można pobrać poprzez punkcję serca u myszy znieczulonych (awertynem lub izofluranem przed eutanazją); przed użyciem do barwienia FACS krew powinna zostać dwukrotnie poddana lizie w buforze ACK.

Normalizacja krwi = HI_tkanka/ HI_krew

5. Reprezentatywne wyniki

Myszy biorców (Thy1.1⁺) uśmiercono 18h po iniekcji komórek. Przygotowano zawiesiny komórkowe ze śledziony, obwodowych węzłów chłonnych (PLN), krezkowych węzłów chłonnych (MLN) oraz blaszki właściwej (LP) jelita cienkiego. Następnie komórki barwiono pod kątem Thy1.2 i CD8, a następnie analizowano metodą FACS, wyznaczając bramkę dla żywych komórek Thy1.2⁺CD8⁺; ostatecznie przeanalizowano stosunek komórek CMTMR⁺ (limfocyty T tropistyczne do jelit) do komórek CFSE⁺ (kontrolne limfocyty T), podzielony przez stosunek wejściowy. Wyniki można przedstawić tak, jak pokazano na Ryc. 2, gdzie widać, że limfocyty T tropistyczne do jelit oraz kontrolne limfocyty T migrowały w równym stopniu do śledziony (HI bliskie 1, zaznaczone czerwoną linią). Z kolei limfocyty T tropistyczne do jelit migrowały do LP około 10 razy efektywniej w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T.

Rycina 1: Schemat przedstawiający generowanie i znakowanie limfocytów T tropistycznych do jelit oraz nietropistycznych do jelit. Limfocyty T są izolowane od myszy typu dzikiego i aktywowane przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 w obecności lub w nieobecności 100-200 nM all-Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. kwas retinowy (RA). Po 4–5 dniach limfocyty T traktowane RA wykazują ekspresję receptorów homingu do jelit CCR9 oraz $\alpha$4$\beta$7. Następnie limfocyty T tropiczne do jelit oraz kontrolne są różnicowo znakowane CFSE lub CMTMR, przemywane, mieszane w stosunku 1:1 i wstrzykiwane biorczej myszy do żyły ogonowej. Część znakowanych komórek wykorzystuje się do określenia początkowego stosunku CFSE/CMTMR (powinien być on bliski 1).

Rysunek 2: Przykład analizy homingu. Myszy analizowano 12-18 h po wstrzyknięciu limfocytów T, a następnie uzyskano zawiesiny pojedynczych komórek z wybranych organów. Komórki barwiono przeciwciałami anty-Thy1.2 (marker kongeniczny) oraz anty-CD8, a następnie za pomocą FACS analizowano stosunek komórek CMTMR⁺ do CFSE⁺ wśród limfocytów T Thy1.2⁺CD8⁺ w każdej tkance. Stosunki CMTMR/CFSE w tkankach znormalizowano następnie względem stosunku CMTMR/CFSE w materiale wyjściowym (Input), aby uzyskać indeksy homingu (HI). W tym przykładzie komórki CMTMR⁺ są komórkami tropnymi do jelit, a komórki CFSE⁺ stanowią kontrolne efektorowe limfocyty T.

Dyskusja

Mimo że eksperymenty z homingiem dostarczają bardzo cennych informacji na temat migracji całkowitych populacji komórek w danej tkance, należy pamiętać, że analizy te nie badają bezpośrednio adhezji do śródbłonka, a zatem nie pozwalają rozróżnić, w których etapach wielostopniowej kaskady adhezyjnej (tethering/toczenie, aktywacja lub przyleganie) działa dany receptor homingu. Złotym standardem w określaniu specyficznej roli receptorów homingu w kaskadzie adhezyjnej jest mikroskopia wewnątrzżyciowa (IVM), w której bezpośred...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zwierzęta: C57BL/6Myszy są powszechnie wykorzystywane do izolacji limfocytów T. Ponadto, szczepy kongeniczne CD45.1 i Thy1.1 są dostępne w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Pożywki hodowlane: IMDM (Iscove’zmodyfikowane podłoże Dulbecco’pożywka Medium + L-glutamina + Hepes) oraz 10% inaktywowane termicznie FBS (płodowa surowica bydlęca, niska zawartość endotoksyn, Gibco)®, Invitrogen, Carlsbad, CA) uzupełnione o 100 J/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0,5 mg/ml fungizone/amfoterycyny B (Gibco) oraz 50 mM $\beta$-merkaptoetanolu–etanol
bufor do lizy erytrocytów ACK(RBC, 10 mM KHCO3)3, 150 mM NH4Cl4Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), doprowadzić do pH 7,2-7,4 i przechowywać w temperaturze pokojowej).
PBS (bufor solny fosforanowy, Hyclone, Waltham, MA).
Pożywki do cytometrii przepływowej (FACS)(PBS lub IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Podczas barwienia z użyciem chimer Selectin-Fc należy stosować medium z 2 mM Ca++ należy stosować we wszystkich etapach (w tym podczas akwizycji FACS). W tym przypadku zaleca się stosowanie pożywki IMDM.
Znakowanie limfocytów T i transfer adopcyjny: CFSE(diacetylofluoresceina karboksylowa, ester sukcynimidy), CMTMR ((5-(i-6)-(((4-chlorometylo)benzoylo)amino) tetrametylorodamina) od Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). Roztwory stokowe 1000x należy przygotować w DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) i przechowywano w temperaturze -20°C.
Poliklonalna aktywacja limfocytów Tpłytki 24-dołkowe lub 96-dołkowe (przeznaczone do hodowli tkankowej, polistyrenowe, z płaskim dnem i pokrywką, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze 37°C z 50 ml PBS, odpowiednio zawierając przeciwciała anty-CD3 oraz anty-CD28 (po 10 mg/ml każdego). Następnie płytki hodowlane płucze się dwukrotnie PBS i niezwłocznie wykorzystuje do hodowli limfocytów T. Alternatywnie, do aktywacji limfocytów T zamiast przeciwciał związanych z płytką można zastosować Dynabeads pokryte przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Barwienie do cytometrii przepływowej (FACS): Aktywacja poliklonalna: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). przeciwciało monoklonalne (mAb) linii komórkowej: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Receptory kierujące do jelit: oczyszczone CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), kontrolka izotypowa (IgG2a, k). Receptory homingu do skóry: P-selectyna-Fc (oczyszczone białko fuzyjne P-selektyny mysiej z IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selektyna-Fc (rekombinowana chimera mysiej E-selektyny/Fc, R)&R&D Systems, Minneapolis, MN) oraz odpowiadający mu odczynnik wtórny fragment F(ab')2 kozie’)2 anty-ludzkie IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Wszystkie-Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. kwas retinowy(Sigma, St. Louis, MO) resuspensuje się w bezwodnym etanolu lub DMSO, używając żółtej żarówki lub pośredniego źródła światła podczas przygotowania. Alikwoty należy przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -80°C oraz przez cały czas chronione przed światłem. Syntetyczne agoniści RAR: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).