Powiązana pułapka chromosomowa do identyfikacji interakcji DNA dalekiego zasięgu

Podsumowanie

Test powiązanej pułapki chromosomowej (ACT) jest nową, bezstronną metodą identyfikacji interakcji DNA dalekiego zasięgu. Charakterystyka oddziaływań DNA dalekiego zasięgu pozwoli nam określić związek architektury jądrowej z ekspresją genów zarówno w normalnej fizjologii, jak i w stanach chorobowych.

Streszczenie

Informacja genetyczna kodowana przez DNA jest zorganizowana w złożoną i wysoce regulowaną strukturę chromatyny. Każdy chromosom zajmuje określone terytorium, które może się zmieniać w zależności od etapu rozwoju lub cyklu komórkowego. Ekspresja genów może zachodzić w wyspecjalizowanych fabrykach transkrypcji, w których segmenty chromatyny mogą wychodzić z różnych terytoriów chromosomów, co prowadzi do kolokalizacji segmentów DNA, które mogą istnieć na różnych chromosomach lub daleko od siebie na tym samym chromosomie. Test Associated Chromosome Trap (ACT) zapewnia skuteczną metodologię identyfikacji tych dalekosiężnych asocjacji DNA w bezstronny sposób poprzez rozszerzenie i modyfikację techniki wychwytywania konformacji chromosomów. Test ACT umożliwia nam zbadanie mechanizmów regulacji transkrypcji u trans i może pomóc wyjaśnić związek architektury jądrowej z ekspresją genów w normalnej fizjologii i podczas stanów chorobowych.

Protokół

1. Utrwalanie formaldehydu w oddziaływaniach chromatyny dalekiego zasięgu

1. Hodowla ludzkiej linii komórkowej HL-60 w pożywce RPMI1640 z 15% FBS i 1 x penicylina/streptomycyna do 80-90% konfluencji w inkubatorze zasilanym 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Zebrać komórki do 50-mililitrowej probówki Nunc, odwirować z prędkością 1200 obr./min przez 15 minut, a następnie usunąć pożywkę przez aspirację
3. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić osady komórkowe i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Weź około 1 x 10⁷ komórek do objętości 40 ml z RPMI1640 / 10% FBS, a następnie dodaj 1,7 ml 37% formaldehydu, aby utrwalić rozcieńczoną chromatynę.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie wstrząsając, a następnie ugasić 2,4 ml 2M glicyny. Wirować przez 15 minut przy 1 200 obr./min w temperaturze 4°C i usunąć supernatant. Umyj granulkę raz 40 ml lodowatego PBS, a następnie odkręć granulkę i wyjmij PBS.

2. Liza komórek w celu wyizolowania jąder

1. Zawieś komórki w 40 ml lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy (rozcieńczenie 1:500) i 0,1 mM PMSF. Inkubować w chłodni z rotacją przez 90 minut, odwirować z prędkością 2 500 obr./min przez 15 minut i usunąć supernatant.

3. Trawienie enzymem restrykcyjnym za pomocą Bgl II

1. Zawiesić jądra w 0,5 ml 1 x bufor NEB 3 i dodać 15 μl 10% SDS. Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem, następnie dodać 45 μl 20% Triton X-100 w celu sekwestracji SDS. Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem.
2. Użyj podwielokrotności 1 x 10⁶ jąder (około 15 μg, jedna dziesiąta oryginalnych komórek) do trawienia enzymów restrykcyjnych. Pobrać 55 μl roztworu jąder z kroku 3.1 i uzupełnić do 500 μl 433 μl 1 x bufor NEB 3 i 12 μl Bgl II(50U/ul). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc.

4. Podwiązanie oddziałujących segmentów DNA

1. Dezaktywować enzym restrykcyjny przez dodanie 95 μl 10% SDS i denaturować przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C przez 20 minut w łaźni wodnej.
2. Dodać 7 ml 1 x bufor do ligacji (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) i 360 μl 20% Triton X-100 i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
3. Obniż temperaturę do 16°C i dodaj 50 μl 400 U/μl ligazy DNA T4. Inkubować próbkę w temperaturze 16 °C przez 4 godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

5. Oczyszczanie DNA

1. Dodać 300 μg proteinazy K i inkubować w temperaturze 65°C przez noc.
2. Dodać 5 μg RNazy A i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut
3. Oczyść DNA przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącić DNA w izopropanolu. Rozpuść DNA w 150 μl sterylnej wody destylowanej.

