Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Podsumowanie

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Streszczenie

Badanie struktury makrocząsteczek stało się kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów i funkcji molekularnych. Istnieje kilka ograniczonych, lecz istotnych instrumentów bioanalitycznych zdolnych do testowania zależności cech strukturalnych białek od przyłożonej siły. Skala była parametrem ograniczającym dokładność, z jaką badacze mogą analizować nanomechaniczny świat cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, enzymy i białka motorowe wykonujące niezbędne do życia prace. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest dobrze dostosowana do określania natywnych struktur białek włóknistych z rozdzielczością przestrzenną porównywalną z mikroskopią elektronową. Jednak w badaniach siłowych AFM stosowane siły są zazwyczaj znacznie wyższe niż te, których może doświadczyć pojedyncza cząsteczka ^{1, 2}. Pułapki optyczne (OT) bardzo dobrze nadają się do wyznaczania względnej odległości między uwięzionymi kuleczkami i mogą wywierać bardzo małe siły ³. Nie pozwalają one jednak na precyzyjne określenie bezwzględnej długości badanych cząsteczek. Symulacje molekularne dostarczają pomocniczych informacji dla takich eksperymentów, ale ich możliwości są ograniczone w zakresie obsługi tak dużych rozmiarów cząsteczek i długich ram czasowych, a w przypadku braku innych dowodów pomocniczych nie przekonują niektórych badaczy^{2, 4}.

Spektrometr siły grawitacyjnej (GFS) wypełnia krytyczną lukę w arsenale badacza, oferując unikalny zestaw możliwości. Instrument ten jest zdolny do generowania sił zazwyczaj z dokładnością 98% lub wyższą, w zakresie od femtonิวtonów do nanonิวtonów. Obecnie pomiary odległości pozwalają na wyznaczenie bezwzględnej długości cząsteczkowej z rozdzielczością do pięciu nanometrów oraz względnych odległości między parami kulek z precyzją zbliżoną do pułapki optycznej. Ponadto GFS może określać stopień rozciągania lub rozwijania w warunkach, gdy siła jest bliska stanu równowagi, lub dostarczać stopniowaną siłę w celu zestawienia jej ze zmierzonymi zmianami strukturalnymi. Możliwe jest nawet określenie liczby reszt aminokwasowych biorących udział w zdarzeniach rozwijania pod fizjologicznym obciążeniem siłą ². W przeciwieństwie do innych metod, w których każdemu badaniu musi poprzedzać obszerna kalibracja siły, GFS nie wymaga takiej kalibracji ⁵. Uzupełniając zalety innych metod, GFS pozwoli wypełnić luki w rozumieniu nanomechaniki kluczowych białek i innych makromolekuł.

Protokół

Wprowadzenie do nowej konfiguracji GFS

GFS składa się z kilku niezbędnych elementów: zwykłego mikroskopu świetlnego, montażu paralaktycznego, kamery oraz komputera [Rysunek 1]. Zgodnie z konstrukcją GFS, niezbędna jest również szczelna komora przepływowa, w której znajduje się próbka. Mikroskop świetlny jest zamontowany na montażu paralaktycznym, co umożliwia obracanie urządzenia w różnych orientacjach w przestrzeni. Zdolność ta pozwala na wykorzystanie statycznego wektora grawitacji, dzięki czemu próbki mogą być dynamicznie orientowane względem wektora, co pozwala sile grawitacji wywierać na próbki obciążenia siłowe z zakresu piconewtonów. Kamera zastępuje okular mikroskopu świetlnego, aby mogła rejestrować zmiany orientacji próbki. Te surowe dane są digitalizowane i przetwarzane przez komputer w celu interpretacji danych na rzeczywiste pomiary siły i odległości. Szczelna komora przepływowa została zaprojektowana tak, aby umożliwić pełną swobodę ruchu w przestrzeni bez utraty próbki. W komorze znajduje się cząsteczka próbki, która jest przytwierdzona jednym końcem do „zakotwiczonego” koralika przyklejonego do powierzchni komory. Przeciwny koniec jest przytwierdzony do koralika „mobilnego”, który nie styka się z powierzchnią komory. To właśnie ten koralik mobilny, swobodnie zawieszony w buforze do analizy, może podlegać działaniu siły grawitacji, rozciągając w ten sposób przytwierdzoną cząsteczkę przy tak niskich obciążeniach siłowych [Rysunek 2]. Pod mikroskopem próbka wygląda po prostu jak para mikrosfer, choć potrzeba pewnego doświadczenia, aby odróżnić użyteczne pary połączone cząsteczką od par, w których oba koraliki spoczywają na powierzchni komory przepływowej. Jedną z modyfikacji systemu jest dodanie pływającej platformy, na której znajduje się GFS, zawieszonej na sprężynach. W tej konfiguracji, po obróceniu próbki do pozycji, w której siła grawitacji może na nią działać, platformę wraz ze wszystkimi komponentami można opuścić przeciwko stałej sprężystości. W stanie zbliżonym do swobodnego spadania siła działająca na koralik mobilny jest bliska zeru, a przy maksymalnym rozciągnięciu sprężyn siła grawitacji zostaje zwiększona nawet dwukrotnie. W ten sposób można wykreślić stopniową odpowiedź siła/odległość, aby zmierzyć zachowanie pojedynczej cząsteczki przy różnych obciążeniach siłowych.

