Test funkcji mięśni psów in vivo

Podsumowanie

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Streszczenie

Opisujemy małoinwazyjną i powtarzalną metodę pomiaru siły mięśni kończyny miednicznej psa oraz odpowiedzi mięśniowej na powtarzające się skurcze ekscentryczne. Kończyna miedniczna znieczulonego psa zostaje unieruchomiona w ramie stereotaktycznej, aby ustawić kość piszczelową pod kątem prostym do kości udowej. Owijka samoprzylepna mocuje łapę do pedału zamontowanego na wale serwosilnika w celu pomiaru momentu obrotowego. Przezskórna stymulacja nerwów aktywuje mięśnie kończyny miednicznej łapy do odpychania (wyprostu) lub przyciągania (zgięcia) pedału w celu wygenerowania momentu izometrycznego. Przezskórna stymulacja nerwu piszczelowego aktywuje mięśnie prostowniki stawu skokowego. Powtarzające się skurcze ekscentryczne (wydłużające) są indukowane w mięśniach zginaczach stawu skokowego poprzez przezskórną stymulację nerwu strzałkowego. Protokół ekscentryczny składa się z początkowego skurczu izometrycznego, po którym następuje wymuszone rozciąganie realizowane przez serwosilnik. Rotacja skutecznie wydłuża mięsień podczas jego skurczu, co stanowi przykład skurczu ekscentrycznego. Podczas stymulacji mięśnie zginacze są poddawane 800 msec skurczowi izometrycznemu i 200 msec skurczowi ekscentrycznemu. Procedura ta jest powtarzana co 5 sec. Aby uniknąć zmęczenia, po każdych 10 skurczach następuje 4 min odpoczynku, przy łącznej liczbie 30 wykonanych skurczów.

Protokół

1. Przygotowanie do eksperymentu

1. Uruchom oprogramowanie Dynamic Muscle Control (DMC).
2. Włącz zestaw fizjologiczny zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Obsługa oprogramowania DMC:

Zakłada się, że sprzęt jest podłączony do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem DMC, a system został skalibrowany. Oprogramowanie może być okresowo aktualizowane, dlatego poniżej przedstawiono instrukcje odnoszące się do obecnie używanej wersji. Po otwarciu oprogramowanie jest już uruchomione.

Użytkownik może początkowo zapisać protokół w DMC (np. stymulację z częstotliwością 50 Hz przez 1,5 s w celu wywołania tężca izometrycznego), a następnie zapisać go do późniejszego wykorzystania. Stosujemy dwa standardowe protokoły: (1) protokół skurczu izometrycznego (np. pojedynczy skurcz lub tężec) oraz (2) protokół urazu rozciągania ekscentrycznego. Rozpoczynamy od protokołu skurczu izometrycznego dla pojedynczego skurczu. W celu optymalizacji skurczu wykorzystuje się ekran Monitor Outputs; moment obrotowy generowany podczas skurczu można obserwować podczas przesuwania elektrod. Po osiągnięciu maksymalnej odpowiedzi skurczowej dane są zbierane poprzez powrót do ekranu głównego (wybierz Continue) oraz wybranie opcji Begin i Done. Pliki są zapisywane z okna wyskakującego Save As. Przy zachowaniu elektrod w tej samej pozycji zbierane i zapisywane są następnie dane dla tężca (50 Hz). Po zakończeniu wszystkich skurczów izometrycznych można wczytać i uruchomić protokół urazu rozciągania ekscentrycznego. Ponieważ w tym protokole należy wykonać serię skurczów (10 skurczów), na ekranie głównym wybiera się przycisk Run One, aby wyświetlić status Run All. Teraz, po wybraniu Begin, pojawia się okno wyskakujące Run All Protocols, w którym należy podać nazwę pliku głównego oraz katalog, w którym pliki mają zostać zapisane. Następnie wybiera się Start Protocol Series Test i Done, aby zainicjować protokół ekscentryczny. Pliki są automatycznie zapisywane w wybranym katalogu.