6. Trawienie za pomocą Msp I i ligacja za pomocą łączników oligonukleotydowych

1. Inkubować 2 μg oczyszczonego DNA z 5 jednostkami Msp I w temperaturze 37°C przez 4-6 godzin. Dezaktywować Msp I w temperaturze 65°C przez 10 minut, a następnie wytrącić DNA w etanolu za pomocą 1 μl 5 mg/ml glikogenu. Rozpuścić osad DNA w 50 μl sterylnej wody destylowanej.
2. Zmieszać 50 μl DNA poddanego działaniu Msp I z 2 μl oligonukleotydu 20 μM łącznikowego L (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttgttagcggacacagggcgattcac-3'), 1 μl oligonukleotydu S o masie 20 μM (5'-cggtgaatc-3'), 1 μl sterylnej wody destylowanej i 6 μl 10 x buforu ligazy DNA T4. Przykryj mieszaninę płynnym woskiem.
3. Denaturować oligonukleotydy w temperaturze 50°C przez 1 minutę i pozostawić do stopniowego schładzania do 10°C w gradiacji 0,5°C /minutę w termocyklerze.
4. Dodać 1 μl 400 U/μl ligazy DNA T4 i inkubować w temperaturze 15°C przez noc. Oczyść DNA ligowane łącznikiem za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR i eluuj w 50 μl sterylnej wody destylowanej.

7. Amplifikacja PCR i analiza sekwencji

1. Wybierz starter dla konkretnego regionu DNA, który chcesz zbadać pod kątem interakcji na duże odległości (tj. "przynęta"). W tym przykładzie używamy ABL-1.
2. Weź 1 μl oczyszczonego DNA, aby przeprowadzić pierwszą rundę PCR przy użyciu 1 μl 20 μM specyficznego startera ABL-1 #4656 (5'-gttcaagcgattcctgcctcga-3'), 1 μl 20 μM specyficznego startera łącznikowego #2963 (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3'), 3 μl 3 μl koktajlu 3 x polimerazy DNA Klen Taq I i 3 μl sterylnej wody destylowanej. Dwa μl ³²P-dCTP dodaje się do 100 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA Klen Taq I przed amplifikacją PCR. Cykl termiczny dla gorącego startu PCR wynosi 72°C przez 2 minuty, 95°C przez 2 minuty; 18 cykli w temperaturze 95°C przez 20 sekund, w temperaturze 65°C przez 40 sekund i w temperaturze 72°C przez 1 minutę; końcowe przedłużenie wykonuje się w temperaturze 72°C przez 5 minut.
3. Oczyść pierwszą rundę produktów PCR za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR i wymyj DNA w 30 μl sterylnej wody destylowanej.
4. Weź 1 μl 100 x rozcieńczony pierwszy produkt PCR, aby przeprowadzić drugą rundę PCR przy użyciu zagnieżdżonych starterów, dodając 1 μl 20 μM specyficznego startera ABL-1 #4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3') (Figura 1a), 1 μl 20 μM startera specyficznego dla łącznika #2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3'), 3 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA Klen Taq I i i 3 μl sterylnej wody destylowanej. Harmonogram cykli termicznych to 25 cykli w temperaturze 95°C przez 20 sekund, 67°C przez 40 sekund i 72°C przez 1 minutę, a następnie wydłużenie w temperaturze 72°C przez 5 minut.
5. Wizualizację produktów PCR polega na nałożeniu 5% żelu mocznikowego PAGE i zeskanowaniu naświetlonego ekranu w PhosphoImager (Rysunek 1b). Każdą opaskę PCR można poddać recyklingowi z żelu poprzez rozpuszczenie pasków żelu w probówce Eppendorfa zawierającej 60 μl sterylnej wody destylowanej i inkubację w temperaturze 95°C przez 5 minut. Wirować krótko z prędkością 10 000 obr./min przez 10 sekund, aby zebrać wszystkie próbki. Usunąć 1 μl, aby użyć go jako matrycy DNA do przeprowadzenia PCR z parą starterów 2961/4626 w tych samych warunkach, jak opisano powyżej. Analizę sekwencji można przeprowadzić po oczyszczeniu za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR.
6. Sekwencje DNA są analizowane za pomocą narzędzia online w celu określenia ich lokalizacji chromosomalnej na stronie internetowej: http://genome.ucsc.edu(Rysunek 1c). Kliknij 'BLAT', aby przejść do nowego okna, które pozwala na wklejenie sekwencji DNA, po kliknięciu 'prześlij' pojawi się nowe okno i pokaże 'Wyniki wyszukiwania BLAT'. Kliknij "przeglądarka" trafienia ze 100% tożsamością, aby przejść do następnego okna pokazującego lokalizację sekwencji DNA.

