Artykuł metodologiczny

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

29.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2625

⸱

24 marca 2011

 , 
1Human Genetics, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Streszczenie

Procesy komórkowe, takie jak montaż chromosomów, segregacja i cytokineza, są z natury dynamiczne. Obrazowanie time-lapse żywych komórek z wykorzystaniem znakowanych fluorescencyjnie białek reporterowych lub mikroskopii kontrastowej różnicowej (DIC) umożliwia badanie czasowego przebiegu tych dynamicznych zdarzeń, który w przeciwnym razie jest wnioskowany z analizy próbek utrwalonych1,2. Ponadto badanie regulacji rozwojowej procesów komórkowych wymaga przeprowadzania eksperymentów time-lapse na nienaruszonym organizmie podczas rozwoju. Embrion Caenorhabditis elegans jest przezroczysty dla światła i posiada szybki, niezmienny program rozwojowy o znanej linii komórkowej3, co czyni go idealnym modelem eksperymentalnym do badania zagadnień z zakresu biologii komórki4,5 oraz rozwoju6-9. C. elegans poddaje się manipulacjom genetycznym za pomocą genetyki forward (opartej na randomowej mutagenezie10,11) oraz genetyki reverse w celu celowania w konkretne geny (opartej na interferencji RNAi i mutagenezie celowanej12-15). Dodatkowo można łatwo tworzyć zwierzęta transgeniczne wykazujące ekspresję białek lub reporterów znakowanych fluorescencyjnie16,17. Cechy te łącznie ułatwiają identyfikację ścieżek genetycznych regulujących fundamentalne procesy komórkowe i rozwojowe in vivo18-21. W niniejszym protokole przedstawiamy metody obrazowania na żywo embrionów C. elegans przy użyciu optyki DIC lub fluorescencji GFP w mikroskopie epifluorescencyjnym. Demonstrujemy, z jaką łatwością powszechnie dostępne mikroskopy, zazwyczaj stosowane do obrazowania próbek utrwalonych, mogą być również wykorzystywane do analizy time-lapse z użyciem oprogramowania open-source w celu automatyzacji procesu obrazowania.

Protokół

Przygotowanie nicieni

  1. Przenieść larwy robaków w stadium L4 na odpowiednie płytki od 18 do 24 godzin przed obrazowaniem.22Zapewni to dostęp do jajnosnych osobników dorosłych, co umożliwi pozyskanie odpowiedniej ilości wczesnych embrionów.
  2. Przygotuj probówki z wazeliną i agarozą. Przygotowujemy kilka probówek typu Falcon o pojemności 15 ml, rozpuszczając wazelinę w zlewce w kuchence mikrofalowej i rozlewając ją w ilości 4–5 ml na probówkę. W podobny sposób rozpuść 2–3% (w/v) agarozy w buforze (bufor M9 lub bufor jajeczny) i rozlej po 4–5 ml do probówek typu Falcon. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego wrzenia, co pozwoli zminimalizować parowanie. W dniu obrazowania rozpuść jedną probówkę wazeliny w 65-70°C użyć bloku grzewczego i rozpuścić 1 probówkę agarozy w mikrofalówce, pamiętając o zachowaniu ostrożności, aby zapobiec wykipieniu. Przechowywać probówki w bloku grzewczym, aby utrzymać wazelinę i agarozę w stanie ciekłym.
  3. Przygotowanie podkładki agarozowej. Umieść nowy preparat szkiełkowy pomiędzy dwiema szkiełkami prowadzącymi, które są oklejone pojedynczą warstwą zwykłej taśmy laboratoryjnej na górnej i dolnej krawędzi każdego szkiełka. Używając pipety Pasteura z odłamanym końcem, nanieś 2-3 krople stopionej agarozy na nowy preparat. Przykryj to 2nd przesuń go prostopadle do pierwotnego slajdu, tak aby przykrył i pomógł rozprowadzić agarozę w celu utworzenia cienkiej, kwadratowej płytki. 2nd slajd powinien spoczywać nad taśmą na prowadnicach slajdów. Stężenie agarozy można zwiększyć do 5% w przypadku grubszych podkładek.
  4. Używając stereomikroskopu i platynowej igły, przenieś 2 dorosłe nicienie do 9-12μL kropla pożywki M9 lub buforu do jajeczek (Egg Buffer) na szkiełku nakrywce o wymiarach 18 mm x 18 mm.
  5. Przetnij dżdżownice igłą (stosujemy igły 27G1/2) lub skalpelem, aby uwolnić zarodki. Staraj się przecinać dżdżownice w ich środkowej części.
  6. Połóż żel agarowy (stroną z agarem dołu) na szkiełku nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm zawierającym embriony. Odetnij wystający poza krawędź szkiełka agar za pomocą żyletki.
  7. Uszczelnij szkiełko nakrywką, nakładając za pomocą pędzelka lub cienkiego drewnianego patyczka roztopioną wazelinę na wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywki.

