Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Podsumowanie

Opisujemy metodę rejestracji aktywności motorycznej, zsynchronizowaną z elektrycznie rejestrowanym sygnałem kontaktu stopowego u uwięzionego owada chodzącego po śliskiej powierzchni. Metoda ta jest wykorzystywana do badania neuronalnych podstaw adaptacyjnego zachowania przy zredukowanym wpływie oddziaływań mechanicznych między odnóżami a podłożem.

Streszczenie

Badając neuronowe podstawy zachowania chodu, często napotyka się problem polegający na trudności w oddzieleniu wygenerowanego przez neurony wyjścia krokowego od tych ruchów kończyn, które wynikają z sił pasywnych i interakcji z innymi nogami poprzez wspólny kontakt z podłożem. Jeśli chcemy zrozumieć, która część danego ruchu jest wynikiem wyjścia motorycznego układu nerwowego, analiza kinematyczna ruchów krokowych musi zatem zostać uzupełniona o elektrofizjologiczne rejestracje aktywności motorycznej. Rejestracja aktywności neuronalnej lub mięśniowej u zwierzęcia w trakcie zachowania jest często ograniczona przez sprzęt elektrofizjologiczny, który może krępować zwierzę i ograniczać jego zdolność do poruszania się z jak największą liczbą stopni swobody. Można tego uniknąć stosując elektrody implantowalne i pozwalając zwierzęciu na poruszanie się na długiej smyczy (np. Clarac et al., 1987; Duch & Pflüger, 1995; Böhm et al., 1997; Gruhn & Rathmayer, 2002) lub przesyłając dane za pomocą urządzeń telemetrycznych (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Obie te eleganckie metody, z powodzeniem stosowane u większych stawonogów, często okazują się trudne do zastosowania u mniejszych owadów chodzących, które albo łatwo zaplątują się w długą smycz, albo są ograniczane przez wagę urządzenia telemetrycznego i jego baterii. Ponadto we wszystkich tych przypadkach nadal niemożliwe jest odróżnienie czystych neuronowych podstaw lokomocji od efektów wywołanych przez sprzężenie mechaniczne między nogami kroczącymi poprzez podłoże. Jednym z rozwiązań tego problemu jest przeprowadzenie eksperymentów na zwierzęciu unieruchomionym, które może swobodnie maszerować w miejscu i jest lokalnie zawieszone, na przykład nad śliską powierzchnią, co skutecznie eliminuje większość mechaniki kontaktu z podłożem. Metoda ta była wykorzystywana do badania reakcji ucieczkowych (Camhi i Nolen, 1981; Camhi i Levy, 1988), obracania się (Tryba i Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), chodu wstecznego (Graham i Epstein, 1985) lub zmian prędkości (Gruhn et al., 2009b) i pozwala ona badaczowi na łatwe łączenie fizjologii wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej z analizami kinematycznymi (Gruhn et al., 2006).

Wykorzystujemy układ z poślizgową powierzchnią, aby zbadać czas aktywacji mięśni nóg u poruszającej się patykowej w odniesieniu do momentu kontaktu z podłożem i oderwania nogi w różnych paradygmatach behawioralnych, takich jak chodzenie na wprost i po łuku, w preparatach nienaruszonych oraz zredukowanych.

Protokół

1. Powierzchnia do chodzenia

Czarna powierzchnia chodni składa się z dwóch niklowanych płyt mosiężnych, trwale połączonych obok siebie i odizolowanych elektrycznie za pomocą paska dwuskładnikowego kleju epoksydowego (UHU plus, UHU GmbH, Niemcy) o szerokości 2mm, znajdującego się bezpośrednio pod osią podłużną zwierzęcia. Tworzą one całkowitą powierzchnię o wymiarach 13,5x15,5cm (Rycina 1). Rozdzielenie półpłaszczyzn dla lewej i prawej nogi umożliwia niezależne monitorowanie kontaktu tarsalnego dla pojedynczej nogi po każdej stronie.