8. Reprezentatywne wyniki

1. Test ACT z użyciem regionu ABL-1 jako przynęty do określenia jego dalekosiężnych oddziaływań DNA

Jak pokazano na rysunku 1a, do testu ACT wybrano dwie strony Bgl II i jedno miejsce BamH I. W drugiej rundzie PCR do amplifikacji ABL-M1 użyto zestawu starterów 4626/2961, do ABL-M2 użyto 4630/2961, a do ABL-M3 użyto zestawu starterów 4626/2961. Typowy wzór żelu pokazuje od jednego do kilku prążków (ryc. 1b). Każdy fragment z testu ACT składa się z dwóch połączonych segmentów DNA: jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, podczas gdy drugi segment pochodzi od powiązanego partnera, który został połączony z segmentem regionu przynęty przez pierwszą sekwencję rozpoznającą enzym restrykcyjny. Druga sekwencja rozpoznawania enzymu pojawi się na końcu powiązanej sekwencji partnerskiej (ryc. 1c). Sklonowany fragment ABL-M1 zawiera DNA z regionu ABL1 zlokalizowanego na chromosomie 9q32.4 od +133,592,306-133,592,399, a powiązany partner znajduje się na chromosomie 3p13 od +71,869,882-71,870,107. Tożsamość powiązanych partnerów jest odkrywana poprzez wysadzanie ich sekwencji za pomocą przeglądarki genomu UCSC (GRCh7/hg19 wydanej w lutym 2009 roku). PROK2 został zidentyfikowany jako partner stowarzyszony w locus chr3p13.

Podobnie, partner powiązany z ABL-M2 został zlokalizowany do chr5q21.1, podczas gdy klon ABL-M3 został zidentyfikowany jako wewnątrzchromosomalna asocjacja w pobliżu locus ABL-1.

2. Określanie mniej rozpowszechnionych interakcji dalekiego zasięgu za pomocą testu ACT

Inne testy oparte na 3C wykazały o wiele więcej oddziałujących partnerów niż te, które pokazaliśmy na rysunku 1 i w locus¹² Igf2/H19. Metodologia, którą przedstawiliśmy, wybierze najbardziej rozpowszechnione interakcje dalekiego zasięgu. Jednak zwiększając liczbę cykli PCR, możliwe jest zidentyfikowanie dodatkowych, rzadziej występujących powiązań (ryc. 2).

3. Różnice w oddziaływaniach dalekiego zasięgu w komórkach nowotworowych w porównaniu do normalnych tkanek.

Test ACT może być również używany do identyfikacji różnic w architekturze jądrowej i dalekosiężnych oddziaływań między normalnymi komórkami a komórkami nowotworowymi (Rysunek 3). Różnice te mogą odzwierciedlać zmiany w architekturze jądrowej, które zachodzą podczas transformacji komórki, a zatem test ten może ostatecznie znaleźć zastosowanie do celów diagnostycznych. Podobne wzorce żelu, które występują zarówno w tkankach prawidłowych, jak i nowotworowych, wskazują, że test ACT jest wiarygodny i powtarzalny. Podczas gdy test ACT może zidentyfikować partnerów DNA dalekiego zasięgu, wymagane są dalsze analizy, takie jak testy FISH i ChIP, w celu zweryfikowania obecności zidentyfikowanych powiązań między odległymi loci. Następnie można przeprowadzić badania genetyczne, fizjologiczne i biochemiczne w celu wyjaśnienia biologicznych implikacji tych dalekosiężnych powiązań DNA.

