1. Przygotowanie do eksperymentu
- Uruchom oprogramowanie Dynamic Muscle Control (DMC).
- Włącz zestaw fizjologiczny zgodnie z instrukcjami producenta.
- Obsługa oprogramowania DMC:
Zakłada się, że sprzęt jest podłączony do komputera, na którym uruchomiono oprogramowanie DMC, a system został skalibrowany. Oprogramowanie może być od czasu do czasu aktualizowane, dlatego poniżej przedstawiono instrukcje odnoszące się do obecnie używanej przez nas wersji. Po otwarciu oprogramowanie jest już uruchomione.
Użytkownik może początkowo zapisać protokół w DMC (np. stymulację z częstotliwością 50 Hz przez 1,5 s w celu wywołania tężca izometrycznego), a następnie zapisać go do późniejszego wykorzystania. Stosujemy dwa standardowe protokoły: (1) protokół skurczu izometrycznego (np. pojedynczy skurcz lub tężec) oraz (2) protokół urazu przez rozciąganie ekscentryczne. Rozpoczynamy od protokołu skurczu izometrycznego dla pojedynczego skurczu. W celu optymalizacji skurczu wykorzystuje się ekran Monitor Outputs; podczas przesuwania elektrod można obserwować generowany moment obrotowy. Po osiągnięciu maksymalnej odpowiedzi skurczowej dane są zbierane poprzez powrót do ekranu głównego (wybór Continue) oraz wybranie opcji Begin i Done. Pliki są zapisywane z wyskakującego okna Save As. Przy elektrodach pozostających w tej samej pozycji rejestrowany i zapisywany jest następnie tężec (50 Hz). Po zakończeniu wszystkich skurczów izometrycznych można wczytać i uruchomić protokół urazu przez rozciąganie ekscentryczne. Ponieważ w tym protokole należy wykonać serię skurczów (10 skurczów), na ekranie głównym wybiera się przycisk Run One, aby wyświetlić status Run All. Po wybraniu Begin pojawia się wyskakujące okno Run All Protocols, w którym należy podać nazwę pliku głównego oraz katalog, w którym pliki mają zostać zapisane. Następnie wybiera się Start Protocol Series Test oraz Done, aby zainicjować protokół ekscentryczny. Pliki są zapisywane automatycznie w wybranym katalogu.
2. Pozycjonowanie zwierzęcia w aparaturze fizjologicznej
- Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą być zgodne z wytycznymi komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt (ACUC).
- Zanurzyć psa w znieczuleniu wziewnym (np. izofluranem) zgodnie z zatwierdzonym protokołem. Sprawdzić odruch mrugania, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w stanie głębokiej anestezji. Przez cały czas trwania procedury należy ściśle monitorować poziom CO2, pulsoksymetrię oraz temperaturę. Zazwyczaj stosujemy propofol do indukcji, a następnie sewofluran do znieczulenia wziewnego.
- Wygolić sierść wokół bocznej strony stawu kolanowego w miejscu, w którym zostaną umieszczone elektrody stymulujące (tj. boczna strona kończyny, zaczynając od głowy kości strzałkowej do 2-3 cm dystalnie od krętarza większego).
- Umieścić psa na stole fizjologicznym w pozycji grzbietowej, ustawiając kończynę miedniczną tak, aby kość udowa i piszczelowa tworzyły kąt prosty, a piszczel była równoległa do blatu stołu. Badaniu może zostać poddana kończyna prawa lub lewa.
- Przed przymocowaniem łapy psa do pedału siłowego sprawdzić, czy pedał jest wolny i bezpieczny do obrotu. Wykonać procedurę włączania aparatury fizjologicznej i aktywować pedał. Uwaga: pedał siłowy powinien stawiać opór („być sztywny”) podczas próby ręcznego poruszenia go przez użytkownika.
- Delikatnie ułożyć łapę psa w pedale nożnym; zmierzyć i zapisać długość łapy psa od osi obrotu do końca bocznego palca.
- Zabezpieczyć łapę w pedale nożnym za pomocą elastycznej bandaża samoprzylepnego.
3. Izometryczny moment obrotowy skurczu (zgięcie stawu skokowego)
- Po przeprowadzeniu kontroli bezpieczeństwa podłącz sterylnie osłonięte jednobiegunowe elektrody stymulujące o rozmiarze 24-gauge do jednostki izolacji bodźca (SIU).
- Ustaw stymulator na: ciągłe wyjście impulsów z częstotliwością 1 Hz (1 impuls na sekundę)
- Ustawienia oprogramowania: Wczytaj protokół skurczu izometrycznego (na ekranie głównym wybierz Load Protocol). Przycisk Run One powinien być widoczny obok przycisku Begin. Zapewnia to jednorazowe wykonanie protokołu.
