Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza immunohistochemiczna całego preparatu (whole-mount) w celu obrazowania całego układu naczyniowego jest kluczowa dla zrozumienia komórkowych mechanizmów morfogenezy rozgałęziania. Opracowaliśmy model unaczynienia skóry kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący wcześniej prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całego preparatu z wielokrotnym znakowaniem umożliwia precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych oraz ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, perycytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniach nad tym modelem unaczynienia skóry kończyny, w połączeniu z badaniami genetycznymi, pozwoliły na lepsze zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorowania naczyń. Model unaczynienia skóry kończyny został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób nerwy obwodowe stanowią przestrzenną matrycę dla różnicowania i wzorowania tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych za pomocą przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów zarodkowych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.
Protokół
1. Pobieranie skóry kończyn zarodka myszy (E13.5~E17.5)
- Uśmierć zapłodnione samice zgodnie z zatwierdzoną procedurą. Zgodnie z naszym zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt, samice są uśmiercane poprzez ekspozycję na CO2, a następnie poddawane zwichnięciu szyi w celu potwierdzenia zgonu. Połóż zwierzę na chłonnym ręczniku papierowym i dokładnie nasącz je 70% EtOH/H2O z butelki z dozownikiem.
- Wypreparuj macicę w całości i umieść ją w szalce Petriego 100 x 15 mm zawierającej lodowaty zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby wypłukać krew.
- Oddziel i wypreparuj zarodek. Usuń bardzo cienką błonę owodni z zarodka.
- (Opcjonalnie) Wypreparuj pojedynczy zarodek w szalce Petriego 35 x 10 mm, jeśli każdy zarodek wymaga genotypowania. Wypreparowany ogon przenosi się do probówki PCR 0,2 ml w celu genotypowania.
- Odetnij kończyny przednie zarodka i przenieś je pęsetą pierścieniową do płytki 24-dołkowej zawierającej 2 ml lodowatego, świeżego 4% Paraformaldehydu (PFA) w buforze fosforanowym (PBS).
- Utrwal kończyny przednie przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze 4°C przez noc.
- Następnego dnia usuń PFA i przemyj trzy razy przez 5 min w 2 ml PBS przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.
- Przenieś kończyny przednie do 100% metanolu (MeOH) i przechowuj je w zamrażarce do enzymów w temperaturze -20°C (zamrażarka z krytyczną kontrolą temperatury i bez funkcji automatycznego rozmrażania). Przeciwciała pierwszorzędowe wymienione w Tabeli 1 działają po traktowaniu 100% MeOH.
- Zdejmij skórę z kończyny przedniej za pomocą precyzyjnej pęsety. Skóra kończyny po odwodnieniu powinna łatwo oddzielać się od kończyny. Najpierw połóż kończynę stroną brzuszną (stroną dłoniową) do góry. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, przetnij skórę tak, jak pokazano w filmie. Następnie wypreparuj obszar wokół całej kończyny, delikatnie zdejmując skórę bezyżniejszego uszkadzania tkanki.
2. Barwienie immunohistochemiczne całych preparatów skóry kończyn
- Rehydratyzuj skóry kończyn w 5ml polipropylenowej probówce z okrągłym dnem, inkubując je w gradacyjnej serii MeOH/PBT (PBS + 0,2%Triton X-100) (75%, 50%, 25%) przez 5 min w każdym etapie. Należy pamiętać, aby wymiana roztworów odbywała się ostrożnie, by uniknąć uszkodzenia skór kończyn.
- Przemyj dwa razy przez 5 min w PBT przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.
- Zablokuj skóry kończyn, używając albo buforu blokującego 10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 (dla przeciwciał wtórnych kozich), albo buforu blokującego 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100 (dla przeciwciał wtórnych osła), przez 2 godziny przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.
- Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do probówki do mikrowirówki 2ml zawierającej 800μl przeciwciał pierwszorzędowych (w odpowiednim rozcieńczeniu, zgodnie z listą w tabelach) w buforze blokującym (10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Inkubuj skóry kończyn przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w 4°C przez noc. Należy pamiętać, że można jednocześnie stosować wiele przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od różnych gatunków (np. monoklonalne przeciwciało szczurze + poliklonalne przeciwciało królicze).
- Następnego dnia umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do 5ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100).
- Przemyj pięć razy przez 15 min przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.
- Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do probówki do mikrowirówki 2ml zawierającej 800μl przeciwciał wtórnych w buforze blokującym (10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Zazwyczaj stosujemy przeciwciała wtórne firmy Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, rozcieńczenia 1:300) lub Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, rozcieńczenie 1:250). Przefiltruj roztwór przeciwciał wtórnych za pomocą filtrów strzykawkowych z membraną PVDF 0,22μm, aby usunąć zagregowane cząsteczki przeciwciał wtórnych. Inkubuj skóry kończyn w ciemności lub owinięte folią aluminiową przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że można jednocześnie stosować różne koniugaty fluorescencyjne przeciwciał wtórnych pochodzących od różnych gatunków.
- Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do 5ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Przemyj pięć razy przez 15 min w ciemności lub owinięte folią aluminiową przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.
- (Opcja barwienia przeciwjądrowego) Inkubuj skóry kończyn w 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100) z To-Pro-3 (Invitrogen T3605, rozcieńczenie 1:3000) w ciemności lub owinięte folią aluminiową przez 10 min przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj trzy razy przez 5 min w 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100) w ciemności lub owinięte folią aluminiową przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że dla To-pro-3 obserwuje się silne i specyficzne barwienie jąder w określonej emisji (pobudzenie HeNe 633 nm).
3. Montowanie preparatów skóry kończyn na szkiełku
- Umieścić skóry kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Za pomocą precyzyjnej pęsety pod stereomikroskopem z niskim oświetleniem, aby uniknąć intensywnego fotoblaknięcia, usunąć z wewnętrznej warstwy skór pył, kryształki oraz włókna.
- Przenieść skóry kończyn na przylepne szkiełko mikroskopowe za pomocą kleszczyków pierścieniowych. Umieścić skóry na szkiełku wewnętrzną warstwą skierowaną do góry (tj. w stronę szkiełka nakrywkowego). Ostrożnie rozpłaszczyć skóry precyzyjną pęsetą i usunąć resztki buforu płuczącego za pomocą chusteczki Kimwipe.
- Zamontować w medium montażowym typu anti-fade, dbając o brak pęcherzyków powietrza. Stosujemy szkiełka nakrywkowe o wymiarach 25"x25". Utwardzić na płaskiej powierzchni w ciemności (np. próbki zamontowane przy użyciu odczynnika ProLong Gold pozostawia się na noc w ciemności w temperaturze pokojowej przed obserwacją). Do długoterminowego przechowywania należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym i przechowywać w temperaturze 4°C.
4. Mikroskopia konfokalna
- Skonfiguruj odpowiednie lasery dla fluoroforów. Używamy konfokalnego mikroskopu Leica TCS SP5 z trzema źródłami laserowymi, w tym Argon 488nm (dla Alexa Fluor 488 i GFP), DPSS 561nm (dla Alexa Fluor 568 i Cy3) oraz HeNe 633nm (dla Alexa Fluor 633, Cy5 i To-Pro-3).
- Użyj narzędzia skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć lub ograniczyć przesłuchy (crosstalk), przy których wszystkie barwniki w próbkach barwionych podwójnie lub potrójnie byłyby wzbudzane jednocześnie. W trybie skanowania sekwencyjnego obrazy będą rejestrowane w kolejności następującej po sobie.
- Bardziej ogólne informacje na temat barwników fluorescencyjnych i laserów do wzbudzania można znaleźć w publikacji „Confocal Microscopy for Biologists” autorstwa Hibbsa (2004).