1. Płytkę smaruje się mieszaniną gliceryny i wody w stosunku 95 części gliceryny do 5 części nasyconego roztworu NaCl, aby zapewnić śliskość i przewodność elektryczną; lepkość wynosi około 430cStokes (Shankar and Kumar, 1994).
2. Mieszaninę nanosi się bezpośrednio na powierzchnię i rozprowadza za pomocą miękkiej chusteczki higienicznej, aby zapewnić całkowitą grubość 0,1-0,2mm.

2. Konfiguracja stymulacji optycznej

1. Epizody chodzenia są wywoływane przy użyciu dwóch projektorów, zgodnie z opisem Scharsteina (1989), w celu wyświetlenia pasiastego wzoru na dwóch okrągłych ekranach z matowego szkła (średnica 130mm, ekrany Marata, Linos Photonics, Göttingen, Niemcy) umieszczonych w odległości ok. 70mm od oczu, pod kątem 45° po lewej i prawej stronie z przodu płyty (Rys.1). Długość fali pasiastego wzoru pozostaje stała na poziomie λ=21°. Częstotliwość kontrastu ruchomych bodźców może być zmieniana między 0.35, 0.72, 1.07 a 1.49Hz. Ponieważ reakcja zwierząt zależy wyłącznie od częstotliwości kontrastu ω/λ (ω = prędkość kątowa, λ = długość fali wzoru), pod warunkiem że kontrast wzoru jest wystarczająco wysoki (Fermi i Reichhardt, 1963), nie zmienialiśmy λ w trakcie eksperymentów. Luminancja jasnych pasów po stronie zwierzęcia wynosi około 15cd/m2, a kontrast 0.8. Oko złożone patyczaka (Carausius morosus) posiada 24 ommatidia w osi grzbietowo-brzusznej (Friza, 1928) i nieco więcej w osi rostro-kaudalnej. Ponieważ kąt dywergencji oka patyczaka wynosi średnio 6.2° (Jander i Volk-Henrichs, 1970), długość fali naszego wzoru była około 4 razy większa niż kąt ommatidiów. Eksperymenty są przygotowane w zaciemnionej klatce Faradaya i przeprowadzane w zaciemnionym pomieszczeniu w temperaturze 20-22°C.
2. Chodzenie do przodu jest indukowane przez progresywny wzór na obu ekranach, w którym pasy na każdym ekranie poruszają się na zewnątrz, lub przez pojedynczą czarną wiązkę na białym tle umieszczoną pomiędzy ekranami.
3. Skręcanie jest indukowane przez pasy poruszające się w tym samym kierunku na obu ekranach. Nie stwierdzono korelacji między prędkością poruszających się pasów a kątem skrętu. Po ustawieniu luminancji pasiastego wzoru w celu wywołania chodzenia, zazwyczaj nie wymaga ona dalszej regulacji, jednak może być ona dostosowywana dla różnych zwierząt w zależności od potrzeb poprzez zmianę napięcia lamp halogenowych w projektorach.

3. Przygotowanie zwierzęcia doświadczalnego

1. Dorosłe samice patyków (Carausius morosus) są przyklejane (cement dentystyczny, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Niemcy) stroną brzuszną do cienkiego patyczka z balsy (3x5x100mm, SzxWxD), który jest włożony do mosiężnej rurki posiadającej wiele złączy. Zwierzę jest przytrzymywane przez około minutę, aż klej przynajmniej częściowo stwardnieje.
2. Głowa i odnóża wystają z przodu i z boków kołka, aby umożliwić im swobodny ruch. Obszart coxae wszystkich nóg, jak również większa część odwłoka, muszą pozostać wolne od kleju.
3. Głowa, klatka piersiowa owada oraz dystalne końce każdego uda i goleni są znakowane pigmentami fluorescencyjnymi (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Niemcy) zmieszanymi z cementem dentystycznym w celu późniejszego śledzenia wideo.

4. Umieszczenie elektrod EMG

Aktywność mięśniową różnych mięśni kończyn, takich jak w tym przykładzie mięsień protraktor i retraktor coxae, które znajdują się w klatce piersiowej i odpowiadają za protrakcję (ruch do przodu) oraz retrakcję (ruch do tyłu) kończyny, rejestruje się za pomocą elektrod EMG implantowanych w klatce piersiowej. Wszystkie zapisy EMG są wzmacniane różnicowo. Sygnał został wzmocniony 100-krotnie we wzmacniaczu wstępnym (warsztat elektroniki, Instytut Zoologii, Kolonia), przefiltrowany filtrem pasmowym (100Hz-2000Hz), ponownie wzmocniony (10-krotnie) i wprowadzony za pomocą przetwornika AD do programu spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK).

