Method Article

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania Open Source

DOI:

10.3791/2625

⸱

March 24th, 2011

 , 
1Human Genetics, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodek C. elegans to potężny system do badania biologii i rozwoju komórki. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji przy użyciu łatwo dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych i oprogramowania typu open source.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy komórkowe, takie jak składanie chromosomów, segregacja i cytokineza, są z natury dynamiczne. Obrazowanie poklatkowe żywych komórek, przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek reporterowych lub mikroskopii kontrastu różnicowego (DIC), pozwala na zbadanie progresji czasowej tych dynamicznych zdarzeń, która w przeciwnym razie jest wywnioskowana z analizy utrwalonych próbek1,2. Co więcej, badanie regulacji rozwojowych procesów komórkowych wymaga przeprowadzania eksperymentów poklatkowych na nienaruszonym organizmie podczas rozwoju. Zarodek Caenorhabiditis elegans jest przezroczysty i ma szybki, niezmienny program rozwojowy ze znaną linią komórkową3, zapewniając w ten sposób idealny model eksperymentalny do badania zagadnień biologii komórki4,5i rozwoju6-9. C. elegans jest podatny na manipulację genetyczną za pomocą genetyki naprzód (opartej na mutagenezie losowej10,11) i genetyki odwrotnej w celu ukierunkowania na określone geny (w oparciu o interferencję za pośrednictwem RNAi i mutagenezę celowaną12-15). Ponadto zwierzęta transgeniczne mogą być łatwo tworzone do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek lub reporterów16,17. Cechy te łączą się, aby ułatwić identyfikację szlaków genetycznych regulujących podstawowe procesy komórkowe i rozwojowe in vivo18-21. W niniejszym protokole przedstawiono metody obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji GFP na złożonym mikroskopie epifluorescencyjnym. Pokazujemy łatwość, z jaką łatwo dostępne mikroskopy, zwykle używane do obrazowania próbek stałych, mogą być również stosowane do analizy poklatkowej przy użyciu oprogramowania typu open source w celu automatyzacji procesu obrazowania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie robaka

  1. Przenieś larwy robaków L4 na odpowiednie płytki 18-24 godziny przed obrazowaniem22. Dzięki temu będziesz mieć dorosłe osobniki składające jaja, które zapewnią obfitą ilość wczesnych zarodków.
  2. Przygotuj probówki wazeliny i agarozy. Przygotowujemy kilka 15 ml probówek sokoła, topiąc wazelinę w zlewce w kuchence mikrofalowej i dozując do 4-5 ml porcji na probówkę. Podobnie rozpuść 2-3% (w/v) agarozy w buforze (M9 lub bufor jaj) i podwielokrotność 4-5 ml do probówek sokoła. Uważaj, aby nie zagotować się w nadmiarze, aby zminimalizować parowanie. W dniu obrazowania rozpuść 1 tubkę wazeliny w bloku grzewczym o temperaturze 65-70°C i rozpuść 1 rurkę agarozy w kuchence mikrofalowej, ponownie uważając, aby zminimalizować wykipienie. Przechowuj probówki w bloku grzewczym, aby utrzymać wazelinę i agarozę w stanie stopionym.
  3. Zrób podkładkę z agarozy. Umieść nowe szkiełko mikroskopowe między 2 szkiełkami prowadzącymi, które są szkiełkami pokrytymi pojedynczą warstwą zwykłej taśmy laboratoryjnej przyklejonej do górnej i dolnej części każdego szkiełka prowadzącego. Użyj pipety Pasteura z odłamanym końcem, aby umieścić 2-3 krople stopionej agarozy na nowym szkiełku. Przykryj2-gim szkiełkiem prostopadłym do oryginalnego szkiełka, tak aby zakrywała i pomagała rozprowadzić Agarozę, tworząc cienką kwadratową podkładkę. 2. suwak powinien spoczywać nad taśmą na prowadnicach. Stężenie agarozy można zwiększyć do 5% w przypadku grubszych podkładek.
  4. Za pomocą lunety sekcyjnej i "kilofa" z drutu platynowego przenieś 2 dorosłe robaki do kropli M9 lub buforu jajowego o pojemności 9-12 μl na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm.
  5. Robaki rozcinamy igłą (używamy igieł 27G1/2) lub skalpelem, aby uwolnić zarodki. Spróbuj przeciąć środek robaka.
  6. Opuść płatek agarozy (stroną agarową do dołu) na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm zawierające zarodki. Przyciąć żyletką agar wystający z krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  7. Zapieczętuj szkiełko nakrywkowe za pomocą pędzla lub cienkiego drewnianego patyczka, aby nałożyć stopioną wazelinę na wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego.

