Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przesunięcie boczne komórek prostopadle do strumienia przepływu poprzez toczenie się po asymetrycznych wzorach receptorowych stwarza możliwość opracowania nowych urządzeń do bezznacznikowej separacji i analizy komórek1. Takie urządzenia mogą wykorzystywać przesunięcie boczne do separacji w przepływie ciągłym lub wzory receptorowe modulujące adhezję w celu rozróżnienia różnych fenotypów komórek lub poziomów ekspresji receptorów. Zrozumienie natury trajektorii toczenia się komórek na podłożach z wzorami receptorowymi jest niezbędne do inżynierii takich podłoży oraz projektowania tego typu urządzeń.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół badania trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów, które umożliwiają adhezję podczas toczenia2. Dobrze zdefiniowane wzory receptorów P-selectiny w skali μm zostały wytworzone za pomocą mikrodruku kontaktowego na powlekanych złotem szkiełkach, które następnie włączono do komory przepływowej. Komórki HL60 wykazujące ekspresję liganda PSGL-1 3 przepływały przez obszar z wzorowanymi liniami i były wizualizowane za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym. Komórki toczyły się i przemieszczały wzdłuż nachylonych krawędzi wzorów, co prowadziło do odchylenia bocznego1. Każda komórka zazwyczaj toczyła się na określonym dystansie wzdłuż krawędzi wzoru (zdefiniowanym jako długość śledzenia krawędzi), odrywała się od niej i ponownie przytwierdzała do wzoru znajdującego się poniżej nurtu. Choć odrywanie się to utrudnia śledzenie całej trajektorii komórki od momentu wejścia do komory przepływowej aż do wyjścia z niej, do analizy i wyznaczenia trajektorii toczenia się komórek w czasie ich przemieszczania się po pojedynczej linii z wzorem receptorów wykorzystano oprogramowanie do śledzenia cząstek. Następnie przeanalizowano trajektorie w celu uzyskania rozkładów prędkości toczenia się komórek oraz długości śledzenia krawędzi dla każdej komórki w przypadku różnych wzorów.
Niniejszy protokół jest przydatny do ilościowego określania trajektorii toczenia się komórek na wzorach receptorowych oraz odnoszenia ich do parametrów inżynieryjnych, takich jak kąt wzoru i naprężenie ścinające. Takie dane będą użyteczne przy projektowaniu urządzeń mikroprzepływowych do bezetykietowej separacji i analizy komórek.
Protokół
1. Toczenie komórek HL60
1.1. Wytwarzanie strukturyzowanych podłoży.
- Zastosowanie druku mikrokontaktowego (μCP)4-7 w celu utworzenia naprzemiennych samoorganizujących się monowarstw (SAMs) cząsteczek PEG na szklanych płytkach powlekanych złotem: Wykonanie stempli z polidimetylosiloksanu (PDMS) do druku mikrokontaktowego, definiujących wzory receptorów pod kątem nachylenia α = 10°, za pomocą procesu formowania w SU-8. Oczyszczenie powierzchni złota roztworem Piranha (mieszanina kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru w stosunku 3:1) przez 20 minut, a następnie obfite przemycie powierzchni wodąy dejonizowaną (DI) w temperaturze 24,5 °C przed użyciem. Naniesienie na stempel PDMS 5mM roztworu PEG w etanolu. Suszenie stempla na powietrzu przez 20 minut. Delikatne przyłożenie stempla do powierzchni złota na 40 s oraz upewnienie się, że pomiędzy powierzchnią złota a stemplem występuje dobry kontakt. Nie jest wymagany nadmierny nacisk. Przemycie powierzchni etanolem i osuszenie jej strumieniem N2.
- Inkubacja podłoża w roztworze P-selectyny (15 μg/mL w DPBS) przy użyciu komory perfuzyjnej (Electron Microscopy Sciences) przez 3 godziny w temperaturze 24,5°C w celu wzorowania pozostałych obszarów P-selectyną. Przemycie powierzchni obfitym DPBS.
- Wypełnienie pozostałych wolnych miejsc na powierzchni za pomocą BSA (1 mg/mL w DPBS) przez 1 h w celu zablokowania oddziaływań niespecyficznych. Przemycie powierzchni obfitym DPBS.