1. Elektrody wykonuje się z powlekanych miedzianych drutów (Elektrisola, Eckernhagen, Niemcy; średnica zewnętrzna 47μm). Aby przygotować jedną elektrodę, dwa druty smaruje się najpierw klejem, a następnie dwa lepkie druty skręca się ze sobą
2. Na jednym końcu skręcone końce drutów przylutowuje się do miniwtyczki. Na drugim końcu druty przycina się, aby uzyskać czyste końce bez izolacji do wprowadzenia do organizmu zwierzęcia.
3. Elektrody EMG wpina się do małego złącza znajdującego się na końcu mosiężnej rurki.
4. Do wykonania małych otworów w kutykuli używa się cienkiej szpilki
5. Przycięte końce elektrody rozdziela się i wprowadza do mięśnia w odstępie około 1mm od siebie, co w naszym doświadczeniu zapewnia korzystny stosunek sygnału do szumu. Należy uważać, aby nie wprowadzać elektrod zbyt głęboko w mięsień, aby uniknąć jego uszkodzenia. Rysunek 2 przedstawia rozmieszczenie elektrod w klatce piersiowej zwierzęcia. Rysunek 3 przedstawia zwierzę z wprowadzonymi drutami elektrod.
6. Do stabilizacji drutów używamy małej kropli kleju histoakrylowego (3M Vetbond, St.Paul, MN, USA).
7. Przewód uziemiający wprowadza się do jamy brzusznej.

5. Rejestracja kontaktu stępu

Kontakt nadgarstkowy jest zawsze rejestrowany wraz z zapisami EMG. Ponieważ śliska powierzchnia jest podzielona na dwie połowy, jednocześnie można zarejestrować maksymalnie dwa przeciwstawne kontakty nadgarstkowe. W tym celu noga służy jako „przełącznik” zamykający obwód między płytką a wzmacniaczem. Prąd może być doprowadzony do płytek oddzielnie poprzez dwa gniazda u podstawy każdej płytki. Za pomocą generatora impulsów (Model MS501, warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia) możemy wygenerować dwa sygnały prostokątne o amplitudach 2-4mV z przesunięciem fazowym o 90°. Sygnały te są tłumione o 60dB (/1000) i przyłożone do dwóch połówek śliskiej powierzchni. W tym eksperymencie wykorzystujemy tylko jeden z dwóch sygnałów. Jest on jednocześnie podawany do wzmacniacza lock-in jako sygnał referencyjny. 2-fazowy wzmacniacz lock-in (warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia) selektywnie wzmacnia tylko sygnały o tej samej częstotliwości i fazie co dostarczony sygnał referencyjny. Drugi kanał wykrywa wyłącznie sygnał przesunięty w fazie o 90°. Sygnały szumów o częstotliwościach innych niż częstotliwość referencyjna są odrzucane i nie wpływają na pomiar. Sygnał wyjściowy wzmacniacza jest podawany do przetwornika AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) i digitalizowany za pomocą programu Spike2. Między momentem dotknięcia a oderwaniem nadgarstka od śliskiej powierzchni prąd płynie z płytki przez nadgarstek i golень do miedzianego drutu (patrz poniżej: 5.3-5.8). Wybrany wzmacniacz posiada wysoką rezystancję wejściową (1MΩ), a napięcie sygnału jest bardzo małe, aby uniknąć wpływu na zachowanie chodu zwierzęcia. Natężenie prądu przepływającego przez nadgarstek i golень wynosi od 2 do 4nA. Czas przejścia sygnału podczas dotknięcia, pomiędzy wejściem w lubrykant a kontaktem z powierzchnią, wynosi mniej niż 1ms. Przejście sygnału kontaktu podczas odrywania jest mniej strome i bardziej opóźnione. Wynika to z opóźnionego zerwania filmu lubrykantu z nadgarstka wskutek efektu podciągania kapilarnego oraz z ruchu nogi bez pełnego oderwania w fazie przenoszenia.

