Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Określenie rozmieszczenia subkomórkowego kompleksów sygnalizacyjnych jest niezbędne do zrozumienia efektu działania danego kompleksu. Konwencjonalne metody, takie jak immunoprecypitacja, nie dostarczają informacji o lokalizacji przestrzennej kompleksów. W przeciwieństwie do nich, BiFC monitoruje interakcje i kompartymentację subkomórkową kompleksów białkowych. W tej metodzie białko fluorescencyjne jest podzielone na niefluorescencyjne fragmenty aminokońcowy i karboksykońcowy, które następnie są łączone z dwoma badanymi białkami. Interakcja białek prowadzi do rekonstrukcji fluoroforu (Rysunek 1)1,2. Ograniczeniem BiFC jest fakt, że po rekonstrukcji pofragmentowanego fluoroforu kompleks staje się nieodwracalny3. Ograniczenie to jest korzystne przy wykrywaniu interakcji przejściowych lub słabych, ale wyklucza analizę kinetyczną dynamiki kompleksu. Dodatkową uwagą jest to, że zrekonstruowany fluorofor wymaga 30min na dojrzewanie i emisję fluorescencji, co ponownie uniemożliwia obserwację interakcji w czasie rzeczywistym4. BiFC jest szczególnym przykładem testu komplementacji fragmentów białek (PCA), który wykorzystuje białka reporterowe, takie jak warianty zielonego białka fluorescencyjnego (BiFC), reduktazę dihydrofolianową, β-laktamazę oraz lucyferazę, do pomiaru interakcji białko-białko5,6. Alternatywnymi metodami badania interakcji białko-białko w komórkach są ko-lokalizacja fluorescencyjna oraz Försterowski transfer energii rezonansowej (FRET)7. W przypadku ko-lokalizacji dwa białka są znakowane indywidualnie, albo bezpośrednio fluoroforem, albo poprzez pośrednią immunofluorescencję. Jednak podejście to prowadzi do wysokiego tła białek nieoddziałujących, co utrudnia interpretację danych o ko-lokalizacji. Ponadto, ze względu na granice rozdzielczości mikroskopii konfokalnej, dwa białka mogą wydawać się ko-lokalizowane, niekoniecznie wchodząc w interakcję. W BiFC fluorescencja jest obserwowana tylko wtedy, gdy dwa badane białka wchodzą w interakcję. FRET jest kolejną doskonałą metodą badania interakcji białko-białko, ale może być wymagająca technicznie. Eksperymenty FRET wymagają, aby donor i akceptor mieli podobną jasność i stechiometrię w komórce. Ponadto należy uwzględnić przenikanie sygnału donora do kanału akceptora i odwrotnie. W przeciwieństwie do FRET, BiFC wykazuje niewielką fluorescencję tła, wymaga niewielkiej postprodukcji danych obrazowych, nie wymaga wysokiej nadekspresji i może wykrywać słabe lub przejściowe interakcje. Bioluminescencyjny transfer energii rezonansowej (BRET) jest metodą podobną do FRET, z wyjątkiem tego, że donorem jest enzym (np. lucyferaza), który katalizuje substrat, aby stał się bioluminescencyjny, pobudzając tym samym akceptor. BRET jest pozbawiony problemów technicznych związanych z przenikaniem sygnału i wysoką fluorescencją tła, ale nie pozwala na uzyskanie informacji przestrzennych ze względu na brak lokalizacji substratu w konkretnych przedziałach8. Podsumowując, BiFC jest doskonałą metodą wizualizacji lokalizacji subkomórkowej kompleksów białkowych, pozwalającą uzyskać wgląd w kompartymentowaną sygnalizację.