5. Reprezentatywne wyniki
Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna z potrójnym znakowaniem całych preparatów skóry przedniej kończyny myszy w stadium E15.5 z użyciem przeciwciał przeciwko pan-endotelialnemu markerowi komórek PECAM-1 (Rycina 1A-C, D niebieski), markerowi neurofilamentów 2H3 (Rycina 1A zielony) oraz markerowi komórek mięśni gładkich αSMA (Rycina 1A, B czerwony) ujawniła charakterystyczny wzór rozgałęzień tętnic αSMA+, przebiegających równolegle do obwodowych nerwów 2H3+ w skórze kończyny. Poza rozgałęzianiem naczyń krwionośnych, ten model unaczynienia skóry kończyny jest wykorzystywany do badania wzorców rozgałęziania naczyń limfatycznych przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom endotelialnym komórek limfatycznych LYVE-1 (Rycina 1D, E czerwony) oraz Neuropilinie 2 (NRP2) (Rycina 1D, F zielony).
Rysunek 1. (A-C) Tętnice przebiegają równolegle do nerwów obwodowych w skórze kończyny zarodka. Przedstawiono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną z potrójnym znakowaniem całego preparatu przy użyciu przeciwciał przeciwko panendotelialnemu markerowi PECAM-1 (A-C, niebieski), markerowi neurofilamentów 2H3 (A, zielony) oraz markerowi komórek mięśni gładkich αSMA (A i B, czerwony). W stadium E15.5 nerwy obwodowe 2H3+ (otwarte strzałki) towarzyszą tętnicom (groty strzałek), które są pokryte komórkami mięśni gładkich αSMA+ . (D-F) Układ naczyń limfatycznych w skórze kończyny zarodka. Przedstawiono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną z potrójnym znakowaniem przy użyciu przeciwciał przeciwko panendotelialnemu markerowi PECAM-1 (D, niebieski), markerowi limfatycznych komórek śródbłonka LYVE-1 (D i E, czerwony) oraz Neuropilinie 2 (NRP2) (D i F, zielony). Naczynia limfatyczne są wizualizowane zarówno za pomocą LYVE-1, jak i NRP2, podczas gdy LYVE-1 jest również ekspresjonowany przez podzbiór makrofagów (otwarte groty strzałek). Pasek skali: 100μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Układ naczyniowy jest kluczowy dla rozwoju organów podczas embriogenezy, a także dla utrzymania funkcji narządów i funkcji rozrodczych u osobników dorosłych, ponieważ dostarcza on organom niezbędny tlen i składniki odżywcze. Prawidłowa sieć naczyniowa powstaje w wyniku złożonych i wieloetapowych procesów angiogenezy, podczas których istniejąca sieć kapilarna jest reorganizowana w wysoce rozgałęzione struktury hierarchiczne. Chociaż liczne prace wykazały, że w procesach tych zaangażowany jest szereg cząsteczek, nie było j...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy K. Gill za pomoc w hodowli i pielęgnacji myszy oraz za zarządzanie laboratorium. Dziękujemy również członkom laboratorium Mukoyamy za pomoc techniczną. Finansowanie zostało zapewnione przez Intramural Research Program National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
Przeciwciała Marker panendotelialny | ||||
| Przeciwciało | Gatunek | Firma | Nr katalogowy | Warunki pracy |
| PECAM-1 | Chomik armeński (samiec) | Chemicon | MAB1398Z | rozcieńczenie 1:100#1 |
| PECAM-1 | Szczur (samiec) | BD | 553369 | rozcieńczenie 1:300 |
| VEGFR2 | Szczur (samiec) | eBioscience | 14-5821-82 | rozcieńczenie 1:200 |
| CD34 | Szczur (samiec) | eBioscience | 13-0341 | rozcieńczenie 1:300 |