1. Mosiężną rurkę z patyczkiem z balsy, do którego przyklejone jest zwierzę, umieszcza się w mikromanipulatorze, aby umożliwić regulację wysokości zwierzęcia w zakresie od 7 do 12mm nad śliską powierzchnią, co odpowiada wysokości podczas swobodnego chodzenia.
2. W celu pomiaru przepływu prądu w każdym momencie, gdy tarsus owada monitorowanej nogi styka się z podłożem, drut (średnica 47μm) tnie się na kawałki o długości około 15cm.
3. Izolację miedzianego drutu usuwa się poprzez wypalenie go alkoholem.
4. Z jednego końca drutu tworzy się pętlę, którą nasuwa się na tarsus zwierzęcia.
5. Pętlę zawiązuje się na dystalnym końcu goleni, aby zapewnić dobry kontakt między zwierzęciem a drutem.
6. Następnie drut mocuje się na tułowiu zwierzęcia kroplą kleju dwuskładnikowego (ProTempII, patrz wyżej) i podłącza do wzmacniacza różnicowego za pomocą zacisku typu krokodylk.
7. Aby poprawić przewodność drutu na jego końcach, w miejscach styku nakłada się kroplę kremu do elektrod (Marquette Hellige, Freiburg, Niemcy).
8. Następnie na monitorze sprawdza się siłę sygnału. Ze względu na właściwości filtra dolnoprzepustowego wzmacniacza lock-in (stała czasowa 10ms) oraz stopniowe odrywanie i dotykanie podłoża przez tarsus, sygnał nie jest idealnym sygnałem prostokątnym. Należy zatem ustawić odpowiednie progi blisko punktu przejścia, aby określić dokładny czas kontaktu tarsusu, a następnie ręcznie sprawdzić każde zdarzenie określone przez oprogramowanie do digitalizacji. Na podstawie kontaktu tarsusu zdefiniowaliśmy czas, w którym tarsus danej nogi znajdował się na ziemi, jako fazę podporową (stance), a czas, w którym znajdował się w powietrzu, jako fazę przenoszenia (swing phase).
9. Sygnał wyzwalający dla kamery jest rejestrowany jednocześnie ze śladem EMG i sygnałem kontaktu tarsusu, co pozwala na precyzyjną korelację zachowania i zarejestrowanych śladów klatka po klatce.

6. Optyczna rejestracja ruchów kończyn do analizy cyfrowej

Częstotliwość kroków patamorfid na śliskich powierzchniach może osiągać 3-4Hz (Graham and Cruse, 1981).

1. Przed nagraniem sekwencji chodu za zwierzęciem, pod kątem 45°, umieszcza się lustro, aby zapewnić dodatkowy monitor wizualny dla momentu kontaktu stopy z podłożem. Kamera jest wyzwalana zewnętrznie, a obrazy są przesyłane do komputera PC poprzez interfejs FireWire.
2. Sekwencje chodu rejestrujemy z góry za pomocą szybkiej kamery wideo (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Niemcy) przy 100fps, aby cyfrowo analizować ruchy kończyn i korelować je z aktywnością EMG oraz kontaktem nadgarstkowym.
3. Podczas nagrywania sekwencji chodu zwierzę jest oświetlane niebieskimi matrycami LED (30-50V DC, luminancja 24cd, Electronics Workshop, Instytut Zoologii Uniwersytetu w Kolonii), których natężenie jest dostosowane tak, aby oświetlić znaczniki fluorescencyjne. Zgodnie z literaturą (Schlegtendal, 1934), patykowce nie posiadają widzenia barwnego i nie zaobserwowaliśmy negatywnego wpływu oświetlenia światłem UV na reakcję zwrotną. Żółty filtr przed obiektywem kamery tłumi krótką falę światła aktywacyjnego i zapewnia wyższy kontrast nagrań wideo.
4. Pliki wideo można analizować za pomocą oprogramowania do śledzenia ruchu (WINanalyze, wersja 1.9, Mikromak service, Berlin, Niemcy).