- W rękawiczkach oczyść skórę alkoholem i zlokalizuj poprzez palpację nerw strzałkowy wspólny tuż distalnie względem bocznej części proksymalnej strzałki. Trzymając palcem miejsce przebiegu nerwu, ostrożnie wprowadź elektrodę katody (czarną) pod skórę, tuż na zewnątrz okostnej. Elektrodę należy umieścić równolegle do powierzchni skóry na głębokości około 2cm, co zapobiegnie jej przesunięciu po zabraniu ręki.
- Umieść elektrodę anody (czerwoną) pod skórą, równolegle i nieco bardziej distalnie względem elektrody katody. Obie elektrody powinny znajdować się teraz wewnątrz nerwu strzałkowego wspólnego, tuż distalnie względem głowy strzałki.
- Aktywuj stymulator z częstotliwością 1 Hz. Obserwuj odpowiedzi drgające na monitorze. Wprowadzaj niewielkie korekty pozycji elektrod, aby uzyskać jak największą amplitudę drgnienia. Aby znaleźć największą odpowiedź drgającą, elektrodę należy całkowicie usunąć i ponownie wprowadzić w trzech do czterech odstępach po ½ cm równolegle do piszczeli. Jest to kluczowy element procedury i należy zachować szczególną staranność w celu znalezienia największej odpowiedzi.
- Zarejestruj odpowiedzi drgające, opuszczając ekran Monitor Outputs (wybierz Continue), a następnie wybierz Begin i Done , aby zebrać dane. Zapisz plik z wybraną nazwą w wyskakującym oknie Save As. Wyłącz stymulator.
4. Izometryczny moment obrotowy tetaniczny (zgięcie stawu skokowego)
- Bez przesuwania elektrod zmień ustawienia stymulatora na 50 Hz przez 1,5 s i włącz funkcję zewnętrznego wyzwalacza. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
- Ustawienia oprogramowania: Takie same protokół skurczu izometrycznego wykorzystuje się do rejestracji odpowiedzi tężcowej, podobnie jak w przypadku skurczu pojedynczego. Zakładając, że elektrody stymulujące nie zostały przesunięte, Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia. i Gotowe wybierane do produkcji tężca. W protokół izometryczny aby wywołać tężec, stymulator jest uruchamiany przez oprogramowanie w celu zachowania prawidłowego czasu. Należy zapisać odpowiedź tężcową w Zapisz jako okno wyskakujące
5. Protokół ekscentryczny
- Bez przesuwania elektrod zmienić ustawienia stymulatora na: 50 Hz przez 1 s (100V) oraz włączyć funkcję zewnętrznego wyzwalacza (external trigger). Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
- Ustawienia oprogramowania: Wczytać protokół urazu przez rozciąganie ekscentryczne (eccentric stretch injury protocol), polecenie dla serwosilnika do obrotu o 29 stopni (maksymalnie 30 stopni). Wybrać Run All. Wybrać Begin; wprowadzić nazwę pliku głównego dla serii plików ekscentrycznych oraz folder, w którym mają zostać zapisane. Wybrać Start Protocol Series Test, a następnie Done, aby rozpocząć protokół.
- W tym protokole stymulator jest ustawiony tak, aby był wyzwalany przez oprogramowanie w celu zachowania prawidłowego czasu. W miarę pojawiania się na ekranie odpowiedzi na każdy skurcz ekscentryczny, jest ona automatycznie zapisywana.
- Po każdym zestawie dziesięciu skurczów ekscentrycznych następuje czterominutowy okres odpoczynku.
- Zebrać łącznie 30 skurczów ekscentrycznych (trzy zestawy po dziesięć skurczów; każdy zestaw oddzielony czterominutową przerwą).
6. Izometryczny moment obrotowy skurczu (wyprost stawu skokowego)
- Powtórz powyższy protokół drgań, lecz umieść elektrody prostopadle do skóry i proksymalnie względem pierwotnego rozmieszczenia elektrod zastosowanego w protokole zgięcia.
Stymulowany jest nerw piszczelowy w miejscu, w którym biegnie on w kierunku kaudalnym i dystalnym w obrębie brzuśców mięśnia brzuchatego łydki. Pary elektrod stymulujących i referencyjnych umieszcza się
głęboko w obrębie mięśni, kaudalnie i tuż proksymalnie względem stawu kolanowego. Przybliżony punkt umieszczenia elektrod znajduje się wzdłuż linii przecinającej kąt 90o
tworzony przez staw kolanowy. Ponieważ nerw piszczelowy znajduje się głębiej (i bardziej kaudalnie) niż wspólny nerw strzałkowy, elektrody należy umieścić w kilku obszarach, aby uzyskać
optymalne potencjały drgań. Jest to krytyczny element procedury. Uwaga: zapisy momentu obrotowego dla drgań i tężca stawu skokowego będą wyglądać na odwrócone w stosunku
do zapisów zgięcia stawu skokowego.