1.2. Eksperymenty z toczeniem się komórek w komorze przepływowej.
- Przeprowadź przepływ zawiesiny komórek HL60 (~105 komórek/mL) nad obszarami wzorcowymi w prostokątnej komorze przepływowej (Glycotech, Inc; szerokość w = 1,0 cm; długość = 6 cm; wysokość h = 0,0127 cm) w temperaturze 24,5°C. Użyj pompy strzykawkowej (World Precision Instruments, SP230IW) w celu uzyskania natężenia przepływu 75 μL/min, przy odpowiadającym temu naprężeniu ścinającym około 0,5 dyn/cm2 (~0,05 Pa). Oblicz naprężenie ścinające τ, korzystając z równania przepływu Poiseuille'a dla szczeliny τ = 6μQ/wh2, gdzie μ to lepkość kinematyczna (0,0102 Pa s), Q to objętościowe natężenie przepływu, w to szerokość komory przepływowej, a h to wysokość komory przepływowej.
- Użyj mikroskopu odwróconego (Nikon TE20-U) z zamontowaną kamerą (Andor iXon 85), aby zarejestrować oddziaływania toczących się komórek HL60 z adhezyjnymi podłożami P-selectyny, używając obiektywu 4×, zazwyczaj z częstotliwością 1 klatki na sekundę przez czas 300 s. Przeprowadź trzy niezależne eksperymenty dla każdej wartości naprężenia ścinającego oraz kąta nachylenia wzoru. Przedstaw dane jako średnią i odchylenie standardowe wartości średnich uzyskanych z każdego eksperymentu.
- Analiza danych.
Przeanalizuj sekwencje obrazów za pomocą dostosowanego programu Matlab (Mathworks, Inc.), który wykorzystał darmowe oprogramowanie do śledzenia cząstek8 w celu wygenerowania trajektorii wzdłuż krawędzi linii wzorca. Wyselekcjonuj trajektorie rozciągające się do końca pasma P-selectyny i dopasuj do nich dwa proste odcinki – jeden zgodny z kierunkiem przepływu, a drugi zgodny z krawędzią wzorca. Te dwa odcinki służą następnie do obliczenia długości śledzenia krawędzi, prędkości toczenia się na krawędzi oraz prędkości toczenia się w obszarze gładkim.
2. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek (A) przedstawia jeden z obrazów mikroskopowych przekonwertowanych z filmu obrazującego toczące się interakcje komórek HL60 z adhesive substratami P-selektyny przy użyciu obiektywu 4×. Obszary jasne i ciemne odpowiadają odpowiednio regionom receptora P-selektyny oraz regionom PEG. Rysunek (B) przedstawia ścieżki uzyskane przy użyciu dostosowanego programu Matlab. Kąt nachylenia krawędzi wynosił 10° a naprężenie ścinające wynosiło 0,5 dyn/cm²2długość śledzenia krawędzi, Leprzemieszczenie, d oraz prędkości toczenia na krawędzi i wewnątrz obręczy, Ve i Vpodpowiednio, zostały opisane w Rycina (C-1). Rysunek (C-2) przedstawia rozkład (liczbę zarejestrowanych komórek) długości śledzenia krawędzi. Wstawki pokazują średnią wartość le a prędkość toczenia na krawędzi (Ve) oraz wewnątrz prążków (Vp) przy kącie nachylenia α =10° or wartość naprężenia ścinającego płynu około 0,5 dyn/cm²2Słupki błędów przedstawiają jedno odchylenie standardowe, gdzie n = 3 powtórzone eksperymenty (3 powtórne powierzchnie) dla każdego stanu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy protokół badania trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych powierzchniach z wzorem receptorów, wytworzonych za pomocą mikrodruku kontaktowego2. Obrazy z mikroskopu optycznego powierzchni z naniesionym wzorem, wykazujące wyraźny kontrast między obszarami PEG a P-selektyny, mogą służyć do potwierdzenia poprawności procesu stemplowania. W przypadku prawidłowego stemplowania obserwuje się ostre, proste krawędzie. Zbyt mocne dociskanie stempla może prowadzić do jego deformacji, co ogranicza prec...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Projekt ten był wspierany przez Deshpande Center for Technological Innovation w MIT (R.K. i J.M.K.) oraz grant NSF CAREER 0952493 przyznany R.K. w ramach programu Chemical and Biological Separations. Dziękujemy Institute for Soldier Nanotechnologies (ISN) oraz Microsystems Technology Laboratory (MTL) w MIT za udostępnienie zaplecza badawczego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ludzkie komórki białaczki promielocytowej | ATCC | CCL-240 | komórki HL60 |
| Szkiełka szklane powlekane złotem | EMF | TA134 | szkiełka złote |
| (1-merkaptoundec-11-yl)tetra(glikol etylenowy) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Rekombinowana ludzka P-selektyna | R&D Systems | ADP3-050 | P-selektyna |
| Seryczna albumina bydlęca | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Fosforanowy bufor solny Dulbecco’s | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Kwas siarkowy | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma-Aldrich | 316989 |
Bibliografia
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