7. Rejestracja sekwencji chodu

1. W ramach kontroli w pierwszej kolejności rejestruje się sekwencję chodu zwierzęcia nienaruszonego.
2. Ustawia się prędkość prążkowanego wzoru, a następnie niemal jednocześnie uruchamia wzór oraz nagrywanie wideo.
3. Jeśli zwierzę nie zacznie poruszać się spontanicznie, można je pobudzić, dotykając pędzelkiem odwłoka (Bässler and Wegener, 1983) lub kierując strumień powietrza na czułki. W takim przypadku zwierzęta dotknięte po lewej stronie odwłoka mają tendencję do skręcania w lewo i na odwrót. Prążkowany wzór pozostaje w ruchu, dopóki zwierzę nie przestanie chodzić lub aż do momentu zakończenia 3 minut ciągłego nagrywania.
4. Aby sprawdzić, w jakim stopniu aktywność mięśniowa w jednej nodze zależy od sygnałów sensorycznych z nóg sąsiednich, indukuje się u zwierzęcia autotomię nóg. Miejsce autotomii zamyka się naturalnie w ciągu kilku sekund. Przykład zwierzęcia z autotomizowanymi nogami przednimi i tylnymi przedstawiono na Rysunku 3.
5. Na przykład w przypadku eksperymentów ze zwierzętami posiadającymi tylko jedną nogę środkową, indukujemy autotomię nóg przedpiersiowych i zawisłopiersiowych poprzez uciśnięcie bliższej części uda pęsetą (Schmidt and Grund, 2003) lub odcinamy nogi na poziomie poziomego stawu biodrowego po wcześniejszym zarejestrowaniu chodu zwierzęcia nienaruszonego. Następnie zwierzęciu zapewnia się minimum 30 min czasu na regenerację.
6. Następnie rejestrujemy nowe sekwencje chodu w sposób opisany wcześniej. W przypadku preparatów zredukowanych często konieczne jest indukowanie chodu za pomocą pociągnięć pędzelka.

8. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Układ eksperymentalny; A: fotografia patyczaka unieruchomionego nad śliską powierzchnią, znakowanego pigmentami fluorescencyjnymi w celu śledzenia ruchu odnóży oraz z podłączonymi elektrodami do rejestracji EMG i pomiaru kontaktu tarsalnego. B: schemat połączeń dla dwukanałowej rejestracji kontaktu tarsalnego odnóży podczas chodzenia po śliskiej powierzchni.

Rysunek 2. Pozycje rozmieszczenia elektrod EMG w mięśniach protraktora i retraktora w klatce piersiowej środkowej nogi patyczaka. ML: środkowa noga; FL: przednia noga

Rycina 3. Patyczak z umieszczonymi przewodami EMG w mięśniach prostowniku i zginacza środkowej nogi; przednie i tylne nogi zostały usunięte, aby zbadać wpływ obecności sąsiednich nóg na kinematykę i aktywność mięśniową nóg środkowych w uproszczonym preparacie.

Rycina 4. Przykładowy zapis aktywności EMG mięśnia retraktora wraz z sygnałem referencyjnym kontaktu stopniowego w środkowej nodze wewnętrznej podczas skrętu. Na początku zapisu (pierwsza niebieska ramka) retractor jest aktywny podczas fazy podporowej, gdy noga ma kontakt z podłożem („obwód zamknięty”), co wskazuje na wykonywanie kroków do przodu; po krótkiej zmianie (druga niebieska ramka) retractor jest aktywny podczas fazy przenoszenia, gdy noga znajduje się w powietrzu („obwód otwarty”, trzecia niebieska ramka), co świadczy o wystąpieniu kroków skierowanych do tyłu.

Rycina 5. Zrzut ekranu z zapisu aktywności mięśnia prostownika (górna ścieżka) i mięśnia cofającego (środkowa ścieżka) oraz jednocześnie zarejestrowanego sygnału kontaktu nadgarstka (dolna ścieżka). Zwróć uwagę na naprzemienną aktywność w ścieżkach EMG, która odpowiada aktywności obu mięśni w cyklu kroku: aktywności prostownika tuż przed i podczas fazy przenoszenia, gdy sygnał kontaktu nadgarstka wskazuje utratę kontaktu z podłożem, oraz aktywności mięśnia cofającego po i podczas kontaktu nadgarstka z podłożem, gdy noga znajduje się w fazie podporu. Wstawka przedstawia odpowiadający temu zapisowi plik wideo, służący do weryfikacji zachowania zwierzęcia.