2. Pozycjonowanie zwierzęcia w aparaturze fizjologicznej

1. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą być zgodne z wytycznymi komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt (ACUC).
2. Zanurzyć psa w znieczuleniu za pomocą anestezji wziewnej (np. izofluranu) zgodnie z zatwierdzonym protokołem. Sprawdzić odruch mrugania, aby upewnić się, że zwierzę jest w głębokiej narkozie. Podczas całej procedury należy ściśle monitorować poziom CO₂, pulsoksymetrię oraz temperaturę. Zazwyczaj stosujemy propofol do indukcji, a następnie sewofluran do znieczulenia wziewnego.
3. Wygoić sierść wokół bocznej części stawu kolanowego w miejscu, gdzie zostaną umieszczone elektrody stymulujące (tj. boczna strona kończyny, zaczynając od głowy kości strzałkowej do 2-3 cm dystalnie od krętarza większego).
4. Umieścić psa na stole fizjologicznym w pozycji grzbietowej, tak aby kończyna miedniczna była ustawiona pod kątem prostym między kością udową a piszczelową, a piszczel była równoległa do blatu stołu. Badaniu może zostać poddana kończyna prawa lub lewa.
5. Przed przymocowaniem łapy psa do pedału siłowego należy upewnić się, że pedał jest wolny i może być bezpiecznie obracany. Postępować zgodnie z procedurą włączania zestawu fizjologicznego i aktywować pedał. Uwaga: pedał siłowy powinien stawiać opór („być sztywny”) podczas próby ręcznego poruszenia go przez użytkownika.
6. Delikatnie ułożyć łapę psa w pedale nożnym; zmierzyć i zapisać długość łapy psa od osi obrotu do końca bocznego palca.
7. Zabezpieczyć łapę w pedale nożnym za pomocą elastycznej opaski samoprzylepnej.

3. Izometryczny moment obrotowy skurczu (zgięcie stawu skokowego)

1. Po przeprowadzeniu kontroli bezpieczeństwa podłącz sterylne ekranowane monopolarne elektrody stymulujące o rozmiarze 24-gauge do jednostki izolacji stymulatora (SIU).
2. Ustaw stymulator na: ciągły wyjściowy impuls o częstotliwości 1 Hz (1 impuls na sekundę)
3. Ustawienia oprogramowania: Wczytaj protokół skurczu izometrycznego (na głównym ekranie wybierz Load Protocol). Przycisk Run One powinien być widoczny obok przycisku Begin. Gwarantuje to, że protokół zostanie wykonany tylko raz.
4. W rękawiczkach oczyść skórę alkoholem i zlokalizuj dotykowo nerw strzałkowy wspólny tuż za odcinkiem dystalnym bocznej części proksymalnej kości strzałkowej. Wyznaczając palcem obszar przebiegu nerwu, ostrożnie wprowadź elektrodę katody (czarną) pod skórę, tuż na zewnątrz okostnej. Elektroda powinna zostać umieszczona równolegle do powierzchni skóry na głębokości około 2cm, co zapobiegnie jej przesunięciu po zabraniu ręki.
5. Umieść elektrodę anody (czerwoną) pod skórą, równolegle i nieco bardziej dystalnie w stosunku do elektrody katody. Obie elektrody powinny znajdować się teraz wewnętrznie względem nerwu strzałkowego wspólnego, tuż za głową kości strzałkowej.
6. Aktywuj stymulator z częstotliwością 1 Hz. Obserwuj odpowiedzi drgawkowe na monitorze. Wprowadzaj niewielkie korekty pozycji elektrod, aby uzyskać jak największą amplitudę drgnięcia. Aby zlokalizować najsilniejszą odpowiedź drgawkową, elektrodę należy całkowicie usunąć i ponownie umieścić w odstępach od ½ cm w kierunku równoległym do kości piszczelowej, powtarzając to trzy do czterech razy. Jest to krytyczny element procedury i należy zachować szczególną staranność w celu znalezienia najsilniejszej odpowiedzi.
7. Zarejestruj odpowiedzi drgawkowe, opuszczając ekran Monitor Outputs (wybierz Continue), a następnie wybierz Begin i Done, aby zebrać dane. Zapisz plik pod wybraną nazwą w oknie wyskakującym Save As. Wyłącz stymulator.

