Pasażowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Summary

Możliwość manipulowania ludzkimi neuronalnymi komórkami macierzystymi/prekursorowymi (hNSPC) in vitro pozwala badać ich użyteczność jako przeszczepów komórek w celach terapeutycznych i badać rozwój neuronalny człowieka. Protokół ten przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPC w nadziei na zwiększenie odtwarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.

Abstract

Możliwość manipulowania ludzkimi neuronalnymi komórkami macierzystymi/prekursorowymi (hNSPC) in vitro zapewnia środki do zbadania ich użyteczności jako przeszczepów komórek w celach terapeutycznych, a także do zbadania wielu podstawowych procesów rozwoju i patologii neuronalnej człowieka. Protokół ten przedstawia prostą metodę hodowli i pasażowania hNSPC w nadziei na standaryzację tej techniki i zwiększenie odtwarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi. Używane przez nas hNSPC zostały wyizolowane ze zwłok pourodzeniowej kory mózgowej przez National Human Neural Stem Cell Resource i wyhodowane jako kultury przylegające na kolbach pokrytych fibronektyną (Palmer i wsp., 2001; Schwartz i wsp., 2003). Hodujemy nasze hNSPC w pożywce bez surowicy DMEM:F12 uzupełnionej EGF, FGF i PDGF i pasażujemy je w stosunku 1:2 mniej więcej co siedem dni. Korzystając z tych warunków, większość komórek w hodowli utrzymuje dwubiegunową morfologię i wyraża markery niezróżnicowanych nerwowych komórek macierzystych (takich jak nestyna i sox2).

Protocol

Uwaga: Do rutynowej hodowli naszych hNSPC, zmieniamy 50-100% mediów co drugi dzień i zazwyczaj przechodzimy przez nie 1:2 raz w tygodniu. Pożywka hodowlana zawiera 20% BIT-9500, 1X antybiotyk/antybiotyk i czynniki wzrostu (EGF, FGF i PDGF po 40 ng / ml) w pożywce zasadowej DMEM: F12.

Przygotowanie kolby powlekanej i dysocjacja komórek

1. Aby przygotować nowe kolby dla pasażowanych komórek, należy pokryć kolby T25 10 μg/ml ludzkiej fibronektyny w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C. Tuż przed pasażowaniem komórek usuń roztwór fibronektyny i przepłucz kolby PBS.
2. P....

Discussion

Odkryliśmy, że ten protokół zapewnia niezawodne kultury hNSPC. Jednym z krytycznych czynników dla naszych komórek jest to, że muszą być one utrzymywane jako dość gęste kultury i nie mogą być pasażowane do punktu, w którym komórki są rzadkie. W naszych rękach rzadkie kultury rosną bardzo wolno lub całkowicie przestają się dzielić. Z tego powodu zwykle dzielimy nasze kultury 1:2 lub 1:3, gdy kultura jest wyjątkowo gęsta. Pokrycie powierzchni naczynia hodowlanego fibronektyną jest ważne, ponieważ sprzyja dobremu przyłąc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, insulina, transferyna)		Odczynnik Stem Cell Technologies	09500
Odczynnik	antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Odczynnik	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Odczynnik	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Dystrybuowany przez firmę Fisher we wskazanym katalogu #
Odczynnik do surowicy bydlęcej		płodu Invitrogen	10437-028
FGF, ludzki podstawowy rekombinowany	odczynnik	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB		Odczynnik PeproTech Inc	100-00AB
EGF, ludzki rekombinowany	odczynnik	BD Biosciences	CB40052	Dystrybuowane przez Fisher we wskazanym katalogu #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Dystrybuowane przez Fisher we wskazanym katalogu #
Fibronectin, ludzki, naturalny	odczynnik	BD Biosciences	CB40008A	Dystrybuowane przez Fisher we wskazanym katalogu #
Ludzkie neuronalne komórki macierzyste/prekursorowe		Krajowe zasoby ludzkich neuronalnych komórek macierzystych
Odczynnik buforowy do dysocjacji komórek		Invitrogen	13150-016