Rycina 1 Test ACT wykorzystujący region ABL-1 jako przynętę DNA w komórkach HL-60. a. Struktura DNA w regionie ABL-1. Pierwszym enzymem restrykcyjnym zastosowanym w teście ACT był Bgl II. Startery do drugiej rundy PCR są również oznaczone strzałkami i odpowiadającymi im numerami starterów. b. Wzór żelowy testu ACT w 5% moczniku-PAGE. Para starterów 4626/2961 została użyta do amplifikacji klonu ABL-M1 w zagnieżdżonym PCR, 4630/2961 została użyta do klonu ABL-M2, a 4636/2961 została użyta do klonu ABL-M3. c. Sekwencja DNA klonu ABL-M1. Fragment DNA z przynęty ABL-1 DNA jest oznaczony na czerwono, a powiązany partner DNA jest oznaczony na niebiesko. Bgl powiedział: Stanowisko II (AGACTC) zostało oznaczone kolorem zielonym, a stanowisko Msp I (CCGG) jest oznaczone kolorem fioletowym.

Rycina 2 Cykle PCR wpływają na wyniki testu ACT. Wykorzystując region kontrolny imprintingu (ICR) w locus Igf2 / H19 jako przynętę DNA w komórkach fibroblastów myszy, w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście ACT zastosowano różne programy cykliczne. 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR nie wzmocniło sygnału wystarczającego do wizualizacji. Dwadzieścia pięć cykli w drugim PCR skutkuje wyraźnymi prążkami, podczas gdy zwiększenie liczby cykli w drugiej rundzie PCR wywołało wzór rozmazu oprócz większej liczby prążków.

Rycina 3 Wykrywanie różnic w architekturze jądrowej między normalną tkanką okrężnicy a tkanką raka jelita grubego w teście ACT. a. Struktura DNA regionu ICR w locus IGF2/H19 i genie IGF2. Dpn II miejsca do oznaczania ACT są oznaczone. Startery użyte w drugiej rundzie PCR są oznaczone strzałkami i numerami w różnych kolorach, które odpowiadają każdemu pasowi w panelu b rysunku. b. Wzór żelowy testu ACT w 5% moczniku-PAGE. Normalna tkanka jelita grubego MAD03-1423 i tkanka raka jelita grubego MAD04-149 uzyskano z Cooperative Human Tissue Network (CHTN) Western Division. Po homogenizacji każdej tkanki jelita grubego przeprowadzono test ACT zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym dokumencie. Tor 1 reprezentuje wyniki PCR przy użyciu pary starterów #2961and #4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3') oznaczonej na różowo w panelu a; Tor 2 reprezentuje wyniki PCR przy użyciu pary starterów #2961 i #4163 (5'-gccgccggccacttccgattcc-3') oznaczonych na pomarańczowo w panelu A; tor 3 reprezentuje wyniki PCR przy użyciu pary starterów #2961 i #5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') oznaczonych na niebiesko w panelu a; Tor 4 reprezentuje wyniki PCR przy użyciu pary starterów #2961 i #5151(5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3') oznaczonych na zielono w panelu a. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w normalnej tkance okrężnicy, są oznaczone żółtymi strzałkami, a te prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego, są oznaczone czerwonymi strzałkami. ICR, obszar kontrolny nadruku; DMR, inny region metylowany.