4. Izometryczny moment obrotowy tężcowy (zgięcie stawu skokowego)

1. Nie przesuwając elektrod, zmień ustawienia stymulatora na 50 Hz przez 1.5 sec i włącz funkcję zewnętrznego wyzwalacza. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
2. Ustawienia oprogramowania: Do zarejestrowania odpowiedzi tężcowej stosuje się ten sam protokół skurczu izometrycznego , co w przypadku skurczu pojedynczego. Przy założeniu, że elektrody stymulujące nie zostały przesunięte, wybierz Begin oraz Done , aby wywołać tężec. W protokole izometrycznym w celu wywołania tężca stymulator jest uruchamiany przez oprogramowanie, aby zachować prawidłową synchronizację czasową. Zapisz odpowiedź tężcową w oknie wyskakującym Save As .

5. Protokół ekscentryczny

1. Bez przesuwania elektrod zmień ustawienia stymulatora na: 50 Hz przez 1 sec (100V) i włącz funkcję zewnętrznego wyzwalania. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
2. Ustawienia oprogramowania: wczytaj protokół urazu rozciągania ekscentrycznego, polecenie dla serwomotora do obrotu o 29 stopni (maksimum to 30 stopni). Wybierz Run All. Wybierz Begin; wprowadź nazwę pliku głównego dla serii plików ekscentrycznych oraz folder, w którym mają zostać zapisane. Wybierz Start Protocol Series Test, a następnie Done, aby rozpocząć protokół.
3. W tym protokole stymulator jest ustawiony tak, aby był wyzwalany przez oprogramowanie w celu zachowania prawidłowego timingu. W miarę pojawiania się na ekranie odpowiedzi na każde skurcze ekscentryczne, jest ona automatycznie zapisywana.
4. Po każdym zestawie dziesięciu skurczów ekscentrycznych następuje czterominutowy okres odpoczynku.
5. Zbierz łącznie 30 skurczów ekscentrycznych (trzy zestawy po dziesięć skurczów; każdy zestaw oddzielony czterominutowym okresem odpoczynku).

6. Izometryczny moment obrotowy skurczu (wyprost stawu skokowego)

1. Powtórz powyższy protokół drgań, jednak umieść elektrody prostopadle do skóry i proksymalnie w stosunku do pierwotnego rozmieszczenia elektrod dla protokołu zgięcia. Nerw piszczelowy jest stymulowany w miejscu, w którym przebiega kuzaudalnie i dystalnie w obrębie brzuśców mięśnia brzuchatego łydki. Para elektrod stymulujących i referencyjnych jest umieszczana głęboko w obrębie mięśni, kuzaudalnie i tuż proksymalnie w stosunku do stawu kolanowego. Przybliżony punkt umieszczenia znajduje się wzdłuż linii, która przeciwa kąt 90o tworzony przez staw kolanowy. Ponieważ nerw piszczelowy leży głębiej (i kuzaudalnie) niż wspólny nerw strzałkowy, elektrody powinny zostać umieszczone w kilku obszarach, aby wywołać optymalne potencjały drgań. Jest to krytyczny element procedury. Uwaga: zapisy momentu obrotowego dla drgań i tężca stawu skokowego będą wyglądać na odwrócone w stosunku do zapisów zgięcia stawu skokowego.

7. Izometryczny moment obrotowy tężcowy (wyprost stawu skokowego)

1. Nie przesuwając elektrod, zmień ustawienia stymulatora na 50 Hz przez 1,5 sec i włącz funkcję wyzwalania zewnętrznego. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
2. Ustawienia oprogramowania: 50 Hz przez 1,5 sec oraz włączona funkcja wyzwalania zewnętrznego. Pozwala to na aktywację stymulatora przez oprogramowanie.
3. Ustawienia oprogramowania: W przypadku tężca stosuje się ten sam protokół skurczu izometrycznego, co w przypadku pojedynczego skurczu. Przy założeniu, że elektrody stymulujące nie zostały przesunięte, wybierz Begin i Done, aby wywołać tężec.
4. W protokole izometrycznym, w celu wywołania tężca, stymulator jest uruchamiany przez oprogramowanie, aby zachować prawidłowy czas trwania. Zapisz odpowiedź tężcową w wyskakującym oknie Save File.

