Zliczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Summary

Znajomość dokładnej liczby żywotnych komórek jest wymagana do wielu manipulacji kulturami tkankowymi. Protokół ten opisuje, jak rozróżniać żywe i martwe komórki oraz określać ilościowo komórki za pomocą hemacytometru. Chociaż opisuje zliczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPC), może być stosowany do innych typów komórek.

Abstract

Znajomość dokładnej liczby żywotnych komórek w danej objętości zawiesiny komórkowej jest wymagana do wielu rutynowych manipulacji hodowlą tkankową, takich jak posiewanie komórek do immunocytochemii lub do transfekcji komórek. Protokół ten opisuje prostą i szybką metodę rozróżniania żywych i martwych komórek oraz ilościowego określania stężenia komórek i całkowitej liczby komórek za pomocą hemacytometru. Ta procedura wymaga najpierw oderwania komórek od powierzchni wzrostu i ponownego zawieszenia ich w pożywce. Następnie komórki rozcieńcza się w roztworze błękitu trypanowego (najlepiej do stężenia, które da 20-50 komórek na kwadrant) i umieszcza w hemytometrze. Na koniec, uśredniając liczbę żywotnych komórek w kilku losowo wybranych kwadrantach, dzieląc średnią przez objętość jednego kwadrantu 1 mm² (0,1 μl) i mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia, otrzymujemy liczbę komórek na l. Pomnożenie tego stężenia komórek przez całkowitą objętość w μl daje całkowitą liczbę komórek. Protokół ten opisuje zliczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPC), ale może być również stosowany do wielu innych typów komórek.

Protocol

Przenikanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Uwaga: Proszę zapoznać się z artykułem Przenikanie ludzkich neuronowych komórek macierzystych artykule na temat odłączania i ponownego zawieszania komórek. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Przygotowanie zawiesiny komórek do liczenia

.

1. Umieścić 25 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego i 20 μl pożywki komórkowej w probówce eppendorfa.
2. Ponownie zawiesić komórki, które mają być policzone, delikatnie stukając w probówkę zawierającą komórki w znanej objętości pożywki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Umieścić 5 μl komórek w probówce eppendorfa z poprzedniego kroku. Ten krok rozcieńcza stężenie komórek o współczynnik 10.
3. Umieść szkło nakrywkowe na hemacytometrze i załaduj około 11-12 μl zawiesiny komórek.
   
   
   
   

Liczenie komórek w hemacytometrze

1. Obserwuj całą siatkę hemacytometru w mikroskopie z kontrastem fazowym. Skoncentruj się na jednym kwadrancie siatki (takim jak ten na czerwono).
   
   
   
   
2. Martwe lub umierające komórki będą wyglądać na niebieskie, ponieważ ich błona została uszkodzona i nie są w stanie wykluczyć niebieskiego barwnika trypanowego. Żywe komórki nie będą wyglądały na niebieskie i będą otoczone "aureolą" światła w kontraście fazowym (będą "jasne w fazie").
3. Policz liczbę żywotnych komórek w jednym kwadrancie (pole 1 mm²). Możesz również określić żywotność komórek, dzieląc liczbę żywotnych komórek przez całkowitą liczbę komórek. Policz komórki w 3-4 losowych kwadrantach i określ średnią liczbę komórek w kwadrancie. Ponieważ wiadomo, że objętość kwadrantu wynosi ^10-4 ml lub 0,1 μl, stężenie komórek można określić
   
   
   
   
   
   
4. Możesz użyć następującego skrótu, aby określić #cells/μl:
   
   
   
   Total # komórek w probówce =# komórek/μl X μl w probówce

Discussion

Protokół ten opisuje prosty i szybki sposób określania stężenia komórek w różnych eksperymentach z udziałem komórek. Za pomocą skrótu opisanego w 3d można szybko i dokładnie określić stężenie komórek i całkowitą liczbę komórek w danej objętości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Narzędzie do hemektometru z kontrastem fazowym		Hausser Scientific	02-671-54	Dystrybuowane przez firmę Fisher we wskazanym katalogu #
Trypan Blue Stain 0,4%	Odczynnik	GIBCO, firmy Life Technologies	15250-061	Dystrybuowane przez Invitrogen we wskazanym katalogu #