W niniejszym artykule opisano metodę elektrofizjologiczną służącą do izolowanej stymulacji chemicznej poszczególnych sensilli poprzez zewnątrzkomórkowe rejestracje końcówkowe w oleju mineralnym.
Artykuł metodologiczny
Elektrofizjologia sensilli typu peg u skorpionów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy modyfikację istniejącej techniki rejestracji końcówkowej (tip-recording)1,2 służącą do elektrofizycznych badań krótkich, przypominających kołki sensilli sensorycznych3,4. Na środkowej powierzchni brzusznej wszystkich skorpionów znajdują się dwie wyrostki zwane grzebieniami (pectines), które posiadają gęste pola mechanoreceptywnych i chemoreceptywnych sensilli w formie kołków5,6. Jedna z metod oceny chemoreaktywności tych sensilli wykorzystuje elektrodę wolframową do pozakomórkowej rejestracji aktywności neuronalnej wewnątrz sensillum podczas wprowadzania lotnego substancji zapachowej do pola sensorycznego5,7. Ograniczenia tej metody obejmują powolny zbiór danych oraz brak kontroli nad wprowadzaniem i usuwaniem stymulanta z pola kołków. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nową technikę rejestracji końcówkowej, w której wykorzystuje się niepolarny olej mineralny jako medium do dostarczania substancji smakowych na bazie wody do pojedynczych sensilli w formie kołków8,9. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w celu uzyskania chemoreakcji sensillarnych na kwas cytrynowy, etanol i sól. W niniejszym pracy opisujemy protokół eksperymentalny dla takiego badania9. Uważamy, że ta nowa metoda może być użyteczna w badaniu właściwości odpowiedzi innych chemoreceptywnych systemów stawonogów, w tym owadów10, 11 i skorupiaków12.
Protokół
1. Przygotowanie żywego zwierzęcia przed nagrywaniem
- Wyjmij skorpiona ze słoika i umieść go w schłodzonym naczyniu szklanym; następnie włóż naczynie ze skorpionem do środowiska mroźnego (-5 °C) na minimum dwie minuty. Czas ten może się różnić w zależności od wieku, rozmiaru, gatunku itp. konkretnego badanego skorpiona. Zazwyczaj faza mrożenia kończy się, gdy zwierzę pozostanie nieruchome.
- Po dwóch minutach wyjmij unieruchomionego skorpiona ze schłodzonego naczynia szklanego i ułoż go stroną brzuszną do góry na szkiełku mikroskopowym. Unieruchom żądło, ogon, odnóża i pedipalpy za pomocą plastycznej gliny (na bazie olejów, Van Aken Plastalina).
- Przygotuj platformę, na której zostaną umieszczone grzebienie skorpiona. Dostosuj długość i szerokość platformy do rozmiaru grzebienia. Zazwyczaj nasze platformy są wykonane z nakrywki szkiełka mikroskopowego i mają wymiary około 10(L) X 18(W) mm.
- Przyklej dwustronną taśmę klejącą do platformy pod grzebień, przycinając taśmę (jeśli to konieczne), aby pasowała do wymiarów.
- Aby stworzyć komorę grzebieniową, zanurz trzy z czterech boków platformy w uprzednio roztopionym wosku (stosujemy 100% płatków wosku pszczelego) na głębokość 3-4 mm. Wosk roztapiamy, umieszczając płatki w szklanej płytce Petriego na płycie grzejnej. Po ochłodzeniu wosku na krawędziach komory grzebieniowej do temperatury pokojowej powinny powstać ścianki woskowe o wysokości około 1 mm.
- Zlokalizuj u zwierzęcia miejsce przyczepu grzebienia i umieść niepowleczoną woskiem krawędź platformy (stroną z taśmą do góry) bezpośrednio za nim. Następnie ustabilizuj platformę (tak, aby nie przesuwała się w późniejszym czasie), delikatnie dociskając jej prawe i lewe krawędzie peryferyjne do gliny użytej do unieruchomienia odnóży zwierzęcia.
- Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami ostrożnie umieść grzebień lub grzebienie wewnątrz komory. Konkretnie, trzymając pęsetą grzebień wzdłuż kolca grzebieniowego, delikatnie wysuń grzebień spod nakrywki szklanej i opuść go na klejącą powierzchnię platformy. Utwórz połączenie grzebienia z taśmą, ostrożnie dociskając kolec grzebieniowy.
- Teraz nanieś roztopiony wosk (używamy podgrzanej metalowej szpatułki) na niepowleczoną woskiem krawędź platformy. Cel jest dwukrotny: zabezpieczyć grzebień oraz całkowicie zamknąć komorę w celu późniejszego wprowadzenia oleju mineralnego. Zachowaj ostrożność podczas nakładania wosku nad grzebieniem zwierzęcia, ponieważ zbyt gorący wosk może go uszkodzić.
- Konstrukcja komory grzebieniowej jest zakończona. Następnie wykonaj połączenie z elektrodą obojętną z hemolimfą zwierzęcia, wprowadzając srebrny drut pomiędzy dwa segmenty ogona.
2. Symultaniczne rejestrowanie zewnątrzkomórkowe i stymulacja chemiczna
- Przygotowujemy zwierzę na 24 h przed przeprowadzeniem zewnątrzkomórkowych pomiarów metodą tip-recording, co – między innymi ze względu na aklimatyzację zwierzęcia do ustalonej pozycji – pozwala na wykonanie pipet stymulujących o specyficznej (zależnej od sensillum) średnicy końcówki. Do uzyskania takich parametrów wykorzystujemy wyciągacz mikrokapilar. Idealnie średnica pipet powinna być o ≈ 2 μm większa od średnicy poru sensillarnego. Parametry mikrokapilar dostosowujemy odpowiednio dla każdego zwierzęcia.
- Na 1 h przed rejestracją dodajemy 5 μl oleju mineralnego do komory grzebieniowej, zanurzając grzebień w oleju. Następnie umieszczamy zwierzę pod wysokiej klasy mikroskopem wyposażonym w obiektywy o dużej odległości roboczej i oświetlenie episkopowe.
- Aby chemicznie stymulować sensilla peg, wprowadzamy wodne substancje smakowe (np. kwas cytrynowy i sól) przez medium olejowe. Najpierw, za pomocą napełniacza mikrokapilar, wstrzykujemy stymulant do pipety stymulującej. Uwaga: wszystkie roztwory stymulujące powinny zawierać elektrolit w celu zapewnienia przewodnictwa elektrycznego.
- Następnie, po umieszczeniu pipety stymulującej w mikromanipulatorze (w układzie rejestracyjnym), wkładamy elektrodę pomiarową do tępego, otwartego końca pipety stymulującej. Ważne jest zapewnienie kontaktu między metalową elektrodą a elektrolitycznym roztworem stymulującym.
- Po uziemieniu elektrycznym preparatu (poprzez elektrodę obojętną), po prostu opuszczamy pipetę przez medium olejowe na por sensillarny. Czas trwania stymulacji chemicznej pojedynczego sensillum grzebieniowego może wynosić od trzydziestu minut do jednej sekundy. Zazwyczaj możemy pobrać próbki z wielu pegów (> 30) przy użyciu jednej pipety. W przypadku zapchania pipety stymulującej drobnymi zanieczyszczeniami, należy wymienić zapchaną pipetę na nową, nieużywaną.
3. Przygotowanie zwierzęcia do wielodniowych eksperymentów
- Jeśli zwierzę ma być wykorzystywane przez dłuższy czas, zalecamy ponowne użycie komory grzebieniowej i wymianę kropli oleju mineralnego przed każdą sesją rejestracyjną. Po zakończeniu danej sesji rejestracyjnej należy usunąć zwierzę z układu pomiarowego i przeprowadzić płukanie olejem mineralnym.
- W tym celu należy dodać do komory kolejną kroplę (5 μl) oleju mineralnego, a następnie usunąć cały olej. Pomaga to zminimalizować obecność pozostałości stymulatora, który mógł wycieknąć z pipety podczas sesji rejestracyjnej.
- Przed kolejną sesją należy dodać jedną kroplę oleju, zgodnie z wcześniejszym opisem.