Protokół
A. Kalibracja BiFC
- Wybierz fluorofor. Istnieje wiele fluoroforów, takich jak YFP i Venus, które dobrze sprawdzają się jako partnerzy fuzyjni w metodzie BiFC (Tabela 1). Końce aminowy i karboksylowy białka Venus są w stanie utworzyć kompleks w 37°C, podczas gdy fragmenty YFP BiFC wymagają wstępnej inkubacji w 30°C w celu ułatwienia tworzenia się fluoroforu2Inkubacja w niskiej temperaturze może zmienić niektóre procesy komórkowe, co należy uwzględnić podczas wyboru fragmentów. Wektory do fuzji białka Venus z końcem karboksylowym białek są dostępne w Addgene (http://www.addgene.org/pgvec1; seepBiFC-VN173 oraz pBiFC-VC155) wraz z dodatkowymi konstruktami do wykorzystania jako kontrole, np. pBiFC-bJunVN173 oraz pBiFC-bFosVC152Dodatkowe wektory, w tym wektory Venus z końcem aminowym (pFLAG-VN173 i pHA-VC15), są dostępne w następującej witrynie: http://people.pnhs.purdue.edu/~hu1/.
- Oznacz białko docelowe. Fragmenty BiFC są łączone z końcami aminowymi lub karboksylowymi białek kandydowanych. Niektóre białka mogą nie dopuszczać znakowania na żadnym z końców ze względu na ryzyko zaburzenia ich funkcji. Na przykład wiele białek z superrodziny GTPaz Ras ulega modyfikacji lipidowej na końcu karboksylowym, co uniemożliwia przyłączenie fragmentów BiFC do tego końca. Dlatego istotne jest posiadanie wiedzy na temat tego, w jaki sposób przyłączenie fragmentów BiFC może wpłynąć na funkcję badanych białek. W przypadku niepewności co do wpływu znakowania białka na jego funkcję należy przetestować kilka kombinacji. Oprócz fragmentu BiFC można zastosować łącznik peptydowy w celu zwiększenia elastyczności między pofragmentowanym fluoroforem a białkami kandydowanymi. Choć miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) w wektorach BiFC kodują krótkie sekwencje aminokwasowe, które mogą zapewniać wystarczającą elastyczność, w eksperymentach BiFC z sukcesem stosowano łączniki RSIAT, KQKVMNH oraz RPACKIPNDLKQKVMNH.3,9
- Wyznaczenie warunków transfekcji. Przed przetestowaniem wielu mutantów należy przeprowadzić kilka eksperymentów kontrolnych. Pierwsze dwie kombinacje BiFC, które należy sprawdzić, to dwie białka typu dzikiego, o których wiadomo, że oddziałują ze sobą, oraz jedno białko typu dzikiego i mutant, które nie oddziałują ze sobą. Wykorzystując te dwie kombinacje, należy przetestować różne ilości DNA oraz czasy transfekcji, aby określić optymalne warunki wykrywania sygnału BiFC dla białek kandydackich. Sugerujemy przetestowanie 0,25 µg, 0,5 µg i 1,0 µg każdego konstruktu BiFC na pojedynczą studzienkę płytki 6-dołkowej. Dzień po transfekcji należy monitorować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić optymalny czas rozwoju sygnału. pBiFC-bJunVN173oraz pBiFC-bFosVC152Konstrukty te stanowią przydatne pozytywne kontrole dla BiFC i są dostępne w Addgene (patrz wyżej). Ponadto należy przeprowadzić analizę Western blot, aby potwierdzić równy poziom ekspresji konstruktów. Warunki należy dobrać w taki sposób, aby zaobserwować sygnał fluorescencyjny pomiędzy dwoma białkami typu dzikiego, przy jednoczesnym braku lub minimalnym sygnale pomiędzy białkiem typu dzikiego a białkiem zmutowanym. Wreszcie najlepiej zachować jak najniższy poziom ekspresji białek, aby zapobiec wszelkim niespecyficznym oddziaływaniom.
- Należy ustalić, czy dodanie fragmentów BiFC zmienia lokalizację badanych białek. Każdy konstrukt BiFC zawiera epitop HA lub FLAG. Przeprowadź immunohistochemiczne barwienie przetransfekowanych komórek zarówno w kierunku epitopu HA lub FLAG, jak i białka endogennego (jeśli to możliwe), aby ustalić, czy znacznik BiFC wpływa na lokalizację badanych białek.