Alternatywą dla preparatów w agarze są krople zawieszone23, jeśli embriony są wrażliwe na nacisk (np. gdy skorupa jaja nie formuje się prawidłowo). Obrazowanie można również przeprowadzić in utero, aby śledzić zapłodnienie lub wczesne zdarzenia, takie jak mejoza. Nicienie należy znieczulić lewamisolem24. Aby zwiększyć liczbę embrionów z konkretnego etapu rozwoju, można jednocześnie przeprowadzić sekcję kilku nicieni, a następnie delikatnie umieścić embriony razem, używając pipety z cienką końcówką, pędzelka z rzęs lub pipetując ustami.

Filmy 4D DIC (Differential Interference Contrast) metodą Nomarskiego

  1. Włącz mikroskop Olympus BX61. Ponieważ kamera jest wrażliwa na fale elektromagnetyczne emitowane przez inne urządzenia, włącza się ją na samym końcu, natomiast żarówkę rtęciową (jeśli jest wymagana do obrazowania GFP lub fluorescencji) w pierwszej kolejności. Po włączeniu wszystkich urządzeń uruchom program Micro-Manager. Wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny dla obrazowania DIC lub fluorescencyjnego. Główną różnicą jest to, że plik DIC nie obejmuje sterowania migawką fluorescencyjną. Każdy plik wybiera również odpowiednią kostkę filtru oraz ustawienie wzmocnienia kamery.
  2. Zlokalizuj embriony pod mikroskopem, korzystając z obiektywu 10x. Szukaj grup młodych embrionów w pobliżu ciał nicieni, aby uchwycić wiele zarodków w jednym polu widzenia. Aby uzyskać najlepsze obrazy, unikaj embrionów znajdujących się wewnątrz organizmu nicienia.
  3. Za pomocą oprogramowania przełącz na obiektyw o większym powiększeniu (od 40x do 10x) i rozdzielczości (N.A. od 0,9 do 1,4) w celu wykonania obrazowania.
  4. Regulacja optyki DIC Nomarskiego (poniższe strony internetowe zawierają pomocne wyjaśnienia dotyczące optyki DIC oraz zastosowanej terminologii; Kontrast interferencyjny różnicowy (DIC) Mikroskopia DIC (kontrast interferencyjny różnicowy) jest techniką obrazowania, która pozwala na uzyskanie wysokiego kontrastu w próbkach przezroczystych i bezbarwnych bez konieczności stosowania barwników lub utrwalania próbek. Technika ta tworzy obraz, który wygląda, jakby próbka była trójwymiarowa i oświetlona z boku, co pozwala na wyraźne uwidocznienie krawędzi i struktur wewnętrznych. Zasada działania DIC W przeciwieństwie do standardowej mikroskopii pola jasnego, gdzie światło przechodzi bezpośrednio przez próbkę, mikroskopia DIC wykorzystuje zjawisko polaryzacji i interferencji światła. Kluczowe komponenty systemu DIC obejmują: 1. Polaryzator: Przekształca światło z lampy w światło spolaryzowane liniowo. 2. Pryzmat Nomarskiego (lub pryzmat Wollaston): Rozdziela wiązkę światła na dwie oddzielne wiązki, przesunięte względem siebie o bardzo małą odległość (mniejszą niż rozdzielczość mikroskopu). 3. Próbka: Gdy dwie równoległe wiązki przechodzą przez próbkę, każda z nich przechodzi przez nieco inny obszar. Jeśli w próbce występują różnice w gęstości lub współczynniku załamania światła, prędkość wiązek zmienia się w różny sposób. 4. Analizator: Drugi polaryzator, który łączy obie wiązki z powrotem. W miejscach, gdzie nastąpiła zmiana fazy z powodu przejścia przez próbkę, wiązki interferują ze sobą, co generuje obraz o wysokim kontraście. Zalety mikroskopii DIC - Obrazowanie żywych komórek: Ponieważ nie wymaga barwienia, DIC jest idealny do obserwacji dynamicznych procesów w żywych organizmach. - Efekt 3D: Dzięki gradientom jasności obraz przypomina rzeźbę, co ułatwia analizę morfologiczną. - Wysoka rozdzielczość osiowa: DIC pozwala na uzyskanie lepszego kontrastu w grubszych próbkach w porównaniu do mikroskopii fazowej. - Brak pierścieni fazowych: W przeciwieństwie do mikroskopii fazowej, obraz DIC nie posiada charakterystycznych pierścieni (halo) wokół obiektów, co pozwala na dokładniejszą obserwację krawędzi. Zastosowania Mikroskopia DIC jest powszechnie stosowana w biologii komórkowej, embriologii oraz badaniach nad tkankami do analizy struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak jądra komórkowe, mitochondria czy granice błon komórkowych, w ich naturalnym stanie.
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. W naszym mikroskopie Olympus BX61 najważniejszymi elementami są:
      1. Polaryzator – suwak pod kondensorem
      2. Pryzmat Wollastona w kondensorze – obrotowa głowica kondensora, znajdująca się bezpośrednio pod stolikiem.
      3. Pryzmat Wollastona w obiektywie – suwak poniżej kostek filtrów
      4. 2nd Polaryzator (analizator) - kostka filtru w pozycji DIC
    2. Przełącz kostkę filtra na DIC, aby ustawić analizator (2nd polaryzator) na drodze światła (oprogramowanie powinno wykonać tę czynność podczas uruchamiania).
    3. Należy upewnić się, że dwa polaryzatory są odpowiednio ustawione (skrzyżowane). Gdy oba pryzmaty Wollastona znajdują się poza drogą światła, pole widzenia powinno być ciemne. W razie potrzeby należy obracać polaryzator pod kondensorem, aż zostanie osiągnięty prawidłowy efekt.
    4. Wprowadź pryzmat Wollastona (górny) do toru optycznego.
    5. Obróć pierścień kondensora, aby wybrać pryzmat Wollastona dopasowany do używanego obiektywu.
    6. Przesuń suwak pod tym obiektywem, aby dopasować go do apertury numerycznej (NA) soczewki.
    7. Ustaw ostrość kondensora, aby uzyskać optymalne oświetlenie Koehlera.
    8. Wyreguluj górny pryzmat Wollastona, obracając pokrętło na suwaku, aby uzyskać optymalny kontrast.
    9. Inne ustawienia kontrolowane podczas uruchamiania oprogramowania obejmują wzmocnienie kamery (ustawione na 0) oraz przełączenie zapisu plików na 8-bitowe, a nie 16-bitowe pliki tiff.
  5. Dostosuj poziom oświetlenia w celu uzyskania wysokiej jakości obrazu (zazwyczaj stosuje się napięcie 4,7 V; sterowanie odbywa się za pomocą oprogramowania). Zaleca się oświetlenie próbki w taki sposób, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej poziomu nasycenia.
    Prawidłowo ustawiona optyka DIC pozwala uzyskać obraz o trójwymiarowym wyglądzie, w którym ziarna żółtka w zarodku są wyraźnie zaznaczone. Alternatywnie można to opisać tak, jakby światło oświetlające próbkę padało pod kątem, w wyniku czego jedna strona próbki (lub jej elementów) jest mocno oświetlona, a strona przeciwna znajduje się w cieniu i wydaje się ciemniejsza.
  6. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), aby objąć embriony, które chcesz zobrazować, a następnie kliknij przycisk set ROI, aby zawęzić okno.
  7. Otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz stosy Z (warstwy) oraz punkty czasowe.
  8. Użyj pokrętła ostrości mikroskopu, aby zlokalizować dół zarodka (ostatnia płaszczyzna ogniskowania, w której widoczne są ziarna żółtka). Kliknij Select bottom. Powtórz tę czynność, aby zidentyfikować i ustawić górną część zarodka. Zazwyczaj stosujemy krok 1 mikrona, co pozwala uzyskać około 20 płaszczyzn ogniskowania. Generalnie zbieramy wiele płaszczyzn ogniskowania w każdym punkcie czasowym, ponieważ zarodki i komórki są stosunkowo grube. Ponadto, szczególnie gdy komórki zaczynają dzielić się w różnych orientacjach, mogą one przemieszczać inne komórki w obrębie zarodka, wypychając je poza pierwotną płaszczyznę ogniskowania lub wprowadzając w jej obszar. Jeśli Twój mikroskop nie posiada silnika napędowego ostrości, możesz ręcznie regulować ostrość, aby śledzić interesującą Cię komórkę lub proces.
  9. Wprowadź liczbę punktów czasowych oraz wymagany odstęp czasu. Zazwyczaj stosujemy odstęp 15 sekund i ustawiamy maksymalną liczbę 50 punktów czasowych. Rozpoczynamy od większej liczby punktów czasowych, niż będzie potrzebne, a akwizycję zatrzymujemy w pożądanym momencie. W przypadku obrazowania wielu płaszczyzn ogniskowania należy upewnić się, że czas potrzebny na zarejestrowanie wszystkich płaszczyzn ogniskowania mieści się w odstępie między punktami czasowymi.
  10. Wybierz lub utwórz folder do zapisu danych. Upewnij się, że oprogramowanie jest ustawione w trybie wyświetlania tylko ostatniego obrazu. Nadaj plikowi nazwę i kliknij Acquire. Monitoruj zautomatyzowany proces akwizycji obrazów przez pierwsze kilka punktów czasowych, aby upewnić się, że system działa prawidłowo.
  11. Kliknij stop, gdy chcesz przerwać akwizycję, przełącz na obiektyw 10x i przygotuj kolejny preparat.
  12. Po zakończeniu obrazowania należy usunąć komponenty DIC z drogi optycznej. W razie potrzeby należy oczyścić obiektyw z oleju. Wyłączyć wszystkie urządzenia, zaczynając od kamery.