4. Reprezentatywne wyniki:
W zależności od zastosowanego sprzętu rejestrującego (np. konkretnego wzmacniacza, sprzętu do digitalizacji itp.), reprezentatywnym wynikiem jest rejestracja pozakomórkowa ze stosunkiem S:N wynoszącym co najmniej 3:1.
Prawidłowe przygotowanie komory z olejem mineralnym jest niezbędne do izolacji stymulacji chemicznej poszczególnych sensyli, ponieważ zapewnia ona medium do dostarczania polarnych (na bazie wody) substancji smakowych8. Jeśli oleju jest zbyt mało lub nie ma go wcale, roztwór stymulujący rozprzestrzeni się z rejestrowanego sensillum na sensyla sąsiednie, co prawdopodobnie spowoduje przedłużoną, niekontrolowaną stymulację chemiczną8.
Dyskusja
Powyższy protokół opisuje sposób przygotowania skorpiona z preri pustynnych (Paruroctonus utahensis) do badań elektrofizjologicznych. W szczególności pokazujemy, jak zbudować komorę do kontrolowanych zewnątrzkomórkowych rejestracji z końcówki elektrody z neuronów chemosensorycznych grzebieni pod warstwą oleju. Ponieważ olej i woda nie mieszają się, możliwe jest ograniczenie stymulacji chemicznej (za pomocą stymulantów na bazie wody) do pojedynczych sensyli. Należy podkreślić, że P. utahensis jest stosunkowo małym zwierzęciem (≈ 2,5-5 cm) i zastosowanie tego protokołu u większych zwierząt może wymagać wielu korekt rozmiarowych, takich jak wymiary platformy dla zwierzęcia, komory oraz ilość zastosowanego oleju. Zalecamy przeprowadzenie badań pilotażowych w celu ustalenia minimalnej ilości oleju niezbędnej do kontrolowanego podawania wodnych stymulantów chemicznych.
Ponadto nie stwierdzono wpływu oleju na podstawową aktywność neuronalną w sensylach grzebieniowych8. Należy to potwierdzić również w przypadku innych systemów modelowych przed oceną chemoodpowiedzi.
Tę metodę można stosować w połączeniu z inną metodą w celu zbadania efektów interakcji odpowiedzi chemicznej pomiędzy sensillami w polu sensorycznym. Na przykład możliwe jest rejestrowanie sygnału z wierzchołka (pod warstwą oleju) jednej sensilli, podczas gdy rejestrujemy sygnał z podstawy (za pomocą elektrody wolframowej) sąsiedniej sensilli9. Taka konfiguracja rejestracji może być wykorzystana do oceny, czy stymulacja chemiczna jednej sensilli wpływa na aktywność neuronalną sensilli rejestrowanej u podstawy. Do tej pory nikt nie badał tego zjawiska w przypadku sensilli grzebieniowych skorpionów, a kwestia ta pozostaje otwarta również dla innych systemów chemosensorycznych.
Podsumowując, uważamy, że metoda rejestracji końcówką elektrody w środowisku olejowym poszerza zakres badań elektrofizjologicznych nad neuronalnymi podstawami smaku u stawonogów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przygotowania zwierząt do tej metody i mamy nadzieję, że stanowić on będzie solidną podstawę dla dalszych badań nad obwodowymi układami nerwowymi zmysłów.
Oświadczenia
Metody te opublikowaliśmy wcześniej w dwóch czasopismach: Knowlton i Gaffin (2009) oraz Knowlton i Gaffin (w druku).
Podziękowania
Dziękujemy funduszowi Life, Programowi Możliwości Badawczych dla Studentów Uniwersytetu w Oklahomie oraz Katedrze Zoologii za sfinansowanie tych prac. Dziękujemy również dr Mariëlle Hoefnagels za pomoc redakcyjną.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Karta Lift-N-Press | Ted Pella, Inc. | 16082 | Dwustronna taśma klejąca |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Wypełniacz do mikropipet |
| Standardowe kapilary szklane | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Pipety szklane |
| Uchwyt mikro–elektrody | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
Bibliografia
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
Przedruki i uprawnienia