7. Izometryczny moment obrotowy tężcowy (wyprost stawu skokowego)
- Nie przesuwając elektrod, zmień ustawienia stymulatora na 50 Hz przez 1,5 s i włącz funkcję zewnętrznego wyzwalacza. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
- Ustawienia oprogramowania: 50 Hz przez 1,5 s oraz włączona funkcja zewnętrznego wyzwalacza. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
- Ustawienia oprogramowania: W przypadku tężca stosuje się ten sam protokół skurczu izometrycznego, co w przypadku pojedynczego skurczu. Zakładając, że elektrody stymulujące nie zostały przesunięte, wybierz Begin oraz Done, aby wywołać tężec.
- W protokole izometrycznym służącym do wywołania tężca stymulator jest uruchamiany przez oprogramowanie w celu zachowania prawidłowego czasu. Zapisz odpowiedź tężcową w wyświetlanym oknie zapisu pliku Save File.
8. Analiza danych
- Do uzyskania informacji o momencie obrotowym i parametrach czasowych zebranych podczas skurczów pojedynczych, tężcowych i ekscentrycznych wykorzystuje się program do dynamicznej analizy mięśni (DMA) (Aurora Scientific).
- Uruchamianie programu DMA: Oprogramowanie może być okresowo aktualizowane, dlatego poniżej przedstawiono instrukcje dotyczące obecnie używanej przez nas wersji. Po otwarciu program DMA nie jest aktywny. Aby aktywować program, należy wybrać przycisk z białą strzałką w lewym górnym rogu. Program DMA posiada szereg funkcji, jednak dla naszych celów opisane zostaną tylko kilka istotnych z nich.
Wczytywanie pliku do analizy: Po uruchomieniu programu DMA pojawia się okno wyskakujące z pytaniem Reload recent data file or new data file? Wybierz New; w kolejnym oknie wybierz Labview; następnie wybierz odpowiedni folder i plik, a potem kliknij Open. Wybierz Remove Filter Plot, aby zamknąć to okno. W polu Cut-off Frequency wprowadź częstotliwość odcięcia filtra. Optymalna częstotliwość filtra musi zostać określona na podstawie konkretnych danych poddawanych ocenie. Przykładowo, dla odpowiedzi izometrycznych stosujemy 30 Hz, a dla odpowiedzi ekscentrycznych 10 Hz. Wybierz przycisk Use filtered data. W sekcji Select Plot Data wybierz Filtered Force. Użyj dwóch suwaków na dole, aby powiększyć obraz i przemieszczać się po pliku.
- Analiza skurczu pojedynczego (Fig 1): Po wczytaniu pliku i wykonaniu powyższych kroków ustaw pozycje kursorów. Dostępne są 3 kursory: (1) niebieski, (2) żółty i (3) biały. W przypadku skurczów izometrycznych pojedynczych i tężcowych lub innych skurczów izometrycznych kursor niebieski ustawia się w punkcie, w którym moment obrotowy zaczyna wzrastać powyżej momentu spoczynkowego; kursor żółty umieszcza się w miejscu, gdzie moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej (tj. po fazie relaksacji); kursor biały umieszcza się na prawo od kursora żółtego (nie jest on w tym przypadku wymagany). Kursory można łatwo przesuwać, przytrzymując lewy przycisk myszy i przeciągając wybrany kursor w pożądane miejsce.
Przeprowadzenie analizy: Po ustawieniu kursorów wybierz Do Muscle Analysis, a następnie Show Results. W oknie wyskakującym Analyzed Muscle Data Results wyświetlona zostanie szereg zmiennych, takich jak Maximum Force; Baseline Force; ½ Relaxation Time itp. Dane są prezentowane dla odpowiedzi momentu obrotowego znajdującej się między kursorem 1 (niebieskim) a 2 (żółtym). Wszystkie te zmienne lub wybrane z nich mogą być zapisywane w pliku danych, jednak proces ten nie został tutaj opisany. Jeśli rejestrowanie danych nie jest skonfigurowane, dane należy zapisać ręcznie. Wybierz Close Window, aby powrócić do głównego ekranu. Wybierz Exit Program, aby zamknąć program DMA, a następnie kliknij białą strzałkę, aby rozpocząć analizę nowego pliku.
- Analiza tężca (Fig 2): Postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej dla skurczu pojedynczego.
