Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Możliwość manipulowania ludzkimi neuralnymi komórkami macierzystymi/progenitorowymi (hNSPC) in vitro umożliwia badanie ich przydatności jako transplantów komórkowych w celach terapeutycznych, a także zgłębianie wielu fundamentalnych procesów rozwoju i patologii układu nerwowego człowieka. Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę hodowli i pasażowania hNSPC w celu standaryzacji tej techniki i zwiększenia odtwarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi. Wykorzystane przez nas hNSPC zostały wyizolowane z korzy kory mózgowej tkanek pośmiertnych okresu ponatalnego przez National Human Neural Stem Cell Resource i hodowane jako kultury przylegające w kolbach powlekanych fibronektyną (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003). hNSPC hodujemy w bezsurowiczym medium DMEM:F12 uzupełnionym o EGF, FGF i PDGF, a pasażowania dokonujemy w stosunku 1:2 mniej więcej co siedem dni. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię bipolarną i wykazuje ekspresję markerów niezróżnicowanych neuralnych komórek macierzystych (takich jak nestyna i sox2).
Protokół
Uwaga: W przypadku rutynowego hodowania naszych hNSPCs wymieniamy od 50% do 100% pożywki co drugi dzień i zazwyczaj pasażujemy je w stosunku 1:2 raz w tygodniu. Pożywka hodowlana zawiera 20% BIT-9500, 1X antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy oraz czynniki wzrostu (EGF, FGF i PDGF, każdy w stężeniu 40 ng/ml) w pożywce podstawowej DMEM:F12.
Przygotowanie powlekanej kolby i dysocjacja komórek
- Aby przygotować nowe kolby dla pasażowanych komórek, pokryj kolby T25 warstwą 10 µg/ml ludzkiej fibronektyny w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C. Bezpośrednio przed pasażowaniem komórek usuń roztwór fibronektyny i wypłucz kolby za pomocą PBS.
- Przenieś stare „warunkowane” medium z komórek przeznaczonych do pasażowania do nowych kolb pokrytych fibronektyną (tak, aby połowę końcowej objętości medium w każdej kolbie stanowiło medium „warunkowane”). Takie warunki hodowli pomagają utrzymać komórki w stanie niezróżnicowanym.
- Po usunięciu całego medium z komórek przeznaczonych do pasażowania, wypłucz komórki raz za pomocą PBS. Należy zadbać o to, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek.
- Dodaj bufor do dysocjacji komórek (CDB) bezpośrednio na komórki (1,0-1,5 ml dla kolby T25). Inkubuj komórki w buforze przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatne opukiwanie kolby pomoże przyspieszyć odrywanie się komórek.
Wirowanie, resuspensja i wysiewanie komórek
- Do kolby z odseparowanymi komórkami dodać pożywkę z surowicą (DMEM:F12 z 10% nieaktywną termicznie surowicą cielęcą) (użyć objętości ok. 3X objętości CDB). Przenieść pożywkę i komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Użyć niewielkiej objętości świeżej pożywki z surowicą, aby wypłukać kolbę i odzyskać pozostałe komórki.
- Wirować pożywkę z komórkami przy 1000 rpm (~200xg) przez 5 minut.
- Odssać pożywkę z surowicą i resuspenderć komórki w świeżej pożywce hodowlanej, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.
- Przenieść połowę resuspenderowanych komórek do każdej nowej kolby, aby uzyskać podział 1:2. Zapisać numer nowego pasażu na kolbie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stwierdziliśmy, że niniejszy protokół pozwala na uzyskanie niezawodnych kultur hNSPCs. Krytycznym czynnikiem dla naszych komórek jest konieczność utrzymywania ich w postaci dość gęstych kultur; nie mogą one być pasażowane do momentu, w którym stają się rzadkie. W naszych doświadczeniach rzadkie kultury rosną bardzo powoli lub całkowicie przestają się dzielić. Z tego powodu zazwyczaj dzielimy nasze kultury w stosunku 1:2 lub 1:3, gdy kultura jest bardzo gęsta. Pokrycie powierzchni szalki hodowlanej fibronektyną jest istot...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy wyrażają wdzięczność dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children's Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie hNSPCs oraz wstępne instrukcje dotyczące ich hodowli.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, insulina, transferryna) | Odczynnik | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antybiotyk-antymykotyk | Odczynnik | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Odczynnik | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Odczynnik | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym |
| Płodowa surowica bydlęca | Odczynnik | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, ludzki rekombinowany podstawowy | Odczynnik | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Odczynnik | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, ludzki rekombinowany | Odczynnik | BD Biosciences | CB40052 | Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym |
| Kolba do hodowli komórkowej, 25 cm2 | Narzędzie | Corning | 10-126-28 | Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym |
| Fibronektyna, ludzka, naturalna | Odczynnik | BD Biosciences | CB40008A | Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym |
| Ludzkie neuralne komórki macierzyste/prekursorowe | Komórki | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Bufor do dysocjacji komórek | Odczynnik | Invitrogen | 13150-016 |
Bibliografia
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