1. Przygotowanie mikrosfer

1. Zanurzyć około 10 mg kulek szklanych lub krzemionkowych w 0,04% 3-aminopropylotrietoksysilanie (rozcieńczonym w acetonie) na dwie minuty.
2. Przepłukać dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie wirować w celu osadzenia przy 2000 X G przez 5 minut. Odlać nadsącz.
3. Dodać 5 mL buforu sprzęgającego (0,01 M pirydyny rozcieńczonej wodą dwukrotnie destylowaną z pH dostrojonym do 6,0) i energicznie wstrząsnąć mieszaniną. Wirować zgodnie z powyższym opisem. Powtórzyć ten krok trzy razy.
4. Do wilgotnego osadu kulek dodać 2 mL 5% roztworu aldehydu glutarowego (rozcieńczonego w buforze sprzęgającym). Energicznie wstrząsnąć.
5. W dygestorium rotować mieszaninę kulek i aldehydu glutarowego przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Wirować jak wyżej i odessać nadsącz.
7. Przemyć kulki w 5 mL buforu sprzęgającego, energicznie wstrząsając, a następnie wirować i odessać nadsącz. Powtórzyć tę czynność jeszcze trzy razy.
8. Dodać do kulek około 15 μL pożądanego przeciwciała i energicznie wstrząsnąć. Kulki należy rotować przez 16-24 godziny.
9. W dygestorium dodać 5 mL 1 M roztworu wygaszającego glicyny (rozcieńczonej wodą dwukrotnie destylowaną z pH dostrojonym do 7,0). Energicznie wstrząsnąć mieszaniną i rotować przez 30 minut.
10. Wirować i odessać nadsącz.
11. Dodać 5 mL buforu piorącego (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% azydku sodu; 0,1% BSA; 0,15 M NaCl oraz 0,001 M EDTA). Energicznie wstrząsnąć, wirować i odessać nadsącz. Powtórzyć ten krok jeszcze trzy razy.
12. Zmienić bufor na bufor niskosolny (0,1 M KCl; 0,02 M imidazol; 5 mM MgCl₂; pH dostrojone do 7,0). Powtórzyć trzy razy.

2. Przyczepianie próbek do mikrosfer

1. Pobrać niewielką ilość przygotowanych kuleczek (około 2 μL z każdego aglomeratu kuleczek, jednak w przypadku dużej różnicy w średnicy między partiami korzystnie jest zastosować stosunek kuleczek dużych do małych wynoszący około 8:1) i dodać je do probówki do mikrocentryfugi zawierającej bufor do analizy. Zmniejszyć stężenie białka do około 5 μM, korzystając z buforu do analizy. Przygotować objętość całkowitą wynoszącą co najmniej 400 μL, wliczając bufor, białko oraz kuleczki.
2. Mieszać tę mieszaninę w rotatorze z prędkością około 1 RPM przez 3 godziny (zbyt intensywne mieszanie białka doprowadzi do jego agregacji i utraty aktywności).