B. Wysiewanie i transfekcja komórek
- Komórki COS (1,3x105) wysiewa się po jednej na szklaną płytkę Matek oraz do dwóch studzienek płytki 6-dołkowej dla każdej próbki. Pozostawia się komórki do osadzenia na noc w temperaturze 37°C. Można również zastosować inne typy komórek, bardziej odpowiednie dla analizowanych białek kandydackich.
- Przygotowuje się DNA do transfekcji. W przypadku transfekcji komórek COS zazwyczaj stosujemy Lipofectamine (Invitrogen). Jednakże dla innych linii komórkowych mogą być bardziej odpowiednie inne odczynniki. Ponieważ mieszanina do transfekcji zostanie podzielona między jedną płytkę z szklanym dnem a dwie studzienki płytki 6-dołkowej, należy użyć odpowiedniej ilości DNA, aby uwzględnić ten podział. DNA rozcieńcza się w 250uL bezserwatkowego (SF) DMEM. Jako kontrolę transfekcji dodaje się CFP w ilości stanowiącej 1/5 całkowitej ilości DNA BiFC. W celu kwantyfikacji BiFC analizowane pod kątem obecności sygnału BiFC będą tylko komórki wykazujące pozytywny wynik dla CFP. Należy pamiętać, że widma CFP będą nakładać się na niektóre pary BiFC wymienione w Tabeli 1; w związku z tym może być konieczne zastosowanie alternatywnej kontroli transfekcji. Lipofectamine rozcieńcza się w 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug DNA). Mieszaniny DNA i rozcieńczalnika Lipofectamine łączy się i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 20min.
Uwaga: Stosunek Lipofectamine:DNA może się różnić w zależności od typu komórek. Należy zastosować odpowiednią metodę transfekcji dla danej linii komórkowej. - Komórki płucze się 2x ciepłym SF DMEM. Do każdej płytki z szklanym dnem lub studzienki płytki 6-dołkowej dodaje się 2mL SF DMEM.
- Każdą mieszaninę do transfekcji dzieli się równomiernie między jedną płytkę z szklanym dnem a dwie studzienki płytki 6-dołkowej.
- Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 5h.
- Pożywkę do transfekcji usuwa się i zastępuje pożywką kompletną (DMEM+10%FBS).
- Komórki inkubuje się na noc w temperaturze 37°C. Czas inkubacji po transfekcji będzie się różnić w zależności od poziomu ekspresji analizowanych białek. Przedłużona inkubacja może prowadzić do niespecyficznych oddziaływań, dlatego ten etap musi zostać określony empirycznie.
C. Przygotowanie komórek do obrazowania
- Komórki należy początkowo zbadać pod mikroskopem epifluorescencyjnym, aby upewnić się, że kontrola pozytywna wykazuje fluorescencję. W przeciwnym razie może być konieczne pozostawienie komórek na dłuższy czas w temperaturze 37°C, aż do momentu zaobserwowania sygnału.
- Komórki przepłukać 3x buforem PBS (pH 7.4). Do komórek w naczyniu z szklanym dnem dodać 2% paraformaldehydu (pH 7.4). Utwierdzić komórki przez 10min w lodzie. Komórki przepłukać 3x buforem PBS (pH 7.4). Komórki przechowywać w temperaturze 4°C, przykryte 1mL PBS (pH 7.4). Komórki nie muszą być utwierdzone do obrazowania, jednak gdy fragmenty BiFC sformują nienaruszony fluorofor, proces ten jest nieodwracalny, co uniemożliwia analizę dynamicznych oddziaływań3. Należy również pamiętać, że nieutwierdzone komórki będą nadal generować sygnał. Zlizować komórki w płytce 6-dołkowej i przygotować lizaty do analizy Western blot. Ważne jest, aby wszystkie komórki były przygotowane w tym samym czasie, tak aby zlizowane komórki były reprezentatywne dla komórek poddanych obrazowaniu.
D. Obrazowanie komórek
- Intensywność fluorescencji zostanie obliczona w przeliczeniu na komórkę. Należy upewnić się, że obrazowanie dotyczy pojedynczych komórek.
