Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Podsumowanie

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Streszczenie

Informacje genetyczne zakodowane w DNA są zorganizowane w złożoną i ściśle regulowaną strukturę chromatyny. Każdy chromosom zajmuje określony obszar, który może ulegać zmianom w zależności od stadium rozwoju lub cyklu komórkowego. Ekspresja genów może zachodzić w wyspecjalizowanych fabrykach transkrypcyjnych, w których segmenty chromatyny mogą tworzyć pętle wychodzące z różnych terytoriów chromosomowych, co prowadzi do ko-lokalizacji fragmentów DNA, które mogą znajdować się na różnych chromosomach lub w dużej odległości na tym samym chromosomie. Metoda Associated Chromosome Trap (ACT) zapewnia skuteczną metodologię identyfikacji tych dalekosiężnych powiązań DNA w sposób nieobciążony, poprzez rozszerzenie i modyfikację techniki uchwytywania konformacji chromosomów. Analiza ACT umożliwia badanie mechanizmów regulacji transkrypcyjnej w trans i może pomóc w wyjaśnieniu związku między architekturą jądra a ekspresją genów w fizjologii prawidłowej oraz w stanach chorobowych.

Protokół

1. Fixacja formaldehydem oddziaływań chromatyny dalekiego zasięgu

1. Hodować ludzką linię komórkową HL-60 w pożywce RPMI1640 z 15% FBS i 1 x penicyliną/streptomycyną do osiągnięcia 80-90% konfluencji w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Zebrać komórki do probówki Nunc 50 ml, odwirować przy 1,200 rpm przez 15 minut, a następnie usunąć pożywkę za pomocą aspiratora.
3. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej, aby resuspender osad komórkowy, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odmierzyć około 1 x 10⁷ komórek do objętości 40 ml w RPMI1640 /10% FBS, a następnie dodać 1,7 ml 37% formaldehydu w celu utrwalenia rozcieńczonej chromatyny.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy delikatnym wstrząsaniu, a następnie zneutralizować reakcję za pomocą 2,4 ml 2M glicyny. Wirować przez 15 minut przy 1,200 rpm w temperaturze 4°C i usunąć nadsącz. Przemyć osad raz 40 ml lodowatego PBS, a następnie odwirować osad i usunąć PBS.

2. Lizy komórek w celu izolacji jąder

1. Resuspendować komórki w 40 ml lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) z dodanymi świeżo inhibitorami proteaz (rozcieńczenie 1:500) i 0.1 mM PMSF. Inkubować w pomieszczeniu chłodniczym w rotacji przez 90 minut, odwirować przy 2,500 rpm przez 15 minut i usunąć nadsącz.

3. Trawienie enzymem restrykcyjnym Bgl II

1. Resuspenduj jądra w 0,5 ml 1 x buforu NEB 3 i dodaj 15 μl 10% SDS. Inkubuj w 37°C przez 1 godzinę przy wytrząsaniu, a następnie dodaj 45 μl 20% Triton X-100 w celu sekwestracji SDS. Inkubuj w 37°C przez 1 godzinę przy wytrząsaniu.
2. Do trawienia enzymem restrykcyjnym wykorzystaj alikwot 1 x 10⁶ jąder (około 15 μg, jedną dziesiątą pierwotnej liczby komórek). Pobierz 55 μl roztworu jąder z kroku 3.1 i uzupełnij objętość do 500 μl, dodając 433 μl 1 x buforu NEB 3 oraz 12 μl Bgl II (50U/ul). Inkubuj w 37°C przez noc.

4. Ligacja oddziałujących fragmentów DNA

1. Dezaktywuj enzym restrykcyjny, dodając 95 μl 10% SDS, a następnie zdenaturuj go poprzez ogrzewanie w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
2. Dodaj 7 ml 1 x buforu do ligacji (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) oraz 360 μl 20% Triton X-100 i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
3. Obniż temperaturę do 16°C i dodaj 50 μl ligazy T4 DNA o stężeniu 400 U/μl. Inkubuj próbkę w temperaturze 16 °C przez 4 godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

5. Oczyszczanie DNA

1. Dodać 300 μg proteinazy K i inkubować w temperaturze 65°C przez noc.
2. Dodać 5 μg RNazy A i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut.
3. Oczyścić DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform i wyprecypitować DNA w izopropanolu. Rozpuścić DNA w 150 μl sterylnej wody destylowanej.