3. Przygotowanie komory na szkiełku

1. Pokryć grube szkiełko przedmiotowe 0,01% nitrocelulozą (w octanie amylu). Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na około 10 minut.
2. Za pomocą ostrego przecinaka do szkła wyciąć szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby utworzyć komorę. Wymaga to czterech pasków szkła.
3. Wykorzystać fabryczną krawędź szkła i przeciągnąć ją przez smar próżniowy po obu stronach krawędzi.
4. Docisnąć pokryte smarem paski do wysuszonego szkiełka pokrytego nitrocelulozą, aby utworzyć ramkę na powierzchni szkiełka.
5. Nanieść pipetą około 2 μL mieszaniny kuleczek/białek, dotykając końcówką pipety powierzchni szkła wewnątrz ramki.
6. Dodać około 20-400 μL buforu niskosolowego, w zależności od wielkości komory.
7. Docisnąć na wierzchu ramki szkiełko nakrywkowe, które zostało uprzednio pokryte smarem próżniowym, aby ukończyć tworzenie szczelnej i buforowanej komory.
8. Pozostawić szkiełko w poziomym ustawieniu, aby kuleczki miały wystarczająco dużo czasu na zakotwiczenie się w nitrocelulozie.

4. Pozyskiwanie danych GFS

1. Zamocuj preparat na stoliku GFS
2. Monitoruj obraz z kamery GFS i szukaj właściwych „par kuleczek”, w których mała mikrosfera jest przyczepiona w pobliżu równika dużej mikrosfery.
3. Po znalezieniu potencjalnej pary kuleczek, sprawdź głębię ostrości, aby upewnić się, że kuleczka „ruchoma” nie spoczywa na powierzchni szkiełka.
4. Po zidentyfikowaniu odpowiedniej pary, zanotuj kąt odchylenia kuleczki ruchomej od d_max (d_max = maksymalna odległość między centroidami sprzężonych mikrosfer). Przesuń mikroskop do pozycji umożliwiającej rejestrację wideo.
5. Kąt przesunięcia GFS powinien być wystarczający do zarejestrowania d_min, d_max i ponownie d_min, co w zależności od długości cząsteczki może wymagać zakresu od 25 do 90 stopni.
6. NAGRAJ przebieg ruchu pary od d_min do d_max i z powrotem do d_min.
7. Zaleca się również nagranie filmu tła, aby móc go później odjąć podczas analizy.
8. W przypadku wykonywania zrzutu GFS, przesuń mikroskop z powrotem do d_max i nagraj zrzut z częstotliwością co najmniej 60 klatek na sekundę. Kluczowa jest pierwsza oscylacja, jednak dłuższy czas nagrywania może być wykorzystany do badań dynamicznych.

5. Analiza danych GFS

1. Przekształć surowe nagranie w cyfrowo „zaprogowany” obraz i uruchom makro w programie ImageJ, aby wyznaczyć pozycję centroidu każdego koralika w każdej klatce filmu. Należy to zrobić również dla filmu z kroplą.
2. Przenieś dane X, Y oraz powierzchnię z programu ImageJ do programu Excel i wykreśl punkty.
3. Jeśli w filmie zarejestrowano właściwą parę koralików, wyraźne wybrzuszenie na wykresie wskazuje, że koraliki znajdują się najbliżej siebie (d_min), a wierzchołek wykresu odpowiada pozycji d_max.
4. Wykorzystując te dane, należy precyzyjnie wyznaczyć w programie ImageJ promień każdego koralika, a następnie wprowadzić wszystkie te informacje do zagnieżdżonego równania:
   d = [(g sin α)² + (g cos α + d_max - g)²]^0.5
   g = [d_min² + r_b ² - (r_a + r_b)²]^0.5 = r_b sin β
   c = d_max - r_a - g
   (d = odległość między centroidami; g = siła grawitacji; α = kąt w stopniach równoległy do obiektywu; r_b = promień koralika ruchomego; r_a = promień koralika zakotwiczonego; β = kąt przyczepienia poza osią równika koralika zakotwiczonego).
5. Wykorzystując dopasowany promień koralika ruchomego, który pozwala również wyznaczyć jego objętość, oraz znając gęstość koralika, można obliczyć siłę, jaką koralik ruchomy wywiera na cząsteczkę w piconewtonach, po odjęciu wyporności rozpuszczalnika. Metoda ta mierzy siłę działającą na przywiązaną cząsteczkę w piconewtonach i oblicza bezwzględną długość cząsteczki między punktami przyczepienia przeciwciał w nanometrach. F = V (d-b) a (F = siła, V = objętość, d = gęstość szklanej mikrosfery, a = przyspieszenie ziemskie, b = gęstość wypartej wody).