Dyskusja

Dekker i wsp. opracowano metodę wychwytywania konformacji chromosomów (3C) w celu wykrycia częstości interakcji między dwoma loci genomowymi¹, a 3C jest szeroko stosowany do badania powiązań wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomowych między dwoma znanymi regionami DNA w komórkach ssaków^2-9. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania asocjacji DNA w całym genomie, test ACT jest nadal skuteczną techniką badania interakcji DNA specyficznej dla locus^10-11. Zmodyfikowaliśmy to podejście, aby zidentyfikować nieznane regiony DNA, które są związane ze znanym regionem DNA w hodowanych komórkach myszy i ludzi (ryc. 1). Nazwaliśmy tę metodę testem powiązanej pułapki chromosomowej (ACT), ponieważ zapewniła nam wiarygodną i powtarzalną metodę identyfikacji nowych nieznanych partnerów DNA, którzy wiążą się ze znanym docelowym regionem DNA¹². Udany test 3C z odpowiednimi kontrolami jest wykonywany przed wykonaniem nowatorskich aspektów testu ACT¹³. Aby znaleźć jak najwięcej powiązanych regionów DNA, konieczne jest użycie różnych kombinacji pierwszego i drugiego enzymu restrykcyjnego. Szczególnie ważne jest stosowanie enzymów restrykcyjnych, które są niewrażliwe na metylację CpG, aby wykonać pierwszy etap ligacji 3C. Wiązanie białek i metylacja DNA mogą również wpływać na wydajność trawienia enzymów restrykcyjnych i mogą prowadzić do niepowodzenia ligacji powiązanych regionów DNA dla niektórych trawień enzymów restrykcyjnych. Występowanie ligacji wewnątrz- lub międzychromosomowej zależy od sieciowania białko-DNA i odpowiednich map fizycznych obu powiązanych regionów DNA. W związku z tym niezbędne są pewne wstępne eksperymenty w celu ustalenia praktycznego skutecznego stężenia formaldehydu i czasu obróbki w teście ACT. Zakres końcowych stężeń formaldehydu (od 1,5% do 2%) został wykorzystany w kilku laboratoriach podczas części testu^{3C 7,9}. Alternatywnie, oligonukleotydy stosowane jako łączniki mogą być zaprojektowane tak, aby pasowały do spójnego końca przeciętego przez drugi enzym restrykcyjny. Chociaż stwierdziliśmy, że 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR i 20-25 cykli w drugiej rundzie PCR może zapewnić wyraźne prążki, konieczne jest ustalenie najlepszych warunków PCR dla każdego eksperymentu (ryc. 2). Wyżarzanie wewnątrzcząsteczkowe między komplementarną sekwencją adaptorową końca 5' i końca 3' nici DNA może wystąpić w PCR, hamuje to wyżarzanie starterów specyficzne dla adaptora z cząsteczką DNA i spowodowało znacznie niższą wydajność amplifikacji w pierwszych kilku cyklach. Po amplifikacji docelowego DNA przez cykle, jego ilość może być znacznie większa niż w tych niespecyficznych reakcjach i może ułatwiać konkurencję w zakresie wyżarzania starterów do docelowych cząsteczek DNA. Jest to również powód, dla którego możemy zaobserwować wzmocnienie tła i dlaczego produkt pierwszej rundy PCR musi zostać rozcieńczony, aby zmniejszyć wzmocnienie tła. Ważne jest, aby usunąć nadmiar starterów z reakcji PCR, aby zmniejszyć tło w drugiej rundzie PCR. Podobnie jak we wszystkich eksperymentach opartych na PCR, ważne jest, aby zaprojektować startery, które nie znajdują się w regionach sekwencji powtórzeń, które stanowią większość DNA człowieka i myszy. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania asocjacji DNA w całym genomie, test ACT jest nadal skuteczną techniką badania interakcji DNA specyficznej dla locus.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI1640 podłoże	Invitrogen	22400-105
akryloamid	Invitrogen	15512-023
roztwór ATP, 10mM	Invitrogen	AM8110G
płodowa surowica bydlęca	Invitrogen	16000-044
penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
1M Tris pH 8,0	Invitrogen	AM9856
RNase A	Invitrogen	12091-039
SDS	Invitrogen	15525-017
Mocznik	Invitrogen	15505-035
BamH I	New England Biolabs	R0136T
Bgl II	New England Biolabs	R0144M
Dpn II	New England Biolabs	R0543T
Msp I	New England Biolabs	R0106S
dNTP	New England Biolabs	N0447L
proteinaza K	New England Biolabs	P8102S
T4 Ligaza DNA	New England Biolabs	M0202T
37% formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Bis-akryloamid	Sigma-Aldrich	146072
ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
glicyna	Sigma-Aldrich	50046
PMSF	Sigma-Aldrich	93482
	Sigma-Aldrich	S8830
Nonidet P-40	Grupa	Roche
KlenTaq1	Ab peptydy	1001
dCTP alfa P32	PerkinElmer, Inc.
PTC-100 Termocykler	MJ Research	MJPTC100
Zasilacz	Bio-Rad	164-5056
OmniPAGE Maxi	Aurogene Life Science	VS20D
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-78