8. Analiza danych

1. Do uzyskania informacji o momencie obrotowym oraz danych temporalnych zebranych podczas skurczów pojedynczych, tężcowych i ekscentrycznych wykorzystuje się program do dynamicznej analizy mięśni (DMA) (Aurora Scientific).
2. Uruchamianie programu DMA: Oprogramowanie może być okresowo aktualizowane, dlatego poniżej przedstawiono instrukcje dotyczące aktualnej wersji oprogramowania, której używamy. Po otwarciu oprogramowania DMA nie jest ono uruchomione. Aby aktywować program, należy wybrać przycisk z białą strzałką w lewym górnym rogu. Oprogramowanie DMA posiada szereg funkcji, lecz dla naszych potrzeb opisane zostaną jedynie kilka istotnych z nich.
   Ładowanie pliku do analizy: Po uruchomieniu programu DMA pojawia się okno pop-up z pytaniem Reload recent data file or new data file? (Przeładować ostatni plik danych czy nowy plik danych?). Wybierz New (Nowy); w następnym oknie wybierz Labview; w kolejnym oknie wybierz odpowiedni folder i plik, a następnie wybierz Open (Otwórz). Wybierz Remove Filter Plot (Usuń wykres filtra), aby zamknąć to okno. W polu Cut-off Frequency (Częstotliwość odcięcia) wprowadź częstotliwość filtra. Optymalna częstotliwość filtra powinna zostać określona na podstawie konkretnych danych poddawanych ocenie. Przykładowo, dla odpowiedzi izometrycznych stosujemy 30 Hz, a dla odpowiedzi ekscentrycznych 10 Hz. Wybierz przycisk Use filtered data (Użyj danych przefiltrowanych). W sekcji Select Plot Data (Wybierz dane wykresu) wybierz Filtered Force (Siła przefiltrowana). Użyj dwóch suwaków na dole, aby rozszerzyć wyświetlanie i przesuwać się po pliku.
3. Analiza skurczu pojedynczego (Rys 1): Zakładając, że plik został załadowany i wykonano powyższe kroki, ustaw pozycję kursorów: Dostępne są 3 kursory: (1) niebieski, (2) żółty i (3) biały. Dla izometrycznych skurczów pojedynczych i tężcowych lub innych skurczów izometrycznych kursor niebieski ustawia się w punkcie, w którym moment obrotowy wzrasta powyżej wartości spoczynkowej; kursor żółty umieszcza się w miejscu, gdzie moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej (tj. po fazie relaksacji); kursor biały umieszcza się po prawej stronie kursora żółtego (nie jest on wymagany). Kursory można łatwo przesuwać, naciskając lewy przycisk myszy i przeciągając wybrany kursor do pożądanej pozycji.
   Przeprowadzenie analizy: Po ustawieniu kursorów wybierz Do Muscle Analysis (Wykonaj analizę mięśni), a następnie Show Results (Pokaż wyniki). W oknie pop-up Analyzed Muscle Data Results (Wyniki analizy danych mięśniowych) wyświetlanych jest szereg zmiennych, takich jak Maximum Force (Siła maksymalna); Baseline Force (Siła bazowa); ½ Relaxation Time (Połowa czasu relaksacji) itp. Dane są prezentowane dla odpowiedzi momentu obrotowego, która znajduje się między kursorami 1 (niebieskim) a 2 (żółtym). Wszystkie te zmienne lub wybrane z nich mogą zostać zapisane w pliku danych, jednak proces ten nie został tutaj opisany. Jeśli logowanie danych nie jest skonfigurowane, dane należy zapisać ręcznie. Wybierz Close Window (Zamknij okno), aby powrócić do głównego ekranu. Wybierz Exit Program (Wyjdź z programu), aby zamknąć DMA, a następnie wybierz białą strzałkę, aby rozpocząć analizę nowego pliku.
4. Analiza tężca (Rys 2): Należy wykonać te same kroki, które opisano powyżej dla skurczu pojedynczego.
5. Analiza ekscentryczna (Rys 3): Analiza ekscentryczna wymaga więcej kroków konfiguracyjnych i wykorzystuje wszystkie 3 kursory. Jeśli odpowiedź momentu obrotowego w skurczu ekscentrycznym jest ujemna (tj. zapis momentu obrotowego przebiega w dół), można ją odwrócić, wpisując -1 w polu Reference Area (sq cm) (Powierzchnia referencyjna [cm²]) (wartości momentu obrotowego pozostają bez zmian) i wybierając Do not normalize (Nie normalizuj); przycisk zmienia stan, wskazując, że dane zostały znormalizowane (w tym przypadku odwrócone). Wprowadź pożądaną Cut Off Frequency (Częstotliwość odcięcia) (np. 10 Hz) i wybierz Use unfiltered data (Użyj danych niefiltrowanych), aby zmienić przycisk na Use filtered data (Użyj danych filtrowanych), dzięki czemu do analizy użyte zostaną dane przefiltrowane. Ustaw kursor niebieski w punkcie, w którym izometryczny moment obrotowy zaczyna wzrastać powyżej wartości spoczynkowej; ustaw kursor żółty w punkcie, w którym moment obrotowy rozciągania ekscentrycznego zaczyna wzrastać powyżej plateau izometrycznego (patrz rysunek poniżej); ustaw kursor biały w miejscu, w którym moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej. Wybierz Do Muscle Analysis (Wykonaj analizę mięśni), a następnie Show Results (Pokaż wyniki). W oknie pop-up Analyzed Muscle Data Results można wybrać dane między kursorami 1 (niebieskim) a 2 (żółtym) dla danych momentu obrotowego izometrycznego lub między kursorami 2 (żółtym) a 3 (białym) dla danych momentu obrotowego ekscentrycznego. Wszystkie te zmienne lub wybrane z nich mogą zostać zapisane w pliku danych, jednak proces ten nie został tutaj opisany. Jeśli logowanie danych nie jest skonfigurowane, dane należy zapisać ręcznie. Wybierz Close Window (Zamknij okno), aby powrócić do głównego ekranu. Wybierz Exit Program (Wyjdź z programu), aby zamknąć DMA, a następnie wybierz białą strzałkę, aby rozpocząć analizę nowego pliku.