Alternatywą dla agaru są zawieszane krople23, jeśli zarodki są podatne na nacisk (np. jeśli skorupka jajka nie formuje się prawidłowo). Obrazowanie można również wykonać w macicy w celu śledzenia zapłodnienia lub wczesnych zdarzeń, takich jak mejoza. Robaki należy znieczulić lewamizolem24. W celu zwiększenia liczby zarodków od określonego etapu rozwoju, można wypreparować kilka robaków jednocześnie, a zarodki delikatnie umieścić razem za pomocą pipety z cienką końcówką lub szczoteczki do rzęs lub przez pipetowanie doustne.

4D Nomarski DIC (Różnicowy Kontrast Interferencyjny) Filmy

  1. Włącz mikroskop Olympus BX61. Ponieważ kamera jest wrażliwa na fale elektromagnetyczne emitowane przez inne urządzenia, jest włączana jako ostatnia, najpierw żarówka rtęciowa (jeśli to konieczne do GFP lub fluorescencji). Uruchom Micro-Managera, gdy wszystko jest włączone. Wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny dla obrazowania DIC lub fluorescencyjnego. Główna różnica polega na tym, że plik DIC nie zawiera sterowania migawką fluorescencyjną. Każdy plik wybiera również odpowiednią kostkę filtra i ustawienie wzmocnienia kamery.
  2. Znajdź zarodki pod mikroskopem za pomocą obiektywu 10x. Szukaj w pobliżu ciał robaków grup młodych zarodków, aby uzyskać wiele zarodków w polu obrazowania. Unikaj zarodków wewnątrz robaka, aby uzyskać najlepsze obrazy.
  3. Korzystając z oprogramowania, przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (od 40x do 100x) i rozdzielczości (od 0,9 do 1,4) do obrazowania.
  4. Dostosuj optykę Nomarski DIC (Poniższe strony internetowe zawierają pomocne wyjaśnienie optyki DIC i terminologii; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. W naszym Olympus BX61 ważnymi komponentami są:
      1. Polaryzator - suwak pod kondensatorem
      2. Condenser Wollaston Prism - wieżyczka na kondensatorze, tuż pod sceną.
      3. Obiektyw Wollaston Prism - suwak pod kostkami filtrującymi
      4. 2nd Polarizer (Analyzer) - kostka filtrująca w pozycji DIC
    2. Przełącz kostkę filtra na DIC, aby ustawić analizator (2. polaryzator) na ścieżce światła (oprogramowanie powinno to zrobić po uruchomieniu).
    3. Upewnij się, że oba polaryzatory są prawidłowo wyrównane (skrzyżowane). Gdy oba pryzmaty Wollastona znajdują się poza ścieżką światła, pole widzenia powinno być ciemne. W razie potrzeby obróć polaryzator poniżej kondensatora, aż będzie prawidłowy.
    4. Włóż obiektyw (górny) Wollaston Prism do ścieżki światła.
    5. Obróć wieżyczkę na kondensatorze, aby wybrać pryzmat Wollaston, który pasuje do używanego celu.
    6. Dostosuj suwak poniżej tej wieżyczki, aby dopasować go do NA obiektywu.
    7. Ustaw ostrość kondensatora, aby uzyskać optymalne oświetlenie Koehlera.
    8. Wyreguluj górny pryzmat Wollaston, aby uzyskać optymalny kontrast, obracając pokrętło na suwaku.
    9. Inne ustawienia kontrolowane przez uruchamianie oprogramowania obejmują wzmocnienie kamery (ustawione na 0) i przełączanie na zapisywanie plików jako 8-bitowych, a nie 16-bitowych plików tiff.
  5. Dostosuj poziom światła, aby uzyskać ładny obraz. (zwykle używa się 4,7 wolta) (sterowane za pomocą oprogramowania). Wolimy oświetlić próbkę tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej poziomów nasycenia.
    Dobra optyka DIC skutkuje obrazem o trójwymiarowym wyglądzie, w którym granulki żółtka w zarodku wyraźnie się wyróżniają. Alternatywnie można to opisać w ten sposób, że światło oświetlające próbkę wydaje się świecić pod takim kątem, że jedna strona próbki (lub elementów próbki) jest oświetlona jasno, a druga strona jest w cieniu i wydaje się ciemniejsza.
  6. Wybierz Region zainteresowania (ROI), aby uwzględnić zarodki, które chcesz zobrazować, kliknij przycisk ustaw ROI, aby zmniejszyć okno.
  7. Otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz Stosy Z (wycinki) i Punkty czasowe.
  8. Użyj pokrętła ostrości mikroskopu, aby znaleźć spód zarodka (ostatnia płaszczyzna ogniskowa z niektórymi ziarnistościami żółtka w ostrości). Kliknij Wybierz na dole. Powtórz tę czynność, aby zidentyfikować i ustawić wierzchołek zarodka. Zwykle używamy kroku o wielkości 1 mikrona i otrzymujemy ~20 płaszczyzn ogniskowych. Zazwyczaj zbieramy wiele płaszczyzn ogniskowych w każdym punkcie czasowym, ponieważ zarodki i komórki są stosunkowo grube. Ponadto, zwłaszcza gdy komórki zaczynają dzielić się w różnych orientacjach, mogą przemieszczać inne komórki w zarodku, przesuwając je do lub poza pierwotną płaszczyznę ogniskową. Jeśli Twój mikroskop nie jest wyposażony w silnik ostrości, możesz ręcznie dostosować ostrość, aby podążać za komórką lub procesem, który Cię interesuje.
  9. Wprowadź liczbę punktów czasowych i wymagany przedział czasu. Zazwyczaj używamy 15-sekundowego interwału i ustawiamy maksymalnie 500 punktów czasowych. Zaczynamy z większą liczbą punktów czasowych niż będziemy potrzebować i zatrzymujemy akwizycję, gdy jest to pożądane. Jeśli obrazujesz wiele płaszczyzn ogniskowych, upewnij się, że jest wystarczająco dużo czasu, aby uchwycić wszystkie płaszczyzny ogniskowych w odstępie między punktami czasowymi.
  10. Wybierz lub utwórz lokalizację, w której chcesz zapisać dane. Upewnij się, że oprogramowanie jest ustawione na wyświetlanie tylko ostatniego obrazu. Nadaj plikowi nazwę i kliknij przycisk Pobierz. Monitoruj automatyczną akwizycję obrazu przez kilka pierwszych punktów czasowych, aby upewnić się, że działa prawidłowo.
  11. Kliknij stop, jeśli chcesz zatrzymać akwizycję, przełącz się na obiektyw 10x i przygotuj następny slajd.
  12. Po zakończeniu obrazowania usuń składowe DIC ze ścieżki światła. W razie potrzeby usuń olej z obiektywu. Wyłącz wszystko, zaczynając od aparatu.

