Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Podsumowanie

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Streszczenie

Hodowla komórek nowotworu retinoblastomy w zdefiniowanych mediach dla komórek macierzystych prowadzi do powstania pierwotnych tumorsfer, które mogą być hodowane i utrzymywane jedynie przez ograniczony czas. Hodowane tumorsfery mogą wykazywać fenotypy komórkowe wyraźnie różniące się od tych obecnych w oryginalnych guzach. Wykazanie, że hodowane komórki posiadają zdolność do tworzenia nowych guzów, jest istotne dla zapewnienia, że hodowane komórki modelują biologię pierwotnego nowotworu.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół propagacji guzów siatkobłastniaka ludzkiego in vivo z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności Rag2^-/-. Hodowane sferoidy nowotworowe siatkobłastniaka ludzkiego o niskim numerze pasażu lub komórki uzyskane ze świeżo pobranych guzów siatkobłastniaka ludzkiego, wstrzyknięte bezpośrednio do jamy ciała szklistego oczu myszy, tworzą guzy w ciągu 2-4 tygodni. Guzy te można pobrać i poddać dalszym pasażom do oczu myszy in vivo lub hodować jako sferoidy nowotworowe in vitro. Propagacja została pomyślnie przeprowadzona przez co najmniej trzy pasaże, co pozwoliło na ustanowienie stałego źródła tkanki siatkobłastniaka ludzkiego do dalszych eksperymentów.

Wesley S. Bond i Lalita Wadhwa są współpierwszymi autorami.

Protokół

1. Przygotowanie sferotumorów retinoblastoma

1. Pozyskać próbkę guza retinoblastoma zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.
2. Przygotować świeżą, zdefiniowaną pożywkę dla komórek macierzystych (pożywka Neurobasal-A, suplement B-27 1X bez witaminy A, 1X roztwór nieistotnych aminokwasów, 1X L-glutamina, 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF).
3. Mechanicznie rozdrobnić tkankę guza skalpelem, stosując technikę cięcia na krzyż, w sterylnej płytce 6-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkankowej. Natychmiast dodać do tkanki 100 μL zdefiniowanej pożywki dla komórek macierzystych i delikatnie rozprowadzić posiekaną tkankę za pomocą skalpela. Do dołka dodać 5 mL zdefiniowanej pożywki dla komórek macierzystych.
4. Inkubować w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂ w inkubatorze z nawilżaniem i kontrolować codziennie. Niektóre tumorsfery powinny pojawić się z rozdrobnionej tkanki guza niemal natychmiast, a ich liczba będzie wzrastać w ciągu 2–4 dni.
5. Raz w tygodniu wirować tumorsfery przy 300xg przez 5 minut, resuspendować w świeżo przygotowanej zdefiniowanej pożywce dla komórek macierzystych i pipetować w górę i w dół 10 razy, aby rozbić większe sfery z martwicą centralną i umożliwić formowanie się nowych, zdrowych sfer.

2. Przygotowanie komórek nowotworowych do wstrzyknięcia

1. W przypadku wstrzykiwania hodowlanych tumorsfer, delikatnie przenieś sfery pipetą do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Delikatnie pipetuj w górę i w dół pipetą serologiczną 10–15 razy, aby rozbić sfery.
2. Policz komórki przeznaczone do wstrzyknięcia za pomocą hemacytometru i odmierz co najmniej 50 000 komórek na jedną iniekcję do nowej probówki. Przygotuj taką liczbę iniekcji, jaka jest możliwa w zależności od dostępnej liczby komórek.
3. Wiruj przy 300xg przez 5 minut. Ostrożnie odessij nadsącz i resuspenduj w 5 mL PBS. Powtórz wirowanie i odsysanie, a następnie resuspenduj w 10 μL PBS na każdą iniekcję.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Za pomocą strzykawki insulinowej podać domięśniowo koktajl anestetyczny dla gryzoni (ketamina 37,6 mg/mL, ksylazyna 1,92 mg/mL, acepromazyna 0,38 mg/mL) w dawce 1 μL na gram masy ciała (gbw). Odczekać 5 minut do momentu sedacji zwierzęcia. Sprawdzić tętno i umieścić zwierzę na podgrzewanej podkładce. Przez cały czas do momentu wybudzenia zwierzęta powinny znajdować się na podgrzewanej podkładce.
2. Po sedacji podać 1 kroplę proparakainy HCl do prawego oka. Ponownie umieścić zwierzę na podgrzewanej podkładce i odczekać 1 minutę.
3. Podać 1 kroplę fenylefryny HCl do prawego oka. Ponownie umieścić zwierzę na podgrzewanej podkładce i odczekać 5 minut. Jeśli nie nastąpiło rozszerzenie źrenicy, podać kolejną 1 kroplę i odczekać kolejne 5 minut.
4. Monitorować zwierzęta pod kątem oznak ruchu lub drgań, które mogą wystąpić po >30 minutach od sedacji. Przy pierwszych oznakach ruchu podać 1 μL/gbw ketaminy HCl (rozcieńczonej do 10 mg/mL w PBS) i odczekać 5 minut.