6. Trawienie enzymem Msp I i ligacja z linkerami oligonukleotydowymi

1. Inkubować 2 μg oczyszczonego DNA z 5 jednostkami Msp I w temperaturze 37°C przez 4-6 godzin. Inaktywować Msp I w 65°C przez 10 minut, a następnie wytrącić DNA w etanolu z dodatkiem 1 μl glikogenu o stężeniu 5 mg/ml. Rozpuścić osad DNA w 50 μl sterylnej wody destylowanej.
2. Wymieszać 50 μl DNA traktowanego enzymem Msp I z 2 μl oligonukleotydu linkerowego L o stężeniu 20 μM (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3'), 1 μl oligonukleotydu S o stężeniu 20 μM (5'-cggtgaatc-3'), 1 μl sterylnej wody destylowanej oraz 6 μl 10 x buforu do ligazy DNA T4. Przykryć mieszaninę woskiem ciekłym.
3. Denaturować oligonukleotydy w 50°C przez 1 minutę, a następnie stopniowo schładzać do 10°C z gradientem 0,5°C/minutę w termocyklerze.
4. Dodać 1 μl ligazy DNA T4 o aktywności 400 U/μl i inkubować w 15°C przez noc. Oczyścić DNA z przyłączonym linkerem za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit i eluować w 50 μl sterylnej wody destylowanej.

7. Amplifikacja PCR i analiza sekwencji

1. Wybierz starter dla konkretnego regionu DNA, który chcesz zbadać pod kątem oddziaływań dalekiego zasięgu (tzw. „przynętę”). W tym przykładzie wykorzystujemy ABL-1.
2. Pobierz 1 μl oczyszczonego DNA w celu przeprowadzenia pierwszej rundy PCR, stosując 1 μl 20 μM startera specyficznego dla ABL-1 #4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3'), 1 μl 20 μM startera specyficznego dla linkera #2963 (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3'), 3 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq oraz 3 μl sterylnej wody destylowanej. Przed amplifikacją PCR do 100 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq dodaje się 2 μl ³²P-dCTP. Cykl termiczny dla PCR z gorącym startem (hot start PCR) obejmuje 72°C przez 2 min, 95° C przez 2 minuty; 18 cykli: 95°C przez 20 sekund, 65°C przez 40 sekund i 72°C przez 1 minutę; końcowa elongacja jest przeprowadzana w 72°C przez 5 minut.
3. Oczyść produkty pierwszej rundy PCR za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit i eluuj DNA do 30 μl sterylnej wody destylowanej.
4. Pobierz 1 μl 100-krotnie rozcieńczonego produktu pierwszej reakcji PCR, aby przeprowadzić drugą rundę PCR z użyciem starterów wewnętrznych (nested primers), dodając 1 μl 20 μM startera specyficznego dla ABL-1 #4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3') (Rycyna 1a), 1 μl 20 μM startera specyficznego dla linkera #2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3'), 3 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq oraz 3 μl sterylnej wody destylowanej. Program cykliczny obejmuje 25 cykli: 95°C przez 20 sekund, 67°C przez 40 sekund i 72°C przez 1 minutę, a następnie elongację w 72°C przez 5 minut.
5. Wizualizuj produkty PCR, przeprowadzając elektroforezę na żelu 5% urea-PAGE i skanując naświetlony ekran w urządzeniu PhosphoImager (Rycina 1b). Każdą prążkę PCR można odzyskać z żelu, rozpuszczając paski żelu w probówce Eppendorfa zawierającej 60 μl sterylnej wody destylowanej i inkubując w 95°C przez 5 minut. Wirować krótko przy 10 000 obr./min przez 10 s, aby zebrać wszystkie próbki. Pobierz 1 μl do wykorzystania jako matrycę DNA w celu przeprowadzenia PCR z parą starterów 2961/4626 w tych samych warunkach, które opisano powyżej. Analizę sekwencji można przeprowadzić po oczyszczeniu za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit.
6. Sekwencje DNA analizuje się za pomocą narzędzia online w celu określenia ich lokalizacji chromosomalnej na stronie internetowej: http://genome.ucsc.edu (Rycina 1c). Kliknij „BLAT”, aby przejść do nowego okna, które umożliwia wklejenie sekwencji DNA; po kliknięciu „submit” pojawi się nowe okno prezentujące wyniki wyszukiwania „BLAT Search Results”. Kliknij „browser” przy wyniku o 100% tożsamości, aby przejść do kolejnego okna pokazującego lokalizację sekwencji DNA.

