Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorowych

Podsumowanie

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznymi wzorami receptorowymi. Otrzymane dane są użyteczne przy projektowaniu podłoży z wzorami receptorowymi do bezetykietowej separacji i analizy komórek.

Streszczenie

Lateralne przemieszczanie komórek prostopadle do strumienia przepływu poprzez toczenie się po asymetrycznych wzorach receptorowych stwarza możliwość opracowania nowych urządzeń do bezznakowej separacji i analizy komórek¹. Takie urządzenia mogą wykorzystywać lateralne przemieszczanie do separacji w przepływie ciągłym lub wzory receptorowe modulujące adhezję w celu rozróżnienia różnych fenotypów komórkowych lub poziomów ekspresji receptorów. Zrozumienie charakteru trajektorii toczenia się komórek na podłożach z wzorami receptorowymi jest niezbędne do inżynierii tych podłoży oraz projektowania takich urządzeń.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół badania trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorowych wspomagających adhezję toczną komórek². Dobrze zdefiniowane wzory receptorów P-selektyny w skali µm zostały przygotowane za pomocą druku mikrokontaktowego na szkiełkach pokrytych złotem, które wbudowano w komorę przepływową. Komórki HL60 wykazujące ekspresję ligandu PSGL-1 ³ przepuszczano przez pole wzorowanych linii i wizualizowano za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym. Komórki toczyły się i przemieszczały wzdłuż nachylonych krawędzi wzorów, co skutkowało odchyleniem bocznym¹. Każda komórka zazwyczaj toczyła się przez określony dystans wzdłuż krawędzi wzoru (zdefiniowany jako długość śledzenia krawędzi), odrywała się od niej i ponownie przytwierdzała do wzoru znajdującego się poniżej nurtu. Choć odrywanie się to utrudnia śledzenie całej trajektorii komórki od wejścia do wyjścia z komory przepływowej, do analizy i wyznaczenia trajektorii tocznych komórek w czasie ich ruchu po pojedynczej linii wzorowanej receptorami wykorzystano oprogramowanie do śledzenia cząstek. Następnie przeanalizowano trajektorie w celu uzyskania rozkładów prędkości toczenia się komórek oraz długości śledzenia krawędzi dla każdej komórki przy różnych wzorach.

Niniejszy protokół jest przydatny do ilościowego określania trajektorii toczenia się komórek na wzorach receptorowych oraz odnoszenia ich do parametrów inżynieryjnych, takich jak kąt wzoru i naprężenie ścinające. Takie dane będą pomocne przy projektowaniu urządzeń mikroprzepływowych do bezznacznikowej separacji i analizy komórek.

Protokół

1. Toczenie komórek HL60

1.1. Wytwarzanie podłoży z wzorem.

1. Wykorzystanie druku mikrokontaktowego (μCP)^4-7 do wytworzenia naprzemiennych samoorganizujących się monowarstw (SAMs) z cząsteczek PEG na szklanych szkiełkach powlekanych złotem: Wykonano stemple z polidimetylosiloksanu (PDMS) do druku mikrokontaktowego, które definiowały wzory receptorów z kątem nachylenia α = 10°, stosując proces formowania z użyciem żywicy SU-8. Powierzchnię złota oczyszczono roztworem piranha (mieszanina kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru w stosunku 3:1) przez 20 minut, a następnie, przed użyciem, przepłukano powierzchnię obficie wodą DI w temperaturze 24.5 °C. Stempel PDMS naniesiono roztworem PEG 5mM w etanolu. Stempel suszono na powietrzu przez 20 minut. Stempel delikatnie przyłożono do powierzchni złota na 40 sec, dbając o zapewnienie dobrego kontaktu między powierzchnią złota a stemplem. Nie jest wymagany nadmierny nacisk. Powierzchnię przepłukano etanolem i osuszono strumieniem N₂.
2. Podłoże inkubowano w roztworze P-selectiny (15 μg/mL w DPBS) przy użyciu komory perfuzyjnej (Electron Microscopy Sciences) przez 3 hours w temperaturze 24.5°C, aby pokryć pozostałe obszary P-selectiną. Powierzchnię przepłukano obficie DPBS.
3. Powierzchnię dopełniono BSA (1 mg/mL w DPBS) przez 1 h w celu zablokowania oddziaływań niespecyficznych. Powierzchnię przepłukano obficie DPBS.