Filmy GFP

  1. Uruchom mikroskop i znajdź zarodki jak wyżej. Użyj pliku konfiguracyjnego, który zawiera oprogramowanie sterujące migawką fluorescencyjną.
  2. Upewnij się, że górny pryzmat DIC (suwak) nie znajduje się na ścieżce światła.
  3. Przełącz kostkę filtra na FITC/GFP (automatycznie ustawiana przy starcie)
  4. Zmień wzmocnienie kamery na 255 i plik obrazu na 16-bitowy Tiff (automatycznie ustawiany przy starcie z tym plikiem konfiguracyjnym).
  5. Wyłącz białe światło.
  6. Kliknij opcję Live Imaging (Obrazowanie na żywo), aby wyświetlić podgląd obrazu. Pracuj szybko, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Alternatywnie użyj funkcji Snap Image, aby zebrać pojedynczy obraz.
  7. Dostosuj moc żarówki rtęciowej/filtry o neutralnej gęstości, długość ekspozycji, aby uzyskać dobry obraz. Ogólnie rzecz biorąc, należy używać minimalnej ilości światła docierającego do próbki, aby uzyskać dane, które chcesz zredukować fotouszkodzenia komórki i fotowybielanie sygnałów fluorescencyjnych.
  8. Ustaw przedział czasowy, liczbę punktów czasowych i liczbę płaszczyzn ogniskowych. Często stosujemy interwały 5-10 sekundowe i 1-3 płaszczyznę ogniskowej.
  9. Wybierz ROI i ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z opisem we wcześniejszych krokach 13-19.

