$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Komórki nabłonkowe polaryzują swoją błonę plazmatyczną na biochemicznie i funkcjonalnie odrębne domeny wierzchołkowe i podstawno-boczne, gdzie domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę 'wolnych' powierzchni, a błona podstawno-boczna styka się z substratem i sąsiednimi komórkami. Obie domeny błonowe są oddzielone szczelnymi połączeniami, które tworzą barierę dyfuzyjną. Polaryzacja wierzchołkowo-podstawno-boczna może być z powodzeniem rekapitulowana w hodowli, gdy komórki nabłonkowe, takie jak komórki nerki Madina-Darby'ego (MDCK), są wysiewane w dużej gęstości na filtrach poliwęglanowych i hodowane przez kilka dni 1, 2. Ustalanie i utrzymywanie polaryzacji komórek jest regulowane przez szereg małych GTPaz z nadrodziny Ras, takich jak RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 i Rab13 3 4 5 6 7. Podobnie jak wszystkie GTPazy, białka te przechodzą cyklicznie między nieaktywnym stanem związanym z GDP a aktywnym stanem związanym z GTP. Specyficzne mutacje w regionach wiążących nukleotydy zakłócają ten cykl 8. Na przykład Rab13T22N jest trwale zablokowany w formie GDP i tym samym nazwany "dominującym ujemnym", podczas gdy Rab13Q67L nie może już hydrolizować GTP i tym samym jest zablokowany w "dominującym stanie aktywnym" 7. Aby przeanalizować ich funkcję w komórkach, zarówno dominujące ujemne, jak i dominujące aktywne allele GTPaz są zwykle wyrażane na wysokich poziomach, aby zakłócać funkcję endogennych białek 9. Eleganckim sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu nadekspresji w krótkim czasie jest wprowadzenie plazmidów kodujących odpowiednie białka bezpośrednio do jąder spolaryzowanych komórek hodowanych na nośnikach filtracyjnych za pomocą techniki mikroiniekcji. Jest to często połączone z jednoczesnym wstrzykiwaniem plazmidów reporterowych, które kodują receptory błony plazmatycznej, które są specyficznie posortowane do domeny wierzchołkowej lub podstawno-bocznej. Ładunkiem często używanym do analizy sortowania ładunków do domeny podstawno-bocznej jest wrażliwy na temperaturę allel glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSVGts045) 10. Białko to nie może prawidłowo fałdować się w temperaturze 39°C, a zatem zostanie zatrzymane w retikulum endoplazmatycznym (ER), podczas gdy białko regulatorowe będące przedmiotem zainteresowania zostanie złożone w cytozolu. Przesunięcie do 31°C pozwoli VSVGts045 prawidłowo się złożyć, opuścić ER i przemieścić się do błony plazmatycznej 11. Ten pościg jest zwykle wykonywany w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek, co prowadzi do czystszych wyników. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę mikroiniekcji plazmidów do spolaryzowanych komórek i późniejszych inkubacji, w tym zmian temperatury, które pozwalają na kompleksową analizę białek regulatorowych zaangażowanych w sortowanie podstawno-boczne.