6. Reprezentatywne wyniki:

Jeśli przygotowanie kulek zostanie wykonane prawidłowo, agregacja będzie minimalna, choć nadal mogą wystąpić sporadyczne skupiska kulek. Podczas obserwacji pod mikroskopem w komorze powinien być widoczny odpowiedni rozkład kulek, niezależnie od tego, czy występują one w parach.

Ważne jest, aby w maksymalnym stopniu zminimalizować wibracje; w tym celu do izolacji drgań można wykorzystać stół pneumatyczny, specjalne stopy amortyzujące do statywu utrzymującego montaż EQ lub system wykorzystujący sprężyny.

Kolejną przydatną wskazówką dotyczącą uszczelnionej komory przepływowej jest pozostawienie jej na około pięć minut na płaskim stole po całkowitym zmontowaniu. Pozwala to nieprzymocowanym, większym kuleczkom opaść przez bufor i osiąść w warstwie nitrocelulozy. Gdyby preparat zamontowano bezpośrednio po zakończeniu prac, badacz musiałby nieustannie mierzyć się z kuleczkami dosłownie przelatującymi przez pole widzenia; jeśli dzieje się to podczas rejestracji wideo, może to zafałszować wynik eksperymentu. Prawidłowe przeprowadzenie tej czynności znacząco minimalizuje przemieszczanie się kuleczek, co przekłada się na czystsze nagrania wideo.

Gdy operator GFS zidentyfikuje potencjalną parę kulek, warto poddać ją wstępnej rotacji, aby monitorować zachowanie tej pary. Rzadko zdarza się, że większa kulka nie jest mocno przymocowana do szkiełka. W takim przypadku nie ma sensu wykorzystywać tej pary, ponieważ kluczowe jest, aby większa, zakotwiczona kulka pozostawała w stałej pozycji przez cały czas trwania akwizycji. Jeśli para jest stabilna i nie wykazuje zjawiska „toczenia się zakotwiczonej kulki”, nadaje się ona do eksperymentów.

Do oceny pozyskanych danych można wykorzystać wykres odległości separacji kulek w funkcji zmiany kąta względem siły grawitacji. Reprezentatywny wynik powinien wykazać niewielką separację na plateau, a w miarę uwalniania się ruchomej kulki od kulki zakotwiczonej pod wpływem grawitacji, wykres będzie wskazywał coraz większą separację. Proces ten trwa aż do osiągnięcia wyraźnego szczytu, zwanego d_max, po czym krzywa zaczyna ponownie opadać, powracając do linii bazowej d_min [Rycina 1]. W idealnych warunkach sygnatura ta jest symetryczna. Wynik niereprezentatywny objawiałby się wykresem z niespójnymi wzorami, w których nie występuje wyraźny schemat d_min-d_max-d_min; lub wskazywałby separacje o rzędy wielkości zbyt wysokie dla pojedynczej cząsteczki, co sugerowałoby obecność zanieczyszczeń (np. pyłu) między kulkami lub fakt, że ruchoma kulka w ogóle nie była przytwierdzona. Proces wyszukiwania pary, jej obrazowania, przetwarzania i analizy zawiera wiele etapów kontrolnych, na których odrzucane są nieprawidłowe pary kulek. Zatem, jeśli po przejściu całego procesu długość cząsteczki jest zgodna z poprzednimi wynikami, można mieć dużą pewność, że pierwotna para kulek była reprezentatywna i może zostać wliczona do wyników. Przy pomyślnym przebiegu eksperymentu około połowa obrazowanych par kulek może stać się wiarygodnym punktem danych. Na przykład wiadomo z danych EM i AFM, że długość zwiniętej helisy (coiled coil) miozyny między przeciwciałami MF20 a MF30 wynosi około 100 nm ^2,7,8,9. Jeśli wynik jest kilkukrotnie większy od tej wartości, oznacza to agregację próbki. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą ze standardowych eksperymentów rotacyjnych GFS i wykazują odległość 96 nm ± 5 nm [Rycina 2], co jest blisko zgodne z odległością separacji przeciwciał MF30 (wiążącego się z N-końcem subfragmentu-2 miozyny) i MF20 (wiążącego się z lekką meromiozyną) na miozynie, wywnioskowaną z wartości literaturowych [Rycina 3].

