Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.

Streszczenie

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek w określonej objętości zawiesiny komórkowej jest niezbędna przy wielu rutynowych manipulacjach w hodowlach tkankowych, takich jak wysiew komórek do immunocytochemii lub transfekcji. Niniejszy protokół opisuje prostą i szybką metodę różnicowania komórek żywych od martwych oraz określania stężenia komórek i ich całkowitej liczby przy użyciu komory licznikowej (hemacytometru). Procedura ta wymaga w pierwszej kolejności odseparowania komórek od powierzchni wzrostu i ponownego zawieszenia ich w medium. Następnie komórki rozcieńcza się w roztworze błękitu Trypanu (najlepiej do stężenia dającego 20-50 komórek na kwadrat) i nanosi do komory licznikowej. Na koniec, poprzez wyciągnięcie średniej z liczby żywych komórek w kilku losowo wybranych kwadratach, podzielenie tej średniej przez objętość jednego kwadratu o powierzchni 1 mm² (0,1 μl) i pomnożenie przez czynnik rozcieńczenia, otrzymuje się liczbę komórek na l. Pomnożenie tego stężenia komórek przez całkowitą objętość w μl pozwala wyznaczyć całkowitą liczbę komórek. Protokół ten opisuje liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), ale można go zastosować również do wielu innych typów komórek.

Protokół

Pasażowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów

Uwaga: W celu uzyskania informacji na temat odrywania i resuspensji komórek należy zapoznać się z artykułem Passaging Human Neural Stem Cells. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Przygotowanie zawiesiny komórkowej do liczenia

1. Do probówki typu Eppendorf wlać 25 µl 0,4% roztworu błękitu trypanowego oraz 20 µl pożywki komórkowej.
2. Resuspendować komórki przeznaczone do zliczenia, delikatnie stukując probówkę z komórkami znajdującymi się w znanej objętości pożywki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Do probówki typu Eppendorf z poprzedniego kroku przenieść 5 µl zawiesiny komórkowej. Ten etap pozwala na rozcieńczenie stężenia komórek dziesięciokrotnie.
3. Umieścić szkiełko nakrywkę na hemocytometrze i nanieść około 11-12 µl zawiesiny komórkowej.
   
   
   
   

Zliczanie komórek w hemocytometrze

1. Przejrzyj całą siatkę komory countingową (hemacytometru) pod mikroskopem fazokontrastowym. Skup się na jednym kwadracie siatki (np. zaznaczonym na czerwono).
   
   
   
   
2. Martwe lub obumierające komórki będą miały niebieski kolor, ponieważ ich błony zostały uszkodzone i nie są w stanie wykluczyć barwnika Trypan blue. Komórki żywe nie będą niebieskie i w kontraście fazowym będą otoczone jasną „aureolą” (będą „fazowo jasne”).
3. Policz liczbę żywych komórek w jednym kwadracie (obszar 1 mm²). Żywotność komórek można również określić, dzieląc liczbę komórek żywych przez całkowitą liczbę komórek. Policz komórki w 3-4 losowych kwadratach i wyznacz średnią liczbę komórek na kwadrat. Ponieważ objętość kwadratu wynosi 10^-4 ml lub 0,1 µl, można wyznaczyć stężenie komórek
   
   
   
   
   
   
4. Można skorzystać z poniższego uproszczenia w celu wyznaczenia liczby komórek/µl:
   
   
   
   Całkowita liczba komórek w probówce = liczba komórek/µl X µl w probówce

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje prosty i szybki sposób określania stężenia komórek dla różnych eksperymentów z wykorzystaniem komórek. Stosując metodę skróconą opisaną w punkcie 3d, można szybko i precyzyjnie wyznaczyć stężenie komórek oraz całkowitą liczbę komórek w danej objętości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hemacytometr do kontrastu fazowego	Narzędzie	Hausser Scientific	02-671-54	Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym
Barwnik Trypan Blue 0,4%	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	Dystrybuowane przez Invitrogen pod wskazanym numerem katalogowym