1.2. Eksperymenty z toczeniem się komórek w komorze przepływowej.

1. Przepłyń zawiesinę komórek HL60 (~10⁵ komórek/mL) nad wzorcowanymi powierzchniami w prostokątnej komorze przepływowej (Glycotech, Inc; szerokość w = 1,0 cm; długość = 6 cm; wysokość h = 0,0127 cm) w temperaturze 24,5°C. Użyj pompy strzykawkowej (World Precision Instruments, SP230IW), aby uzyskać szybkość przepływu 75 μL/min, co odpowiada naprężeniu ścinającemu około 0,5 dyn/cm² (~0,05 Pa). Oblicz naprężenie ścinające τ, korzystając z równania przepływu Poiseuille’a dla szczeliny τ = 6μQ/wh², gdzie μ to lepkość kinematiczna (0,001002 Pa s), Q to objętościowe natężenie przepływu, w to szerokość komory przepływowej, a h to wysokość komory przepływowej.
2. Użyj mikroskopu odwróconego (Nikon TE2000-U) z zamontowaną kamerą (Andor iXon 885), aby zarejestrować interakcje toczenia się komórek HL60 na adhezyjnych podłożach z P-selectyną, używając obiektywu 4×, zazwyczaj z częstotliwością 1 klatki na sekundę przez czas 300 s. Przeprowadź trzy niezależne eksperymenty dla każdej wartości naprężenia ścinającego i kąta nachylenia wzoru. Przedstaw dane jako średnią i odchylenie standardowe z wartości średnich uzyskanych z każdego eksperymentu.
3. Analiza danych.
   Przeanalizuj sekwencje obrazów za pomocą dostosowanego programu Matlab (Mathworks, Inc.), który wykorzystywał darmowe oprogramowanie do śledzenia cząstek⁸ w celu wygenerowania ścieżek wzdłuż krawędzi wzorcowanych linii. Ścieżki rozciągające się do końca pasma P-selectyny są wybierane i dopasowywane do dwóch odcinków linii prostej – jednego zgodnego z kierunkiem przepływu, a drugiego zgodnego z krawędzią wzoru. Te dwa segmenty są następnie wykorzystywane do obliczenia długości śledzenia krawędzi, prędkości toczenia się na krawędzi oraz prędkości toczenia się w obszarze gładkim.

2. Reprezentatywne wyniki:

Rycina (A) przedstawia jeden z obrazów mikroskopowych przekształconych z filmu ukazującego interakcje toczenia się komórek HL60 na adhezyjnych podłożach z P-selektyną przy użyciu obiektywu 4×. Jasne i ciemne obszary odpowiadają odpowiednio receptorom P-selektyny i regionom PEG. Rycina (B) pokazuje ścieżki uzyskane przy użyciu dostosowanego programu Matlab. Kąt nachylenia krawędzi wynosił 10°, a naprężenie ścinające 0,5 dyn/cm². Długość śledzenia krawędzi, l_e, przemieszczenie, d, oraz prędkości toczenia się na krawędzi i wewnątrz pasów, odpowiednio V_e i V_p, są opisane na Rycini (C-1). Rycina (C-2) przedstawia rozkład (liczbę zarejestrowanych komórek) długości śledzenia krawędzi. Wstawki pokazują średnią wartość l_e oraz prędkość toczenia się na krawędzi (V_e) i wewnątrz pasów (V_p) przy kącie nachylenia α =10° i wartości naprężenia ścinającego płynu około 0,5 dyn/cm². Słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe, gdzie n = 3 powtórne eksperymenty (3 powtórne powierzchnie) dla każdego warunku.

Dyskusja

Opisaliśmy protokół badania trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych powierzchniach z wzorami receptorów, wykonanych przy użyciu mikrodruku kontaktowego². Obrazy z mikroskopu optycznego powierzchni wzorzystej, wykazujące wyraźny kontrast między obszarami PEG a P-selectyny, mogą służyć do potwierdzenia prawidłowości procesu stemplowania. W przypadku prawidłowego wykonania stemplowania można zaobserwować ostre, proste krawędzie. Zbyt mocny docisk stempla może prowadzić do jego odkształcenia, co ogranic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki białaczki promielocytowej	ATCC	CCL-240	komórki HL60
Szklane preparaty powlekane złotem	EMF	TA134	preparaty złote
(1-merkaptoundek-11-ylo)tetra(glikol etylenowy)	Sigma-Aldrich	674508	PEG
Rekombinowana ludzka P-selektyna	R&D Systems	ADP3-050	P-selektyna
Seryjna albumina bydlęca	Rockland Immunochemicals	BSA-50	BSA
Dulbecco’ fosforanowy bufor solny	Mediatech, Inc.	21-030	DPBS
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	339741
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	316989