Rycina 1. Konfiguracja GFS. Oznaczono główne elementy GFS.

Rycina 2. Schemat zasady działania GFS. Lewa strona przedstawia środek ciężkości ruchomej kuleczki w minimalnej odległości od środka ciężkości kuleczki zakotwiczonej. Podczas obrotu GFS ruchoma kuleczka ustawia się zgodnie z wektorem grawitacji, który przebiega równolegle do osi przywiązanegot cząsteczki. W tej pozycji odległość między środkami ciężkości kuleczki ruchomej i zakotwiczonej jest maksymalna. W prawym górnym rogu znajduje się reprezentatywny kadr z filmu GFS. W prawym dolnym rogu widoczny jest obraz GFS poddanego rotacji.

Rysunek 3. Reprezentatywny wynik pokazujący d_min po lewej stronie wykresu; d_max przy względnym oddaleniu 17,78 mikronów; oraz powrót do d_min w okolicach linii bazowej wynoszącej około 17,75 mikronów względnego oddalenia między kuleczkami.

Rysunek 4. Reprezentatywny wynik eksperymentu rotacji GFS, wykazujący, że średnia odległość między przeciwciałami MF20 i MF30 wynosi 96 nm. Odpowiada to przybliżonej długości S2.

Rycina 5. Dimer miozyny II wykorzystany do pokazania możliwych miejsc przyłączenia do GFS, w tym przyłączeń przeciwciał i/lub aktyny. Różne możliwości przyłączenia pozwalają na zastosowanie różnych strategii GFS w celu pomiaru różnych regionów lub przyłożenia siły prostopadle lub równolegle do domeny pręcikowej dimeru miozyny.

Dyskusja

Podczas konwersji filmu na reprezentację z progowaniem cyfrowym kluczowe jest, aby obraz po progowaniu zachowywał ten sam obszar w każdej klatce wideo. Ponieważ koraliki w parze poruszają się niezależnie od siebie, wszelki dryft w obszarach poddanych progowaniu może również spowodować dryft względnych odległości między centroidami koralików i wprowadzić znaczący błąd. Kontrola obszaru progowania pozwoliła pięciokrotnie zredukować błąd w pomiarach odległości, z 26 nm do 5 nm. Równie istotne jest uzyskanie dokładnego pomia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropylotrietoksysilan	Polysciences, Inc.	919-30-2
Aceton	Fisher Scientific	A18P-4
Pirydyna	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyd	Fisher Scientific	G7776
Glicyna	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Azydek sodu	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	niestabilność mikrosatelitarna	E9884
Azotanu celulozy	Sigma-Aldrich	60443
N,N-dimetyloformamid	Wyodrębniono z dużego nowego	D4254
Miozyna II szkieletowa królika	króliki rasy nowozelandzkiej białej (7-8)	ND
przeciwciało MF30 (9-10)	Bank Hybrydom Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
przeciwciało MF20 (6)	Bank hybridomów	MF20
Mikroskop laboratoryjny	Borealny	WW57905M00
Montaż paralaktyczny	Celestron	CG-5
Cyfrowa kamera wideo	Sony Corporation	XCDV60
Zwolnienie zacisku	Cabelas	IA-415482
Sprężyna ściskania	Jones Spring Co.	723
Sprężyna rozciągająca	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	ND
Sterowniki Fire-i &zastosowanie	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	ND