Analizowanie filmów

  1. Dane zostaną zapisane w folderze o wprowadzonej nazwie i będą zawierać serię plików tiff dla każdego obrazu stosu 4D, plik tekstowy i plik xml zawierający metadane, takie jak poziomy ekspozycji i przedziały czasowe.
  2. Obrazy tiff mogą być otwierane przez ImageJ na dwa sposoby. Pierwsza (metoda a) jest najprostsza i również odczytuje metadane każdego pliku. Druga (metoda b) jest w stanie użyć pamięci wirtualnej do otwarcia plików, które są większe niż ilość pamięci przydzielonej do ImageJ, ale nie zawiera metadanych.
    1. Korzystanie z wtyczki Micro-Manager
      1. Micro-Manager jest zbudowany i używa ImageJ (instaluje nową wersję ImageJ, która będzie się różnić od każdej innej wersji, którą mogłeś wcześniej zainstalować) i zawiera wtyczkę do otwierania danych. Alternatywnie możesz skopiować zawartość folderu Micro-Manager-1.3/plugins do folderu plugins dla innej wersji ImageJ.
      2. Przejdź do menu Wtyczki, wybierz Micro-Manager, a następnie Otwórz plik Micro-Manager.
      3. Wybierz folder zawierający dane, które chcesz wyświetlić, i kliknij przycisk OK.
      4. Graj wymiarami Z i T.
    2. Korzystanie z wtyczki LOCI do otwierania filmów za pomocą BioFormats Importer.
      1. Przenieś pliki xml i txt z folderu zawierającego pliki tiff i zmień nazwy obu plików, aby były zgodne z nazwą zestawu danych.
      2. W ImageJ przejdź do menu rozwijanego Wtyczki, wybierz LOSI, a następnie Przeglądarka danych lub Importer formatów biologicznych.
      3. Znajdź folder ze stosami tiff. Kliknij pierwszy plik tiff, a następnie otwórz.
      4. Wyświetlanie stosu za pomocą programu Hyperstack. W obszarze Organizacja zestawu danych: wybierz pozycję Grupuj pliki o podobnych nazwach, Zamień wymiary i Otwórz wszystkie serie. W obszarze Zarządzanie pamięcią: Wybierz: Użyj stosu wirtualnego (szczególnie w przypadku dużych zestawów danych). Kliknij przycisk OK
      5. Wtyczka określi wymiary zestawu danych (# punktów czasowych i płaszczyzn ogniskowych) i wyświetli zakres między zestawem <> nawiasów. Kliknij przycisk OK lub zmień liczbę punktów czasowych i/lub płaszczyzn ogniskowych do otwarcia.
      6. Potwierdź, który wymiar odpowiada każdej serii.
      7. Graj wymiarami Z i T.

Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rysunek 1. Kadry z filmu Nomarski DIC ilustrujące normalne zdarzenia komórkowe podczas wczesnego rozwoju zarodka C. elegans: migracja przedjądrowa (0-5:45), asymetryczna pierwsza dywizja (6:45-14:45) i asynchroniczna druga dywizja (14:45-27:00). Dane zostały zebrane za pomocą obiektywu 60x 1,35 NA. 20 płaszczyzn ogniskowych w odstępach 1 mikrona zbierano co 15 sekund z ekspozycją 40 μs. Obrazy zostały obrócone tak, aby tył znajdował się po prawej stronie, a brzuszny ku dołowi. Pasek skali reprezentuje 10 mikronów.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Kadry z filmu fluorescencyjnego ilustrujące dynamiczne ruchy znakowanej GFP podjednostki kompleksu pasażerskiego chromosomu (AIR-2) obecnej na chromosomach od metafazy do wczesnej anafazy (A do C) przed pojawieniem się w strefie środkowej wrzeciona w anafazie, aż do zakończenia cytokinezy (C do F). Dane zostały zebrane za pomocą obiektywu 60x 1,35 NA. Pojedyncza płaszczyzna ogniskowej była zbierana co 10 sekund z ekspozycją 50 μs. Obrazy zostały obrócone tak, aby tył znajdował się po prawej stronie. Pasek skali reprezentuje 10 mikronów.