4. Wstrzykiwanie komórek nowotworowych

1. Umieść znieczulone zwierzę pod mikroskopem na boku, prawym okiem skierowanym do góry, z głową spoczywającą na gazie i wycentrowaną w taki sposób, aby obserwując przez mikroskop, uzyskać odruch czerwonej plamki dno oka prawego (źrenica powinna być w tym czasie rozszerzona).
2. Podeprzyj prawe gałkę oczną, delikatnie i jednocześnie naciskając dwoma palcami na powieki i utrzymuj tę pozycję przez resztę procedury.
3. Używając sterylnej igły o rozmiarze 30G przymocowanej do strzykawki z systemem Luer-lock, przebij gałkę bocznie przez spojówkę i twardówkę w sąsiedztwie limbusa rogówki w obszarze pars plana (Rycina 1), przechodząc przez naczyniówkę do jamy ciała szklistego. Wyjmij igłę z otworu.
4. Zdezynfekuj igłę Hamiltona gazikiem nasączonym alkoholem. Pobierz zawiesinę komórkową do strzykawki Hamiltona i wprowadź igłę do otworu, aż stanie się ona widoczna pod mikroskopem za soczewką w ciele szklistym w pobliżu siatkówki. Przy pomocy drugiej osoby, utrzymując igłę stabilnie w tej pozycji, powoli wciśnij tłok. Wyjmij igłę. W razie potrzeby użyj patyczka bawełnianego, aby wchłonąć nadmiar płynu z otworu.
5. Delikatnie zdejmij ucisk z powiek, aby zamknąć powieki myszy.
6. Podaj 1 kroplę hypromellozy do każdego oka i przenieś zwierzę na podgrzewaną podkładkę w celu rekonwalescencji.

5. Monitorowanie wstrzykniętych myszy i pobieranie guzów

1. Codziennie badać wstrzyknięte oko pod kątem leukokorii (białego odblasku źrenicy) i/lub obrzęku okołogałkowego, który zazwyczaj staje się widoczny 2-4 tygodnie po wstrzyknięciu.
2. Po wykryciu wzrostu guza uśpić zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
3. Jeśli oko i guz są przykryte powiekami, użyć skalpela, aby wykonać dwa cięcia prostopadłe do szczeliny powiekowej i odchylić płaty skóry.
4. Pod kontrolą mikroskopu stereoskopowego wykonać cięcie okrężne na limbusie, usuwając rogówkę i soczewkę, a następnie ostrożnie wypreparować główną masę guza z pozostałych tkanek za pomocą pincety. Umieścić guz w sterylnym medium RPMI-1640.
5. Za pomocą pincety powoli wyciągnąć otwartą gałkę oczna z oczodołu. Aby zapewnić obecność przyczepionego nerwu wzrokowego i umożliwić wizualizację nacieku nowotworowego, wyciągać gałkę, aż nerw zostanie odsłonięty, a następnie odciąć nerw nożyczkami tak daleko, jak to możliwe. Umieścić próbkę w 10% formalinie do standardowej obróbki w celu badania histologicznego.

6. Reprezentatywne wyniki:

Sferoidy nowotworowe retinoblastoma zaczną pojawiać się z zagregowanej tkanki niemal natychmiast po uwolnieniu z masy guza. W ciągu 2-4 dni zacznie formować się więcej sferoidów, które będą zwiększać swoje rozmiary. Sferoidy mają tendencję do zachowania regularnego kształtu i wykazują wyraźnie zdefiniowaną, wtórną błonę otaczającą agregat (Rycina 2).

U zwierzęcia zazwyczaj występuje leukokoria w ciągu 4 tygodni po iniekcji (Rycina 3b), a następnie, w miarę wzrostu guza, powiększenie gałki ocznej i obrzęk tkanek otaczających w 5–8 tygodniu po iniekcji (Rycina 3c).

Rycina 1. Schemat przekroju oka myszy z wyróżnieniem elementów wspomnianych w protokole.

Rysunek 2. Hodowla ludzkich komórek retinoblastoma in vitro obrazowana przy powiększeniu obiektywu a) 4x oraz b) 10x. Pierwotne komórki guza retinoblastoma tworzą tumorsfery o regularnym sferoidalnym kształcie i wyraźnej zewnętrznej błonie. Paski skali reprezentują a) 500 μm oraz b) 200 μm.