9. Reprezentatywne wyniki

1. Moment obrotowy drgania: Stymulacja nerwu piszczelowego (1 Hz) aktywowała pojedyncze drgania mięśni prostowników stawu skokowego (Rys 1). Należy zauważyć, że oś Y wskazuje „siłę”; moment obrotowy (iloczyn siły i odległości) jest obliczany przez użytkownika. Mierzymy długość łapy (od osi obrotu do końca palca bocznego). Długość ta stanowi odległość (ramię dźwigni) wykorzystywaną do wyznaczenia momentu obrotowego (N-m).
2. Izometryczny moment obrotowy tężcowy (wyprost stawu skokowego): stymulacja nerwu piszczelowego wywołała tężec mięśni prostowników stawu skokowego (seria impulsów 50 Hz trwająca 1,5 s). Do kontroli czasu stymulacji i rejestracji odpowiedzi momentu obrotowego wykorzystano oprogramowanie komputerowe Dynamic Muscle Control (DMC, Aurora Scientific, Inc.) (Rys 2).
3. Protokół ekscentryczny: Skurcze ekscentryczne przeprowadzono w mięśniach zginaczach stawu skokowego. Przezskórna stymulacja nerwu strzałkowego aktywowała początkowy skurcz izometryczny, po którym nastąpił obrót stawu powodujący wydłużenie aktywowanych mięśni zginaczy (skurcz ekscentryczny; Rys 3).⁶

Rycina 1. Rozmieszczenie niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) kursora w celu analizy skurczu. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu oprogramowania DMA dla skurczu wyprostu stawu skokowego u zdrowego psa o masie 13 kg. Należy zauważyć, że w celu przeprowadzenia dalszej analizy przez oprogramowanie, dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, a wartość siły (pokazana na rysunku jako Force (g)) może zostać przeliczona na moment obrotowy (N-m). Moment obrotowy oblicza się jako iloczyn siły i długości ramienia dźwigni (w tym przypadku dystans = długość mierzona od osi obrotu do bocznego palca łapy).

