Konkurencyjne testy naprowadzające do badania migracji limfocytów T tropowych jelit

Summary

Konkurencyjne eksperymenty z naprowadzaniem pozwalają bezpośrednio ocenić właściwości migracyjne dwóch różnych populacji komórek w jednej myszy. Tutaj ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację jelitowych tropikalnych komórek T generowanych ex vivo i niejelitowych.

Abstract

Aby móc pełnić swoją funkcję, limfocyty muszą opuścić krew i migrować do różnych tkanek w ciele. Adhezja limfocytów do komórek śródbłonka i wynaczynienie tkanek jest procesem wieloetapowym kontrolowanym przez różne cząsteczki adhezyjne (receptory naprowadzające) ulegające ekspresji na limfocytach i ich odpowiednich ligandach (adresinach) wyświetlanych na komórkach śródbłonka ^{1, 2}. Mimo że funkcja tych receptorów adhezyjnych może być częściowo badana ex vivo, ostatecznym testem ich fizjologicznego znaczenia jest ocena ich roli podczas adhezji i migracji limfocytów in vivo. W tym celu zastosowano dwie uzupełniające się strategie: mikroskopię przyżyciową (IVM) i eksperymenty z naprowadzaniem. Chociaż IVM było niezbędne do określenia dokładnego udziału określonych receptorów adhezyjnych podczas kaskady adhezji w czasie rzeczywistym i w różnych tkankach, IVM jest czasochłonne i pracochłonne, często wymaga opracowania wyrafinowanych technik chirurgicznych, wymaga wcześniejszej izolacji jednorodnych populacji komórek i pozwala na analizę tylko jednej tkanki/narządu w danym momencie. W przeciwieństwie do tego, konkurencyjne eksperymenty naprowadzania pozwalają na bezpośrednie i jednoczesne porównanie migracji dwóch (lub nawet więcej) podzbiorów komórek u tej samej myszy, a także pozwalają na analizę wielu tkanek i dużej liczby komórek w tym samym eksperymencie.

Tutaj opisujemy klasyczny protokół konkurencyjnego naprowadzania używany do określenia zalet/wad danego typu komórki do zadomowienia określonych tkanek w porównaniu z populacją komórek kontrolnych. Zdecydowaliśmy się zilustrować właściwości migracyjne limfocytów T tropikalnych i nietropikalnych, ponieważ błona śluzowa jelit jest największą powierzchnią ciała stykającą się ze środowiskiem zewnętrznym, a także jest to tkanka pozalimfatyczna o najlepiej zdefiniowanych wymaganiach migracyjnych. Co więcej, ostatnie prace wykazały, że metabolit witaminy A kwasu all-trans-retinowego (RA) jest głównym mechanizmem molekularnym odpowiedzialnym za indukowanie specyficznych dla jelit receptorów adhezyjnych (integryny a4b7 i receptora chemokiny CCR9) na limfocytach. W ten sposób możemy łatwo wygenerować dużą liczbę limfocytów tropikalnych i nietropikalnych ex vivopoprzez aktywację limfocytów T odpowiednio w obecności lub braku RZS, które można ostatecznie wykorzystać w opisanych tutaj konkurencyjnych eksperymentach naprowadzających.

Protocol

1. Generacja ex vivo limfocytów T naprowadzających się i kontrolujących jelita (patrz Rysunek 1)

1. Wyizoluj splenocyty, zacierając jedną śledzionę od myszy typu dzikiego. Zawiesić zawiesinę komórek w PBS i odwirować przez 5' przy 400 x g. Usunąć supernatant i poddać lizie czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad komórkowy w 4 ml buforu do lizy ACK na 2-3 minuty. Następnie dodaj 5 ml PBS. Wirować przez 5' przy 400 x g i usunąć supernatant.
2. Zawiesić całkowitą splenocytę w 1 x 10⁶/ml w IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-merkaptoetanol + penicylina/streptomycyna (pełne IMDM). Rozdziel komórki na dwie grupy, z których jedna jest uzupełni....

Discussion

Mimo że eksperymenty z naprowadzaniem dostarczają bardzo cennych informacji na temat migracji całkowitych populacji komórek w danej tkance, należy pamiętać, że testy te nie analizują bezpośrednio adhezji śródbłonka, a zatem nie rozróżniają, na którym etapie (krokach) wieloetapowej kaskady adhezji (wiązanie/toczenie, aktywacja lub sklejanie) działa dany receptor naprowadzający. Złotym standardem określającym specyficzną rolę receptorów naprowadzających w kaskadzie adhezyjnej jest mikroskopia przyżyciowa (IVM), w której po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zwierzęta: C57BL/6myszy są powszechnie używane do izolacji limfocytów T. Ponadto szczepy kongeniczne CD45.1 i Thy1.1 są dostępne w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco" s Medium + L-Glutamina + Hepes) plus 10% inaktywowany termicznie FBS (Surowica bydlęca płodu, niska endotoksyna, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) uzupełnione 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny (HyClone Antybiotyki, Waltham, MA), 0,5 mg/ml fungizone/amfoterycyna B (Gibco) i 50 mM b-mercapt– tanolu.
ACK Bufor do lizy czerwonych krwinek(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), dostosuj do pH 7,2-7,4 i przechowuj w temperaturze pokojowej).
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, hyklon, Waltham, MA).
Cytometria przepływowa (FACS) media(PBS lub IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). W przypadku barwienia za pomocą chimer Selectin-Fc należy stosować pożywki z 2 mM Ca++ na wszystkich etapach (w tym akwizycji FACS). W takim przypadku zalecany jest IMDM.
Znakowanie limfocytów T i transfer adoptywny: CFSE(dioctan karboksyfluoresceiny, ester sukcynimidylu), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoil)amino) tetrametylorodamina) z Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x kolby powinny być wykonane w DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) i przechowywane w temperaturze -20°C.
Aktywacja poliklonalnych limfocytów T: 24-dołkowe lub 96-dołkowe płytki (kultura tkankowa, polistyren, płaskie dno z pokrywką, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) są inkubowane przez 2 godziny w temperaturze 37° C z odpowiednio 50 ml PBS zawierającymi przeciwciała anty-CD3 i anty-CD28 (po 10 mg/ml). Następnie płytki hodowlane są dwukrotnie myte PBS i natychmiast wykorzystywane do hodowli limfocytów T. Alternatywnie, Dynabeads pokryte anty-CD3 / anty-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) mogą być używane do aktywacji limfocytów T zamiast przeciwciał związanych z płytką.
barwienie cytometrią przepływową (FACS): Aktywacja poliklonalna: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Linia mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1,2 (CD90,2/53-1,2), CD45,2 (104). Receptory naprowadzające jelita: oczyszczone CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), kontrolne izotypy (IgG2a, k). Receptory naprowadzające się na skórę: P-selectin-Fc (oczyszczona mysia selektyna P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Rekombinowana mysia E-Selectin/Fc Chimera, R& D Systems, Minneapolis, MN) plus odpowiadający mu odczynnik wtórny koza F(ab')2 anty-ludzkie IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans kwas retinowy(Sigma, St. Louis, MO)jest ponownie zawieszany w absolutnym etanolu lub DMSO za pomocą żółtej żarówki lub pośredniego źródła światła podczas przygotowania. Przechowywać porcje w szklanych fiolkach w temperaturze -80° C i przez cały czas chroniony przed światłem. Syntetyczni agoniści RAR: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).