Filmy GFP

  1. Uruchom mikroskop i zlokalizuj zarodki zgodnie z powyższą instrukcją. Użyj pliku konfiguracyjnego zawierającego programowe sterowanie migawką fluorescencyjną.
  2. Upewnij się, że górny pryzmat DIC (suwak) nie znajduje się na drodze światła.
  3. Przełącz kostkę filtra na FITC/GFP (ustawiane automatycznie przy uruchomieniu).
  4. Zmień wzmocnienie kamery (gain) na 25, a format pliku obrazu na 16-bitowy Tiff (ustawiane automatycznie przy uruchomieniu z tym plikiem konfiguracyjnym).
  5. Wyłącz światło białe.
  6. Kliknij Live Imaging, aby wyświetlić podgląd obrazu. Pracuj szybko, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Alternatywnie użyj Snap Image, aby zarejestrować pojedynczy obraz.
  7. Dostosuj moc lampy rtęciowej/filtry neutralne oraz czas ekspozycji, aby uzyskać wysokiej jakości obraz. Generalnie należy stosować minimalne natężenie światła docierającego do próbki niezbędne do pozyskania danych, aby ograniczyć fotouszkodzenia komórek i fotowyblaknięcie sygnałów fluorescencyjnych.
  8. Ustaw odstępy czasowe, liczbę punktów czasowych oraz liczbę płaszczyzn ogniskowych. Często stosuje się interwały 5–10 sekund i 1–3 płaszczyzny ogniskowej.
  9. Wybierz ROI i ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z opisem w krokach 13–19.