- CFP został dołączony jako kontrola transfekcji i do analizy sygnałów BiFC wybierane są tylko komórki wykazujące ekspresję CFP. Przyjmujemy założenie, że jeśli komórka została przetransfekowana CFP, została również przetransfekowana konstruktami BiFC. Takie podejście gwarantuje, że obrazowane komórki pozbawione sygnału BiFC są negatywne z powodu braku oddziaływania między badanymi białkami, a nie z powodu braku jednego lub obu konstruktów ekspresyjnych BiFC w danej komórce.
- Do obrazowania komórek wykorzystujemy konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510. Podczas korzystania z tego mikroskopu ważne jest zachowanie spójności parametrów takich jak powiększenie (zoom), otwór pinhole, wzmocnienie detektora (gain), offset wzmacniacza, rozmiar ramki, prędkość skanowania, średnia z liczb skanowań oraz moc lasera. Przy użyciu dowolnego systemu obrazowania istotne jest utrzymanie stałych ustawień, aby fluorescencja była porównywalna między próbkami. Ponadto, podczas kwantyfikacji fluorescencji ważne jest, aby piksele nie były nasycone.
E. Ilościowe określanie fluorescencji
- Fluorescencję można ilościowo określić przy użyciu dowolnego oprogramowania do analizy obrazów. My wykorzystujemy ImageJ, który jest dostępny bezpłatnie z NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Otwórz pliki obrazów w ImageJ. Przejdź do Analyze > Set Measurements. W oknie Measurements zaznacz pola Area oraz Mean Gray Value.
- Używając narzędzia „free hand selection”, obrysuj krawędź całej komórki w kanale CFP.
- Pozostawiając ten obrys, przejdź do kanału YFP. Wybierz Analyze > Measure.
Mean Gray Value to suma wartości szarości wszystkich pikseli w zaznaczeniu podzielona przez liczbę pikseli (tj. średnia intensywność fluorescencji na obszar komórki). - Dla każdego obrazu narysuj w kanale YFP okrąg w obszarze, w którym nie znajduje się komórka. Wykonaj pomiar dla tego obszaru jako tła. Odejmij wartość tła od każdego obrazu.
- Oblicz średnią wartość Mean Gray Value pomniejszoną o tło dla wszystkich komórek zobrazowanych w jednej próbce. Będzie to średnia intensywność fluorescencji dla populacji komórek. Sugerujemy analizę ilościową około 60 komórek w ramach trzech eksperymentów.
F. Reprezentatywne wyniki:
Nasze laboratorium koncentruje się na wielodomenowym białku rusztowaniowym, intersectinie (ITSN), który oddziałuje z licznymi białkami w celu regulacji wielu szlaków biochemicznych i sygnałowych10,1,12,13,14. ITSN zawiera dwie domeny homologiczne do Eps15 (EH), region zwinięty (coiled-coil) oraz pięć domen homologicznych do Src 3 (SH3). Dłuższa izoforma ITSN zawiera również domeny homologiczne do Dbl (DH) i pleckstryny (PH), które wspólnie działają jako czynnik wymiany nukleotydów guaninowych dla Cdc4215. Ta modułowa struktura sprzyja oddziaływaniom białko-białko i sprawia, że ITSN jest idealnym kandydatem do eksperymentów BiFC. Lokalizacja subkomórkowa ITSN może zmieniać jego partnerów wiążących, a tym samym modyfikować szlaki regulowane przez ITSN (dane niepublikowane). Niedawno nasze laboratorium wykazało, że ITSN reguluje przeżywalność neuronów poprzez regulację nowej klasy II PI3K, PI3K-C2β 1. Aminokońcowa domena bogata w prolinę PI3K-C2β zawiera dwa miejsca wiązania dla domen SH3 białka ITSN. Wykorzystując ko-immunoprecypitację z zastosowaniem ITSN oraz mutantów trunkacyjnych PI3K-C2β, wykazaliśmy, że domeny SH3A i SH3C białka ITSN oddziałują z regionem aminokońcowym PI3K-C2β. Następnie zastosowaliśmy technikę BiFC, aby zwizualizować subkomórkową lokalizację tego kompleksu. ITSN został połączony z aminokońcem białka Venus (pFLAG-VN173), a konstrukty PI3K-C2β z karbokskońcem białka Venus (pHA-VC15). Jako kolejną kontrolę negatywną zastosowano niespecyficzny peptyd połączony z pHA-VC15. VN-ITSN i VC-PI3K-C2β utworzyły kompleks BiFC o rozkładzie punktowym (Rycina 2A, panele górne). Mutacje w domenie bogatej w prolinę PI3K-C2β, które zaburzają ko-precypitację ITSN i PI3K-C2β, zmniejszyły sygnał BiFC (Rycina 2A, panele dolne)1. Ta różnica w sygnale BiFC pomiędzy ITSN a dwoma białkami PI3K-C2β nie wynikała z różnic w ekspresji białek (Rycina 2B).