Dyskusja

Opisaliśmy układ, który umożliwia optycznie indukowane generowanie zachowań skręcania i w dużym stopniu pozwala na oddzielenie neuronalnie generowanej aktywności chodu od pasywnych efektów wywołanych mechanicznym przemieszczeniem pozostałych kończyn chodzących na podłożu. Z drugiej strony, wciąż możliwy jest potencjalny przepływ informacji między nogami poprzez układ nerwowy w odniesieniu do sił reakcji podłoża lub kontaktu trzonka, co pozwala eksperymentatorowi badać wpływ takich informacji w uproszczonym preparacie. Głównymi zaletami układu z zastosowaniem śliskiej powierzchni jest fakt, że zwierzęta wykazują bardzo wysoką tendencję do chodzenia, a w przeciwieństwie do chodzenia lub stawiania kroków na kołowrotku, zwierzę może wykonywać ruchy fazy przenoszenia i podparcia we wszystkich kierunkach naturalnego chodu. Dodatkowo stopnie swobody wszystkich nóg pozwalają zwierzęciu na chodzenie po łuku, niezależnie od tego, czy jest to preparat nienaruszony, czy częściowo naruszony. Ponieważ nogi nie mogą być pasywnie poruszane jedynie przez ruch zwierzęcia do przodu lub ruch podłoża pod nim, każdy ruch odzwierciedla wyjście motoryczne danej kończyny (Cruse, 1976; Graham and Wendler, 1981). Układ ten jest wysoce odpowiedni do badania neuronalnych podstaw zachowań adaptacyjnych, takich jak skręcanie czy chodzenie do przodu w przeciwieństwie do chodzenia do tyłu, ponieważ można w nim połączyć rejestrację elektrofizjologiczną aktywności motorycznej z analizą kinematyki ruchu kończyn.

Wykorzystaliśmy odpowiedź optomotoryczną patyczaka do wywołania chodu. Reakcje zwierząt na obracający się wzór pasowy wykazały ich gotowość do wykonywania chodu po łuku podczas bycia przywiązanym nad śliską powierzchnią. Co dla nas najbardziej zaskakujące, pojedyncze odnóża w preparatach jednonóż jakościowo wykazują taki sam wzorzec ruchu, jak w nienaruszonym organizmie. Mamy zatem podstawy sądzić, że kontrola chodu po łuku może funkcjonować w dużej mierze bez koordynującego dopływu sygnałów sensorycznych z sąsiednich odnóży. W dalszych eksperymentach istotne będzie sprawdzenie, czy aktywność neuronów ruchowych usuniętych odnóży jest również wpływana przez wzorzec optomotoryczny. Układ ten można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić badanie innych zadań, takich jak chód prosto naprzód i do tyłu, poprzez umieszczenie pojedynczego pasa przed zwierzęciem lub delikatne pociąganie za czułki.

Precyzyjny pomiar kontaktu z podłożem pozwala na korelację aktywności mięśniowej z pozycją kończyny. Wysoka rozdzielczość czasowa tego sygnału kontaktu elektrycznego wynosi poniżej 1ms i dostarcza nowych informacji na temat czasu przejścia z fazy przenoszenia do fazy podporu. Rozdzielczość jest gorsza w przypadku przejścia z fazy podporu do fazy przenoszenia ze względu na opóźnienie w ścinaniu przewodzącego środka smarnego oraz brak konieczności całkowitego oderwania stopy podczas protrakcji na śliskiej powierzchni. Niemniej jednak, wiedza na temat precyzyjnego przejścia z fazy przenoszenia do fazy podporu jest szczególnie użytecznym pierwszym krokiem, jeśli chcemy zrozumieć mechanizmy kontrolujące czas aktywacji mięśni oraz skoordynowaną aktywność mięśni kończyn w różnych kontekstach behawioralnych (zob. również: Büschges et al., 2008; Büschges & Gruhn 2008).