| Kolagen IV | Królik (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | rozcieńczenie 1:300#2 |
Marker komórek śródbłonka tętniczego
Przeciwciało Gatunek Firma Katalog nr Warunki pracy Neuropilina 1 Królik (P) Alex Kolodkin’laboratorium s#3 rozcieńczenie 1:3000 Unc5H2 Koza (P) R&D AF1006 rozcieńczenie 1:200Marker komórek śródbłonka żylnego
Przeciwciało Gatunki Firma Katalog nr Warunki pracy EphB4 Kozia (P) R&D AF446 roztwór 1:100Marker komórek śródbłonka limfatycznego
Przeciwciało Gatunek Firma Numer katalogowy Warunki pracy LYVE-1#4 Królik (P) Abcam ab14917 rozcieńczenie 1:200 LYVE-1#4 Szczur (samiec) MBL D225-3 roztwór 1:200 Prox-1 Królik (P) Chemicon AB5475 rozcieńczenie 1:1000 Prox-1 Koza (P) R&D AF2727 rozcieńczenie 1:50 Neuropilina-2 Królik (P) Sygnalizacja komórkowa 3366 rozcieńczenie 1:100 Podoplanina Chomik syryjski (samiec) Bank Hybrydomów 8.1.1 rozcieńczenie 1:200Marker komórek mięśni gładkich/perycytów
Przeciwciało Gatunki Firma Katalog nr Warunki pracy αSMA-Cy3 Mysz (M)#5 Sigma c-6198 rozcieńczenie 1:500#6 NG2 Królik (P) Chemicon AB5320 rozcieńczenie 1:200 SM22α Królik (P) Abcam ab14106 rozcieńczenie 1:200Przeciwciała przeciwkoGFP reporter
Przeciwciało Gatunek Firma Katalog nr Warunki pracy GFP Królik (P) Invitrogen A11122 rozcieńczenie 1:300 GFP Szczur (samiec) Nacalai Tesque 04404-84 rozcieńczenie 1:1000 GFP Kurczę (P) Chemicon P42212 rozcieńczenie 1:300Przeciwciała przeciwko LacZ reporter
Przeciwciało Gatunek Firma Nr katalogowy Warunki pracy β-gal Królik (P) MP Biomedical 55976 rozcieńczenie 1:5000 β-gal Koza (P) AbD Serotec 4600-1409 rozcieńczenie 1:500 β-gal Kurczę (P) Abcam ab9361 rozcieńczenie 1:200Przeciwciała przeciwko aksonom obwodowym
Przeciwciało Gatunek Firma Nr katalogowy Warunki pracy 2H3 Mysz (M)#7 Bank Hybridomów 2H3 rozcieńczenie 1:200 Tuj1 Mysz (M)#8 Covance MMS-435P rozcieńczenie 1:500 peryferyna Królik (P) Chemicon AB1530 rozcieńczenie 1:1000Przeciwciała przeciwko migrującym komórkom Schwanna
BFABP Królik (P) The Thomas Mükomórka’laboratorium#9 rozcieńczenie 1:3000#1: W качестве przeciwciała wtórnego należy zastosować przeciwciało kozie anty-chochoł syryjski-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160).
#2: Przeciwciało przeciwko kolagenowi IV może być stosowane do wykrywania naczyń krwionośnych po in situ hybrydyzacja.
#3: Przeciwciało Neuropilin1 zostało uprzejmie udostępnione przez Alexa Kolodkina’laboratorium na Uniwersytecie Johns Hopkins. Przeciwciało owcze przeciwko ludzkiej neuropilinie 1 jest dostępne w R&D (AF3870), choć jeszcze go nie przetestowaliśmy.
#6: Przeciwciało sprzężone z Cy3 αPrzeciwciało SMA inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej wraz z przeciwciałami wtórnymi do pozostałych przeciwciał pierwszorzędowych.
#7: Przeciwciało 2H3 to monoklonalne przeciwciało mysie z klasy IgG1 skierowane przeciwko neurofilamentom.
#8: Przeciwciało Tuj1 to mysia monoklonalna przeciwciało IgG2a przeciwko neuronowej beta-tubulinie klasy III.
#9: Przeciwciało BFABP (białko wiążące kwasy tłuszczowe specyficzne dla mózgu) zostało uprzejmie udostępnione przez Thomasa Müller’laboratorium w Max-Delbrück-Centrum Medycyny Molekularnej.
Bibliografia
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
