$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zdefiniowanie subkomórkowego rozkładu kompleksów sygnalizacyjnych jest niezbędne do zrozumienia wyjścia z tego kompleksu. Konwencjonalne metody, takie jak immunoprecypitacja, nie dostarczają informacji na temat lokalizacji przestrzennej kompleksów. W przeciwieństwie do tego, BiFC monitoruje interakcję i subkomórkową kompartmentalizację kompleksów białkowych. W tej metodzie białko fluorescencyjne jest dzielone na amino- i karboksylowe niefluorescencyjne fragmenty, które są następnie łączone z dwoma interesującymi białkami. Interakcja białek prowadzi do odtworzenia fluoroforu (ryc. 1)1,2. Ograniczeniem BiFC jest to, że po rozpuszczeniu rozdrobnionego fluoroforu kompleks jest nieodwracalny3. To ograniczenie jest korzystne w wykrywaniu oddziaływań przejściowych lub słabych, ale wyklucza analizę kinetyczną złożonej dynamiki. Dodatkowym zastrzeżeniem jest to, że odtworzony flourofor potrzebuje 30 minut, aby dojrzeć i fluoryzować, co ponownie wyklucza obserwację interakcji w czasie rzeczywistym4. BiFC jest specyficznym przykładem testu komplementacji fragmentów białka (PCA), który wykorzystuje białka reporterowe, takie jak warianty białek zielonej fluorescencji (BiFC), reduktaza dihydrofolianowa, b-laktamaza i lucyferazy do pomiaru interakcji białko-białko5,6. Alternatywne metody badania interakcji białko-białko w komórkach obejmują kolokalizację fluorescencji i rezonansowy transfer energii Förstera (FRET)7. W celu kolokalizacji dwa białka są indywidualnie znakowane albo bezpośrednio fluoroforem, albo przez immunofluorescencję pośrednią. Jednak takie podejście prowadzi do wysokiego tła białek nieoddziałujących, co utrudnia interpretację danych dotyczących kolokalizacji. Ponadto, ze względu na ograniczenia rozdzielczości mikroskopii konfokalnej, dwa białka mogą wydawać się kolokalizowane bez konieczności oddziaływania. W przypadku BiFC fluorescencję obserwuje się tylko wtedy, gdy dwa interesujące białka wchodzą w interakcję. FRET to kolejna doskonała metoda badania interakcji białko-białko, ale może być trudna technicznie. Eksperymenty FRET wymagają, aby dawca i akceptor mieli podobną jasność i stechiometrię w komórce. Ponadto należy wziąć pod uwagę przeciek dawcy do kanału akceptorowego i odwrotnie. W przeciwieństwie do FRET, BiFC ma niewielką fluorescencję tła, niewielkie przetwarzanie końcowe danych obrazu, nie wymaga dużej nadekspresji i może wykrywać słabe lub przejściowe oddziaływania. Transfer energii rezonansu bioluminescencyjnego (BRET) jest metodą podobną do FRET, z wyjątkiem tego, że donorem jest enzym (np. lucyferaza), który katalizuje substrat, aby stał się bioluminescencyjny, pobudzając w ten sposób akceptor. BRET nie ma problemów technicznych związanych z przebijaniem i wysoką fluorescencją tła, ale brakuje mu możliwości dostarczania informacji przestrzennych ze względu na brak lokalizacji substratu do określonych przedziałów8. Ogólnie rzecz biorąc, BiFC jest doskonałą metodą wizualizacji subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w celu uzyskania wglądu w sygnalizację przedziałową.