Rysunek 1. W metodzie BiFC fluorofor (w tym przypadku Venus) zostaje podzielony na koniec aminowy (VN) i karboksylowy (VC). Końce te są fuzjonowane z dwoma badanymi białkami. Gdy oba białka wchodzą ze sobą w interakcję, fragmenty VN i VC ponownie się łączą, co prowadzi do rekonstytucji fluoroforu i wystąpienia fluorescencji w miejscach interakcji. BiFC jest konkretnym przykładem testu komplementacji fragmentów białek (PCA), wykorzystywanego do pomiaru oddziaływań białko-białko.5.
Rysunek 2. ITSN i PI3K-C2β tworzą kompleks BiFC. A. ITSN z tagiem VNa został współtransfected z PI3K-C2β WT z tagiem VCa lub mutantem domeny bogatej w prolinę (PI3K-C2β-PA). ITSN i WT PI3K-C2β tworzą kompleks (kolor zielony). CFP (kolor czerwony) służył jako kontrola transfekcji. B. Wykonano Western blot, aby wykazać równą ekspresję konstruktów. Konstrukty z tagiem VCa są dodatkowo znakowane tagiem HA.
Tabela 1. Dostępnych jest wiele wektorów kompatybilnych z BiFC. YN155: 1-15 aa YFP; YC15: 15-238 aa YFP; YN173: 1-172 aa YFP; YC173: 173-238 aa YFP; VN15: 1-154 aa Venus; VC15: 15-238 aa Venus; VN173: 1-172 aa Venus; VC173: 173-238 aa Venus; CN15: 1-154 aa CFP; CC15: 155-238 aa CFP; GN173: 1-172 aa GFP; CitN15: 1-15 aa Citrine; CitC15: 15-238 aa Citrine; CitN173: 1-172 aa Citrine; CitC173: 173-238 aa Citrine; CerN173: 1-172 aa Cerulean. 2,3,9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
BiFC jest doskonałą metodą wizualizacji oddziaływań białko-białko w całych komórkach oraz określania subkomórkowej lokalizacji tych kompleksów. Zaletą metody BiFC jest to, że fluorescencję wykazują jedynie białka oddziałujące, oddziaływania przejściowe zostają ustabilizowane, a postprocessing danych obrazowych jest minimalny. Dwie wadami tej metody są czas dojrzewania fluoroforu oraz nieodwracalność kompleksu fluoroforu. W niektórych zastosowaniach ta nieodwracalność może być wykorzystana jako zaleta. Przykładowo, w komp...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wektory ITSN, PI3K-C2β oraz kontrolne wykorzystane w niniejszym protokole są dostępne od autorów na zapytanie, wyłącznie do celów niekomercyjnych. Autorzy pragną podziękować dr. Chang-Deng Hu za uprzejme udzielenie porad oraz dostarczenie odczynników wykorzystanych do opracowania protokołu BiFC w laboratorium O'Bryana. KAW otrzymał wsparcie finansowe z Foundation Jerome Lejeune. Prace w laboratorium O'Bryana są finansowane z grantów NIH (HL090651), DOD (PR080428), St. Baldrick's Foundation oraz Foundation Jerome Lejeune.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Cellgro | 35-011-CV | |
| Szalki z mikrowyciśkami o szklanym dnie | Matek | P35G-1.5-14C | |
| Szalki 6-dołkowe | Falcon BD | 35-3846 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Mikroskop konfokalny | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 META |
Bibliografia
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN? Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