Rycina 3. Oko myszy Rag2-/- wykazujące a) cechy prawidłowe, b) leukokorię wskazującą na masę nowotworową w jamie ciała szklistego oraz c) dużą masę nowotworową wypełniającą gałkę oczną z towarzyszącym obrzękiem okołogałkowym i krwotokiem wewnątrzgałkowym.

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie technika umożliwia propagację guzów retinoblastoma w ich wewnątrzgałkowym, wewnątrzszklistym środowisku. Technika wstrzykiwania do wnętrza oka była stosowana w przeszłości do tworzenia guzów z linii komórkowych pochodzących z retinoblastoma¹, a także do dostarczania wektorów wirusowych w wewnątrzgałkowej terapii genowej^2,3. Obecnie technika ta została z powodzeniem wykorzystana do wytwarzania ludzkich guzów retinoblastoma poprzez bezpośrednie wstrzykiwanie komórek z guza pierwotnego i wstrzykiwanie tumorsfer oraz seryjną propagację ksenoprzeszczepów guzów. Widoczne dowody formowania się guza (zazwyczaj leukokoria) są zazwyczaj zauważalne w ciągu pierwszych 4 tygodni, po czym w ciągu 5–8 tygodni rozwija się krwotok wewnątrzgałkowy oraz rozszerzenie gałki ocznej i/lub tkanek otaczających orbitę. Nieliczna grupa wstrzykniętych myszy uszkadza wstrzyknięte oko, co prowadzi do trwałego zamknięcia powiek. W takich przypadkach rozszerzenie jest jedynym objawem formowania się guza.

Utworzenie ksenoprzeszczepów guzów u myszy nie zakończyło się sukcesem w przypadku wszystkich ludzkich guzów siatkówczaka, choć propagacja już ustanowionych ksenoprzeszczepów przebiega z bardzo wysoką skutecznością. Obserwacja ta sugeruje, że pewne cechy guza pierwotnego, takie jak inwazyjność i stopień zróżnicowania lub jakiś inny nieznany czynnik, mogą wpływać na zdolność tych guzów do przetrwania w środowisku ocznym myszy.

Ilość tkanki, którą można pozyskać z ludzkiego guza siatkówczaka, jest dość niewielka, a możliwości hodowania ludzkich komórek siatkówczaka in vitro są znacząco ograniczone ze względu na m.in. ograniczoną żywotność, utratę histologii guza litego oraz zmiany w fenotypie komórkowym. Niniejszy protokół przedstawia stosunkowo prosty sposób namnażania ludzkiego guza i tworzenia mysiego modelu tej ludzkiej choroby. Umożliwia to dalsze eksperymenty in vitro i in vivo nad biologią siatkówczaka oraz dłuższe utrzymanie guza poza organizmem pacjenta.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fenylefryny HCl 2,5%	Bausch and Lomb	053-11	Krople do oczu
igła 30 G	BD Biosciences	305128	Standardowy ścięcie
strzykawka 10 ml z końcówką Luer-Lock	BD Biosciences	309604
Strzykawka insulinowa 3/10 ml	BD Biosciences	328431
Gaziki nasączone alkoholem	BD Biosciences	326895
Płytka 6-dołkowa, traktowana do hodowli tkanek	BD Biosciences	353046
Proparakaina HCl 0,5%	Butler Animal Health Supply	017239	Krople do oczu
Ketamina HCl 100 mg/ml	Fort Dodge Animal Health	4402A
10-μStrzykawka Hamilton L	Hamilton Co	7648-01
igła Hamilton 32G	Hamilton Co	7803-04	Dostosowana długość - 0,5"
Podłoże Neurobasal-A	Invitrogen	10888-022
Suplement B-27 bez witaminy A, 50X	Invitrogen	12587-010
Pożywka RPMI-1640	Mediatech, Inc.	10-040-CV
Roztwór aminokwasów nieessencjalnych, 100X	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-glutamina, 100X	Mediatech, Inc.	25-005-CI
Jednorazowy skalpel nr 11	Miltex Inc.	4-411
Zestaw do znieczulania gryzoni	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które wymagają przełożenia na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia treści naukowych i edukacyjnych JoVE zgodnie z określonymi wytycznymi.	Brak danych	Preparat apteczny przygotowany wewnątrz placówki (ketamina 37,6 mg/mL, ksylazyna 1,92 mg/mL, acepromazyna 0,38 mg/mL)
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGF)	Technologie komórek macierzystych	02633	Zrekonstytuować w stężeniu 10 μroztwór zapasu o stężeniu g/ml
Rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)	Technologie komórek macierzystych	02634	Rekonstytuować w stężeniu 10 μroztwór zapasowy o stężeniu g/ml
Obsługa mikroskopu OMS-75	Topcon Medical Systems	OMS-75	Ten model został wycofany z produkcji
10% formalina	VWR international	95042-908