8. Reprezentatywne wyniki

1. Analiza ACT z wykorzystaniem regionu ABL-1 jako przynęty w celu określenia jego dalekosiężnych oddziaływań DNA

Jak pokazano na rysunku 1a, do testu ACT wybrano dwa miejsca rozpoznawane przez Bgl II oraz jedno miejsce rozpoznawane przez BamH I. W drugiej rundzie PCR do amplifikacji ABL-M1 wykorzystano zestaw starterów 4626/2961, do ABL-M2 zestaw 4630/2961, a do ABL-M3 zestaw 4636/2961. Typowy obraz żelu wykazuje od jednego do kilku prążków (rysunek 1b). Każdy fragment z testu ACT składa się z dwóch połączonych segmentów DNA: jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, natomiast drugi pochodzi od powiązanego partnera, który został połączony z segmentem regionu przynęty za pomocą pierwszej sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny. Druga sekwencja rozpoznawana przez enzym pojawi się na końcu sekwencji powiązanego partnera (rysunek 1c). Sklonowany fragment ABL-M1 zawiera DNA z regionu ABL1 zlokalizowanego w chromosomie 9q32.4 od +133 592 306 do 133 592 399, a powiązany partner znajduje się w chromosomie 3p13 od +71 869 882 do 71 870 107. Tożsamość powiązanych partnerów ustalono poprzez analizę blast ich sekwencji przy użyciu przeglądarki genomu UCSC (GRCh7/hg19 wydanej w lutym 2009 r.). PROK2 został zidentyfikowany jako powiązany partner w locus chr3p13.

Podobnie, partner powiązany z ABL-M2 zlokalizowano w obrębie chr5q21.1, natomiast klon ABL-M3 zidentyfikowano jako powiązanie wewnątrzchromosomalne w pobliżu locus ABL-1.

2. Określanie rzadszych oddziaływań dalekiego zasięgu za pomocą testu ACT

Inne analizy oparte na metodzie 3C wykazały znacznie więcej partnerów oddziałujących niż te, które przedstawiliśmy na Rysunku 1 oraz w locus Igf2/H19¹². Opisana przez nas metodologia pozwoli na wyselekcjonowanie najpowszechniejszych oddziaływań dalekiego zasięgu. Jednakże, poprzez zwiększenie liczby cykli PCR, możliwe jest zidentyfikowanie również dodatkowych, rzadszych powiązań (Rysunek 2).

3. Różnice w oddziaływaniach dalekiego zasięgu w komórkach nowotworowych w porównaniu z tkankami prawidłowymi.

Analizę ACT można również wykorzystać do identyfikacji różnic w architekturze jądrowej i oddziaływaniach dalekiego zasięgu między komórkami prawidłowymi a komórkami nowotworowymi (Rysunek 3). Różnice te mogą odzwierciedlać zmiany w architekturze jądra zachodzące podczas transformacji komórkowej, w związku z czym analiza ta może w przyszłości znaleźć zastosowanie w celach diagnostycznych. Podobne wzory prążków w żelu, występujące zarówno w tkankach prawidłowych, jak i nowotworowych, wskazują na to, że analiza ACT jest wiarygodna i powtarzalna. Chociaż analiza ACT pozwala na identyfikację dalekosiężnych partnerów DNA, do weryfikacji obecności zidentyfikowanych powiązań między odległymi loci wymagane są dalsze analizy, takie jak testy FISH i ChIP. Następnie można przeprowadzić badania genetyczne, fizjologiczne i biochemiczne, aby wyjaśnić biologiczne znaczenie tych dalekosiężnych asocjacji DNA.