Analiza filmów

  1. Dane zostaną zapisane w folderze o nazwie, którą wprowadzono, i będą zawierać serię plików tiff dla każdego obrazu stosu 4D, plik tekstowy oraz plik xml zawierający metadane, takie jak poziomy ekspozycji i interwały czasowe.
  2. Obrazy tiff można otwierać w programie ImageJ dwiema metodami. Pierwsza (metoda a) jest najprostsza i odczyta również metadane każdego pliku. Druga (metoda b) umożliwia wykorzystanie pamięci wirtualnej do otwierania plików większych niż ilość pamięci przydzielonej do programu ImageJ, ale nie zawiera ona metadanych.
    1. Użycie wtyczki Micro-Manager
      1. Micro-Manager jest zbudowany na bazie programu ImageJ i korzysta z niego (instaluje nową wersję programu ImageJ, która będzie różnić się od jakiejkolwiek innej wersji zainstalowanej wcześniej) oraz zawiera wtyczkę do otwierania danych. Alternatywnie można skopiować zawartość folderu Micro-Manager-1.3/plugins do folderu plugins innej wersji programu ImageJ.
      2. Przejdź do menu Plugins, wybierz Micro-Manager, a następnie Open Micro-Manager File.
      3. Wybierz folder zawierający dane, które chcesz wyświetlić, i kliknij ok.
      4. Przejrzyj wymiary Z i T.
    2. Użycie wtyczki LOCI do otwierania filmów za pomocą BioFormats Importer.
      1. Przenieś pliki xml i txt z folderu zawierającego pliki tiff i zmień nazwy obu plików tak, aby odpowiadały nazwie zestawu danych.
      2. W programie ImageJ przejdź do menu rozwijanego Plugins, wybierz LOCI, a następnie Data Browser lub Bio-Formats Importer.
      3. Znajdź folder ze stosami tiff. Kliknij pierwszy plik tiff, a następnie wybierz open.
      4. Wyświetl stos za pomocą Hyperstack. W sekcji Dataset organization: wybierz Group Files with Similar names, Swap dimensions oraz Open all series. W sekcji Memory management: wybierz Use virtual stack (szczególnie w przypadku dużych zestawów danych). Kliknij ok.
      5. Wtyczka określi wymiary zestawu danych (liczbę punktów czasowych i płaszczyzn ogniskowych) i wyświetli zakres w nawiasach <>. Kliknij ok lub zmień liczbę punktów czasowych i/lub płaszczyzn ogniskowych do otwarcia.
      6. Potwierdź, który wymiar odpowiada każdej serii.
      7. Przejrzyj wymiary Z i T.

Reprezentatywne wyniki

Mikroskopia poklatkowa podziału komórki; sekwencyjne klatki obrazujące przebieg mitozy.
Rysunek 1. Klatki z filmu DIC Nomarskiego ilustrujące prawidłowe procesy komórkowe we wczesnej fazie C. elegans rozwój zarodka: migracja jąder przednich (0-5:45), asymetryczny pierwszy podział (6:45-14:45) i asynchroniczny drugi podział (14:45-27:0). Dane zebrano przy użyciu obiektywu 60x NA 1,35. Co 15 sekund rejestrowano 20 płaszczyzn ogniskowych w odstępach 1 mikrona przy użyciu 40 μs ekspozycja. Obrazy zostały obrócone tak, aby część tylna znajdowała się po prawej stronie, a brzuszna na dole. Pasek skali odpowiada 10 mikronom.

Mikroskopia poklatkowa mitozy komórkowej, sześć etapów, proces podziału komórkowego, obrazowanie biologiczne.
Rycina 2. Klatry z filmu fluorescencyjnego ilustrujące dynamiczne ruchy oznakowanej białkiem GFP podjednostki kompleksu pasażerskiego chromosomów (AIR-2), obecnej na chromosomach od metafazy do wczesnej anafazy (A–C), a następnie pojawiającej się w strefie środkowej wrzeciona w anafazie aż do zakończenia cytokinezy (C–F). Dane zebrano przy użyciu obiektywu 60x o aperturze numerycznej (NA) 1,35. Pojedynczą płaszczyznę ogniskową rejestrowano co 10 sekund przy użyciu 50 μsec ekspozycja. Obrazy zostały obrócone tak, aby część tylna znajdowała się po prawej stronie. Pasek skali odpowiada 10 mikronom.