Rycina 2. Rozmieszczenie niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) kursora w celu analizy tężca. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z oprogramowania DMA dla tężca wyprostu stawu skokowego u tego samego zwierzęcia, co pokazano na Ryc. 1.

Rysunek 3. Umiejscowienie niebieskiego (#1), żółtego (#2) i białego (#3) kursora w celu analizy skurczu ekscentrycznego z uszkodzeniem rozciągającym. Przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z oprogramowania DMA dla pojedynczego skurczu ekscentrycznego z uszkodzeniem rozciągającym u zdrowego psa o masie 13 kg. Początkowy plateau (zielona linia) ilustruje fazę izometryczną skurczu. Po fazie izometrycznej następuje faza ekscentryczna (rozciąganie), co obrazuje gwałtowny szczyt na zielonej linii. Powtarzane skurcze ekscentryczne zazwyczaj prowadzą do stałego spadku momentu obrotowego w fazie izometrycznej.

Dyskusja

Niniejszy protokół jest stosowany do oceny funkcji mięśni dużych zwierząt in vivo w celu analizy, dokumentacji i określenia skuteczności interwencji terapeutycznych lub w celu udokumentowania cech biologicznych progresji choroby.^1-6 Pozycjonowanie zwierzęcia, ułożenie kończyn oraz rozmieszczenie elektrod są kluczowymi zmiennymi, które istotnie wpływają na wyniki. W badaniu wstępnym wartości średniego stężenia pęcherzykowego (MAC) dla izofluranu nie wpływały znacząco na pomiary siły (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, dane niepublikowane, 1993). Sprzęt i oprogramowanie są dostępne w sprzedaży, a metody są dobrze ugruntowane.^{7,1,2,8,4,9-11,6,12} Zaleca się, aby użytkownicy pozyskali i wykorzystali opisane powyżej oprogramowanie i sprzęt podczas stosowania tego protokołu.

Modyfikacje: ograniczenia obecnego serwomotoru obejmują masę ciała wynoszącą około 23 kg oraz długość łapy 20cm. Należy zauważyć, że limit momentu obrotowego dla opisanego tutaj przetwornika momentu (model 310LR) wynosi ~8 N-metrów. Wartość ta może zostać przekroczona przez zdrowe psy w wieku 6 miesięcy lub starsze. Możliwe modyfikacje obecnego protokołu obejmują aktualizację oprogramowania oraz zwiększenie zakresu momentu obrotowego przetwornika. Firma Aurora Scientific produkuje urządzenie do pozycjonowania kończyn dla dużych zwierząt, które może zastąpić ramę stereotaktyczną użytą w obecnym protokole. Metoda ta została z sukcesem zastosowana w innych modelach zwierzęcych, w tym u naczelnych niebędących ludźmi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elektrody stymulujące	Teca	25mmx26G	Jednorazowe sterylne monopolarne elektrody igłowe
Stymulator	Grass Technologies	S88X
Jednostka izolacji bodźca	Grass Technologies	SIU-C
System dźwigni mięśniowej	Aurora Scientific	310C-LR	Opcja z płytką stopową
Interfejs sygnałowy	Aurora Scientific	Series 604A
Oprogramowanie Dynamic Muscle Control & Analysis	Aurora Scientific	Aurora Scientific
Komputer/Monitor	Aurora Scientific	Komputer z systemem Windows XP
Urządzenie do pozycjonowania kończyny	Aurora Scientific	NA	Może zostać zastąpione ramą stereotaktyczną
Stół	Northstar Customs, LLC	NA	Stół wykonany na zamówienie
Elastyczna opaska do mocowania łapy do pedału	Andover	PetFlex(5cmx2m)	Może być użyta ponownie raz lub dwa razy