Rysunek 1 Analiza ACT z użyciem regionu ABL-1 jako DNA przynęty w komórkach HL-60. a. Struktura DNA w regionie ABL-1. Pierwszym enzymem restrykcyjnym użytym w analizie ACT był Bgl II. Startery do drugiej rundy PCR są również oznaczone strzałkami i odpowiadającymi im numerami starterów. b. Obraz żelu z analizy ACT w 5% urea-PAGE. Para starterów 4626/2961 została użyta do amplifikacji klonu ABL-M1 w zagnieżdżonej reakcji PCR, 4630/2961 została użyta dla klonu ABL-M2, a 4636/2961 dla klonu ABL-M3. c. Sekwencja DNA klonu ABL-M1. Fragment DNA z DNA przynęty ABL-1 jest zaznaczony na czerwono, a powiązany partner DNA jest zaznaczony na cyjanowo. Miejsce rozpoznawane przez Bgl II (AGACTC) zaznaczono na zielono, a miejsce Msp I (CCGG) na fioletowo.

Rycina 2 Cykle PCR wpływają na wyniki testu ACT. Wykorzystując region kontrolny imprintingowy (ICR) w locus Igf2/H19 jako DNA przynęty w fibroblastach mysich, w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście ACT zastosowano różne programy cykli. 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR nie doprowadziło do amplifikacji sygnału w stopniu umożliwiającym wizualizację. Dwadzieścia pięć cykli w drugim PCR zaowocowało wyraźnymi prążkami, natomiast zwiększenie liczby cykli w drugiej rundzie PCR spowodowało powstanie smug oprócz większej liczby prążków.

Rysunek 3 Wykrywanie różnic w architekturze jądra między prawidłową tkanką jelita grubego a tkanką raka jelita grubego w teście ACT. a. Struktura DNA regionu ICR w locus IGF2/H19 oraz gen IGF2. Oznaczono miejsca Dpn II dla testu ACT. Primery użyte w drugiej rundzie PCR są oznaczone strzałkami i numerami w różnych kolorach, które odpowiadają poszczególnym ścieżkom w panelu b rysunku. b. Wzorzec prążków w teście ACT w 5% urea-PAGE. Prawidłową tkankę jelita grubego MAD03-1423 i tkankę raka jelita grubego MAD04-149 otrzymano z Cooperative Human Tissue Network (CHTN) Western Division. Po homogenizacji każdej z tkanek jelita grubego przeprowadzono test ACT zgodnie z opisanymi tutaj procedurami. Ścieżka 1 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3') zaznaczonej na różowo w panelu a; ścieżka 2 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3') zaznaczonej na pomarańczowo w panelu a; ścieżka 3 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') zaznaczonej na niebiesko w panelu a; ścieżka 4 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3') zaznaczonej na zielono w panelu a. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w prawidłowej tkance jelita grubego, są oznaczone żółtymi strzałkami, a prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego, są oznaczone czerwonymi strzałkami. ICR, region kontroli imprintingu; DMR, region różnicowo zmetylowany.