Film 1 Obrazowanie nomarskie embrionu typu dzikiego.
Film odpowiadający Rysunkowi 1. Strona tylna znajduje się w prawym dolnym rogu, a strona brzuszna w lewym dolnym rogu. Przedstawiono pojedynczą płaszczyznę ogniskowania z oryginalnego zestawu danych. Obrazy były zbierane co 15 sekund, a prędkość odtwarzania ustawiono na 14 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Film 2 Film fluorescencyjny zarodka typu dzikiego wykazującego ekspresję GFP::AIR-2.
Film odpowiadający Rysunkowi 2. Strona tylna znajduje się w prawym górnym rogu. Film został zarejestrowany w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Obrazy były pobierane co 10 sekund, a prędkość odtwarzania ustawiono na 14 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

Kluczową kwestią w obrazowaniu live time-lapse jest zachowanie integralności i żywotności komórki oraz organizmu. Mikroskopia DIC daje tę zaletę, że próbka nie jest wystawiona na działanie światła ultrafioletowego ani nadmierne nagrzewanie z powodu źródła oświetlenia. Mikroskopia DIC doskonale nadaje się do wykrywania migracji komórek i zmian ich kształtu, takich jak cytokineza, a także do identyfikacji niektórych struktur wewnątrzkomórkowych, np. wrzeciona mitotycznego i błony jądrowej. Obrazowanie fluorescencyjne białek reporterowych uzupełnia mikroskopię DIC, umożliwiając identyfikację dodatkowych przedziałów wewnątrzkomórkowych i wizualizację konkretnych białek. Aby zminimalizować ryzyko fototoksyczności i uszkodzeń zarodka podczas obrazowania fluorescencyjnego, zazwyczaj zwiększamy wzmocnienie cyfrowe kamery, aby zrekompensować zmniejszoną intensywność światła UV i czas naświetlania. W przypadku słabo fluorescencyjnych reporterów transgenicznych, jakość zarejestrowanych obrazów można poprawić za pomocą algorytmów dekonwolucji w celu ponownego przypisania światła poza ogniskową lub algorytmów usuwania rozmycia w celu redukcji tła. Chociaż zaawansowane mikroskopy, takie jak systemy konfokalne lub wielofotonowe, są czasami niezbędne, stwierdziliśmy, że wiele reporterów fluorescencyjnych można obrazować przy użyciu tej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego, uzyskując wysokiej jakości obrazy.

Program Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), poza tym że jest bezpłatny, zapisuje pliki bezpośrednio w formacie tiff, zamiast w formatach zastrzeżonych dla wielu komercyjnych pakietów oprogramowania. Znacząco upraszcza to analizę naszych danych poprzez wyeliminowanie etapu konwersji plików, który byłby niezbędny do odczytania obrazów w programach ImageJ, Photoshop oraz innym oprogramowaniu do edycji obrazów.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez wewnętrzne fundusze instytucjonalne oraz program Biological Sciences Scholars Program na Uniwersytecie w Michigan.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop Olympus BX61 z kamerą Hamamatsu Orca-ER. Obiektywy 10x Plan Fluorite (NA 0,3) i 60x PlanAchromat (NA 1,35)Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46Micro-Managerhttp://www.micro-manager.org
Image J 1.43http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jarhttp://www.loci.wisc.edu
Agaroza - stopień do biologii molekularnej/elektroforezy żelowej
Lamelki mikroskopowe Fisher Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific15-901
Kryszalki 18 mm x 18 mm #1.5
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Bufor do jaj (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7,3)25.
Wazelina
Pędzelek/patyczek
Żyletki
Blok grzejny
Mikroskop stereoskopowy
Nicienie22
Rylce z drutu platynowego22
Igła precyzyjna Precision Glide 27G1/2 lub skalpel z małym ostrzemBD Biosciences

Bibliografia

  1. Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
  2. Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
  3. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
  4. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  5. Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  7. Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
  8. Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
  9. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
  12. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
  13. Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
  14. Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
  15. Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
  16. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  17. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  18. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
  19. Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
  20. Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
  21. Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  23. Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
  24. Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
  25. Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

optyka DICobrazowanie time lapsemikroskopia fluorescencyjnakonfiguracja mikroskopuakwizycja obrazuobrazowanie ywych embrion wfluorescencja GFP
Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.