Jako przykład wykorzystaliśmy mięsień retraktora i protraktora coxae nogi środkowej, precyzyjnie korelując jego aktywność z przejściem z fazy przenoszenia do fazy podparcia, jednocześnie monitorując kontekst behawioralny, w jakim noga była używana. W tym celu wywołaliśmy chód i stale rejestrowaliśmy aktywność mięśniową. Dana noga może być nogą wewnętrzną lub zewnętrzną, w zależności od kierunku skrętu. W przypadku kroczącej nogi środkowej, pełniącej w sensie funkcjonalnym rolę nogi wewnętrznej, można zaobserwować, że zarówno mięśnie retraktora, jak i protraktora mogą działać jako funkcjonalne mięśnie fazy podparcia, ponieważ noga okresowo wykonuje kroki do tyłu oprócz kroków skierowanych do przodu (patrz Ryc.4).

Elektromiogramy (EMG) z obu mięśni zostały poddane rektyfikacji i normalizacji względem czasu kontaktu z podłożem (touch-down), a następnie obliczono latencję pierwszych impulsów mięśniowych. Co ciekawe, latencje obu mięśni w stosunku do momentu oderwania (lift-off) i kontaktu z podłożem zależą od funkcji mięśnia jako odpowiednio mięśnia fazy przeniesienia lub fazy podparcia (patrz Rys. 4), a nie od samego mięśnia, i wykazują jedynie niewielkie zmiany w czasie rozpoczęcia aktywności. Większość wyjaśnień dotyczących zmiany stanu z fazy przeniesienia na fazę podparcia zakłada, że sygnały sensoryczne z kontaktu tarsów inicjują rozpoczęcie fazy podparcia. Dzięki zmodyfikowanej aparaturze można teraz odpowiedzieć na interesujące pytanie, w jaki sposób powstają krótkie latencje między kontaktem z podłożem a aktywacją mięśni u patyczaka oraz od jakich informacji sensorycznych one zależą.

Podsumowując, prezentujemy układ z poślizgową powierzchnią, który pozwala nam w sposób niezawodny wywołać chód prosty i zakrętowy u nieruchomych patyczaków. Kinematykę, aktywność mięśni oraz czas kontaktu i oderwania tarsów od podłoża można monitorować i korelować jednocześnie w dwóch różnych kontekstach behawioralnych. Stanowi to doskonałe narzędzie do szczegółowego badania związku między aktywnością mięśni a kontekstem behawioralnym dla pojedynczej kończyny, jak również w całym organizmie, a także do analizy mechanizmów leżących u podstaw tych zjawisk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
dwuskładnikowy klej epoksydowy	UHU plus, UHU GmbH, Niemcy
ekrany szklane (średnica 130 mm)	Linos Photonics
cement stomatologiczny	ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Niemcy	Nr ID 3M: 70-2011-0358-0 Numer katalogowy: 46430	Dostępny za pośrednictwem 3M (http://www.3m.com/) lub dostawców sprzętu stomatologicznego
pigmenty fluorescencyjne	Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Niemcy	Nr kat.: np. 56200 Pigment Fluorescencyjny Żółty Złoty, 56350 Pigment Fluorescencyjny Czerwony Płomienny	http://kremer-pigmente.de/en lub http://www.kremerpigments.com/
klej histoakrylowy	3M		dostawca: WPI
izolowany drut miedziany	Elektrisola Eckernhagen		http://www.elektrisola.com/
pasta elektrodowa	Marquette Hellige, Fryburg, Niemcy		Produkt został wycofany z produkcji, sugerujemy na przykład: www.grasstechnologies.com
generator impulsów	Model MS501, warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia, Niemcy
wzmacniacz lock-in	Instytut Zoologii
przetwornik AD	Cambridge Electronic Design
przedwzmacniacz	Instytut Zoologii
szybka kamera wideo	Allied Vision Technologies
macierze LED UV	Instytut Zoologii		30-50 V DC, warsztat elektroniczny λ 390-395 nm Jasność 24 cd
oprogramowanie do digitalizacji Spike2	Vers. 5.05, CED, Cambridge, Wielka Brytania
oprogramowanie do śledzenia ruchu	Mikromak service, Berlin, Niemcy	WINanalyze, Vers. 1.9