Dyskusja

Dekker et al. opracowali metodę przechwytywania konformacji chromosomów (3C) w celu wykrywania częstotliwości oddziaływań między dwoma loci genomicznymi¹, a metoda 3C była szeroko stosowana do badania powiązań wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomalnych między dwoma znanymi regionami DNA w komórkach ssaków^2-9. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania powiązań DNA w całym genomie, test ACT pozostaje skuteczną techniką badania oddziaływań DNA specyficznych dla konkretnego locus^10-11. zmodyfikowaliśmy to podejście, aby zidentyfikować nieznane regiony DNA powiązane ze znanym regionem DNA w hodowlach komórek mysich i ludzkich (Rycina 1). Nazwaliśmy tę metodę testem pułapki chromosomów powiązanych (ACT), ponieważ dostarczyła nam ona niezawodnego i powtarzalnego sposobu identyfikacji nowych, nieznanych partnerów DNA, które łączą się ze znanym docelowym regionem DNA¹². Przed zastosowaniem nowatorskich aspektów testu ACT wykonuje się pomyślny test 3C z odpowiednimi kontrolami¹³. Aby znaleźć jak najwięcej powiązanych regionów DNA, konieczne jest zastosowanie różnych kombinacji pierwszej i drugiej nukleazy restrykcyjnej. Szczególnie ważne jest użycie enzymów restrykcyjnych niewrażliwych na metylację CpG do przeprowadzenia pierwszego etapu ligacji 3C. Wiązanie białek i metylacja DNA mogą również wpływać na wydajność trawienia enzymami restrykcyjnymi i mogą prowadzić do niepowodzenia ligacji powiązanych regionów DNA przy niektórych trawieniach enzymatycznych. Wystąpienie ligacji wewnątrz- lub międzychromosomalnej zależy od sieciowania białko-DNA i odpowiednich map fizycznych obu powiązanych regionów DNA. Zatem niezbędne są niektóre wstępne eksperymenty w celu ustalenia praktycznego, skutecznego stężenia formaldehydu i czasu traktowania w teście ACT. Zakres końcowych stężeń formaldehydu (od 1,5% do 2%) był stosowany w kilku laboratoriach podczas części 3C testu^7,9. Alternatywnie, oligonukleotydy używane jako linkery mogą zostać zaprojektowane tak, aby pasowały do lepkiego końca odciętego przez drugą nukleazę restrykcyjną. Chociaż stwierdziliśmy, że 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR i 20-25 cykli w drugiej rundzie PCR mogą zapewnić wyraźne prążki, konieczne jest ustalenie optymalnych warunków PCR dla każdego eksperymentu (Rycina 2). W reakcji PCR może dojść do hybrydyzacji wewnątrzcząsteczkowej między komplementarnymi sekwencjami adapterów na końcu 5' i 3' nici DNA, co hamuje hybrydyzację starterów specyficznych dla adaptera z cząsteczką DNA i skutkuje znacznie niższą wydajnością amplifikacji w pierwszych kilku cyklach. Po amplifikacji docelowego DNA przez określoną liczbę cykli, jego ilość może być znacznie większa niż w przypadku tych niespecyficznych reakcji, co może ułatwić konkurencję o hybrydyzację starterów z docelowymi cząsteczkami DNA. Jest to również powód, dla którego możemy obserwować amplifikację tła oraz powód, dla którego produkt pierwszej rundy PCR musi zostać rozcieńczony w celu zmniejszenia amplifikacji tła. Ważne jest usunięcie nadmiaru starterów z reakcji PCR, aby zmniejszyć tło w drugiej rundzie PCR. Jak we wszystkich eksperymentach opartych na PCR, kluczowe jest zaprojektowanie starterów, które nie znajdują się w regionach sekwencji powtórzonych, które stanowią większość DNA człowieka i myszy. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania powiązań DNA w całym genomie, test ACT pozostaje skuteczną techniką badania oddziaływań DNA specyficznych dla konkretnego locus.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pożywka RPMI1640	Invitrogen	22400-105
akrylamid	Invitrogen	15512-023
roztwór ATP, 10mM	Invitrogen	AM8110G
płodowa surowica bydlęca	Invitrogen	16000-044
penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
1M Tris pH8.0	Invitrogen	AM9856
RNaza A	Invitrogen	12091-039
SDS	Invitrogen	15525-017
mocznik	Invitrogen	15505-035
BamH I	New England Biolabs	R0136T
Bgl II	New England Biolabs	R0144M
Dpn II	New England Biolabs	R0543T
Msp I	New England Biolabs	R0106S
dNTP	New England Biolabs	N0447L
proteinaza K	New England Biolabs	P8102S
ligaza T4 DNA	New England Biolabs	M0202T
37% formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Bis-akrylamid	Sigma-Aldrich	146072
ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
glicyna	Sigma-Aldrich	50046
PMSF	Sigma-Aldrich	93482
inhibitor proteinaz	Sigma-Aldrich	S8830
Nonidet P-40	Roche Group	11754599001
KlenTaq1	Ab peptides	1001
dCTP alpha P32	PerkinElmer, Inc.	BLU513H250UC
Termocykler PTC-100	MJ Research	mjptc100
Zasilacz	Bio-Rad	164-5056
OmniPAGE Maxi	Aurogene Life Science	VS20D
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-78