Film 1 Nomarski Film o dzikim embrionie.
Film odpowiadający rys. 1. Tylna znajduje się w prawym dolnym rogu, a brzuszna w lewym dolnym rogu. Pokazuje pojedynczą płaszczyznę ogniskową oryginalnego zestawu danych. Obraz był zbierany co 15 sekund, a odtwarzanie jest ustawione na 14 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film

Film 2 Fluorescencyjny film przedstawiający zarodek dzikiego typu wyrażającego GFP::AIR-2.
Film odpowiadający rys. 2. Tył znajduje się w prawym górnym rogu. Film został zebrany jako pojedyncza płaszczyzna ogniskowa. Obraz był zbierany co 10 sekund, a odtwarzanie jest ustawione na 14 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym czynnikiem branym pod uwagę przy obrazowaniu poklatkowym na żywo jest zachowanie integralności i żywotności komórki i organizmu. Mikroskopia DIC zapewnia tę zaletę, że próbka nie jest wystawiona na działanie światła ultrafioletowego i nadmiernego nagrzewania ze źródła światła. Mikroskopia DIC doskonale nadaje się do wykrywania migracji komórek i zmian kształtu komórek, takich jak cytokineza, oraz do identyfikacji niektórych struktur subkomórkowych, takich jak wrzeciono mitotyczne i błona jądrowa. Obrazowanie fluorescencyjne białek reporterowych uzupełnia mikroskopię DIC, identyfikując dodatkowe przedziały subkomórkowe i umożliwiając wizualizację określonych białek. Aby zmniejszyć ryzyko fototoksyczności i uszkodzenia zarodka podczas obrazowania fluorescencyjnego, zwykle zwiększamy cyfrowe wzmocnienie aparatu, aby zrównoważyć zmniejszone natężenie światła UV i czas świecenia. W przypadku słabych fluorescencyjnych reporterów transgenicznych algorytmy dekonwolucji w celu ponownego przypisania nieostrego światła lub algorytmy usuwania rozmycia w celu zmniejszenia tła mogą poprawić jakość przechwyconych obrazów. Chociaż czasami konieczne są zaawansowane mikroskopy, takie jak systemy konfokalne lub wielofotonowe, odkryliśmy, że wiele reporterów fluorescencyjnych można obrazować za pomocą tej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego, uzyskując obrazy o wysokiej jakości.

Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), oprócz tego, że jest darmowy, zapisuje pliki bezpośrednio w formacie tiff zamiast zastrzeżonych formatów plików wielu komercyjnych pakietów oprogramowania. To znacznie upraszcza analizę naszych danych, eliminując etap konwersji plików potrzebny do odczytania plików graficznych w ImageJ, Photoshop i innych programach do edycji obrazów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnętrzne fundusze instytucjonalne oraz Program Stypendialny Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Michigan wspierały tę pracę.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop Olympus BX61 z kamerą Hamamatsu Orca-ER. 10-krotne soczewki obiektywowe PlanFluoryt (NA 0,3) i 60-krotne PlanAchromat (NA 1,35)Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46Micro-Managerhttp://www.micro-manager.org
Image J 1,43
http://rsbweb.nih.gov/ij loci_tools.jarhttp://www.loci.wisc.edu
Agaroza - biologia molekularna/elektroforeza żelowa klasy
Fisher Superfrost/Plus Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific15-901
18 mm x 18 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Bufor jaj (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7,3)25.
Wazelina
Szczotka/Sztyft
Żyletki
Blok
Mikroskop
Robaki22
Platynowy drut pick22
27G1/2 Precision Glide Needle lub skalpel z małym ostrzemBD Biosciences
grzewczypreparacyjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
  2. Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
  3. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
  4. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  5. Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  7. Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
  8. Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
  9. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
  12. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
  13. Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
  14. Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
  15. Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
  16. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  17. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  18. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
  19. Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
  20. Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
  21. Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  23. Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
  24. Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
  25. Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans EmbryosEpifluorescent MicroscopeDIC OpticsOpen Source SoftwareTime Lapse ImagingFluorescent MicroscopyMicroscope SetupImage AcquisitionLive Embryo ImagingGFP Fluorescence

Related Articles