- Analiza ekscentryczna (Fig 3): Analiza ekscentryczna wymaga więcej kroków konfiguracji i wykorzystuje wszystkie 3 kursory. Jeśli odpowiedź momentu obrotowego podczas skurczu ekscentrycznego jest ujemna (tj. zapis momentu obrotowego biegnie w dół), można go odwrócić, wpisując -1 w polu Reference Area (sq cm) (wartości momentu obrotowego pozostają niezmienione) i wybierając Do not normalize; przycisk zmieni stan, wskazując, że dane zostały znormalizowane (w tym przypadku odwrócone). Wprowadź żądaną częstotliwość odcięcia Cut Off Frequency (np. 10 Hz) i wybierz Use unfiltered data, aby zmienić przycisk na Use filtered data; od tego momentu w analizie będą wykorzystywane dane przefiltrowane. Ustaw kursor niebieski w punkcie, w którym moment izometryczny zaczyna wzrastać powyżej momentu spoczynkowego; ustaw kursor żółty w punkcie, w którym moment rozciągania ekscentrycznego zaczyna wzrastać powyżej plateau izometrycznego (patrz rycina poniżej); ustaw kursor biały w miejscu, gdzie moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej. Wybierz Do Muscle Analysis, a następnie Show Results. W oknie wyskakującym Analyzed Muscle Data Results można wybrać dane między kursorem 1 (niebieskim) a 2 (żółtym) dla danych momentu izometrycznego lub między kursorem 2 (żółtym) a 3 (białym) dla danych momentu ekscentrycznego. Wszystkie te zmienne lub wybrane z nich mogą być zapisywane w pliku danych, jednak proces ten nie został tutaj opisany. Jeśli rejestrowanie danych nie jest skonfigurowane, dane należy zapisać ręcznie. Wybierz Close Window, aby powrócić do głównego ekranu. Wybierz Exit Program, aby zamknąć program DMA, a następnie kliknij białą strzałkę, aby rozpocząć analizę nowego pliku.
9. Reprezentatywne wyniki
- Moment obrotowy skurczu pojedynczego: Stymulacja nerwu piszczelowego (1 Hz) aktywowała pojedyncze skurcze prostowników stawu skokowego (Rys. 1). Należy zauważyć, że oś Y wskazuje „siłę”; moment obrotowy (iloczyn siły i odległości) jest obliczany przez użytkownika. Mierzymy długość łapy (od osi obrotu do końca palca bocznego). Długość ta stanowi odległość (ramię dźwigni) wykorzystywaną do wyznaczenia momentu obrotowego (N-m).
- Izometryczny moment obrotowy tężcowy (wyprost stawu skokowego): stymulacja nerwu piszczelowego wywołała tężec prostowników stawu skokowego (seria impulsów 50 Hz trwająca 1,5 s). Do kontroli czasu stymulacji i rejestracji odpowiedzi momentu obrotowego wykorzystaliśmy oprogramowanie komputerowe Dynamic Muscle Control (DMC, Aurora Scientific, Inc.) (Rys. 2).
- Protokół ekscentryczny: skurcze ekscentryczne przeprowadzano w zginaczach stawu skokowego. Przezskórna stymulacja nerwu strzałkowego aktywowała początkowy skurcz izometryczny, po którym następowała rotacja stawu powodująca wydłużenie aktywowanych mięśni zginaczy (skurcz ekscentryczny; Rys. 3).6

Rysunek 1. Umiejscowienie kursorów niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) w celu analizy skurczu. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z oprogramowania DMA dla skurczu wyprostnego stawu skokowego u zdrowego psa o masie 13 kg. Należy pamiętać, że w celu przeprowadzenia dalszej analizy przez oprogramowanie, dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, a wartość siły (pokazana na rysunku jako Force (g)) może zostać przeliczona na moment obrotowy (N-m). Moment obrotowy oblicza się jako iloczyn siły i długości ramienia dźwigni (w tym przypadku odległość = długość mierzona od osi obrotu do bocznego palca łapy).

Rysunek 2. Rozmieszczenie kursorów niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) w celu analizy tężca. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z oprogramowania DMA dla tężca wyprostu stawu skokowo-goleniowego, u tego samego zwierzęcia, co na Rys. 1.

Rycina 3. Rozmieszczenie niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) kursora w celu analizy ekscentrycznego skurczu z uszkodzeniem rozciąganiem. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z oprogramowania DMA dla pojedynczego ekscentrycznego skurczu z uszkodzeniem rozciąganiem u zdrowego psa o masie 13 kg. Początkowe plateau (zielona linia) ilustruje fazę izometryczną skurczu. Po fazie izometrycznej następuje faza ekscentryczna (rozciągania), co obrazuje gwałtowny szczyt na zielonej linii. Powtarzające się skurcze ekscentryczne zazwyczaj prowadzą do stopniowego spadku momentu obrotowego w fazie izometrycznej.