Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Podsumowanie

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe polaryzują swoją błonę plazmatyczną na biochemicznie i funkcjonalnie odrębne domeny apikalną oraz bazolateralną, gdzie domena apikalna przylega do powierzchni „wolnych”, a błona bazolateralna pozostaje w kontakcie z podłożem i sąsiednimi komórkami. Obie domeny błonowe są rozdzielone przez połączenia ścisłe, które tworzą barierę dyfuzyjną. Polaryzację apikalno-bazolateralną można z powodzeniem odtworzyć w hodowli, gdy komórki nabłonkowe, takie jak komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), są wysiewane z wysoką gęstością na filtry poliwęglanowe i hodowane przez kilka dni ^{1 2}. Ustanowienie i utrzymanie polarności komórkowej jest regulowane przez szereg małych GTPaz z superrodziny Ras, takich jak RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 i Rab13 ^{3 4 5 6 7}. Podobnie jak wszystkie GTPazy, białka te przechodzą cykl między nieaktywnym stanem związanym z GDP a aktywnym stanem związanym z GTP. Specyficzne mutacje w regionach wiązania nukleotydów zakłócają ten cykl ⁸. Na przykład Rab13T22N jest trwale zablokowany w formie GDP, przez co określa się go mianem „dominant negative” (dominującego negatywnego), podczas gdy Rab13Q67L nie może już hydrolizować GTP i jest zatem zablokowany w stanie „dominant active” (dominującym aktywnym) ⁷. Aby przeanalizować ich funkcję w komórkach, zarówno allele dominant negative, jak i dominant active GTPaz są zazwyczaj ekspresowane na wysokim poziomie, aby zakłócić funkcję białek endogennych ⁹. Elegantnym sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu nadekspresji w krótkim czasie jest wprowadzenie plazmidów kodujących odpowiednie białka bezpośrednio do jąder spolaryzowanych komórek hodowanych na filtrach za pomocą techniki mikroiniekcji. Jest to często łączone ze współiniekcją plazmidów reporterowych kodujących receptory błony plazmatycznej, które są specyficznie sortowane do domeny apikalnej lub bazolateralnej. Ładunkiem często używanym do analizy sortowania do domeny bazolateralnej jest allel temperaturozależny glikoproteiny wirusa zapalenia jam ustnych (VSVGts045) ¹⁰. Białko to nie może prawidłowo sfałdować się w 39°C i w związku z tym pozostaje w retikulum endoplazmatycznym (ER), podczas gdy analizowane białko regulatorowe gromadzi się w cytozolu. Zmiana temperatury na 31°C pozwoli następnie VSVGts045 na prawidłowe sfałdowanie, opuszczenie ER i transport do błony plazmatycznej ¹¹. Taki etap śledzenia (chase) jest zazwyczaj przeprowadzany w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek, co pozwala na uzyskanie czystszych wyników. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedurę mikroiniekcji plazmidów do spolaryzowanych komórek oraz późniejsze inkubacje, w tym zmiany temperatury, które umożliwiają kompleksową analizę białek regulatorowych zaangażowanych w sortowanie bazolateralne.

Protokół

1. Izolacja plazmidowego DNA

1. Użyj zestawu Sigma-Aldrich endotoxin-free maxiprep do przygotowania wolnego od endotoksyn DNA zgodnie z protokołem producenta. Zestaw ten sprawdza się w naszych badaniach, ponieważ niezawodnie usuwa endotoksyny z preparatów DNA. Endotoksyny wstrzykiwane wraz z DNA do jąder komórkowych prowadzą do śmierci komórek.
2. Do wyizolowanego DNA dodaj 100 μl fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1), wymieszaj w wortexie i wiruj przez 1 min przy 13,000 rpm w mikrowirówce Eppendorf. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki i dodaj 100 μl chloroform/alkohol izoamylowy (24:1), wymieszaj w wortexie i wiruj w powyższy sposób. Przenieś górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki. Ten etap jest niezbędny do usunięcia białek z DNA, co zapobiega zapychaniu się igły do mikroiniekcji.
3. Wytrąć DNA, dodając octan sodu (pH 6.0) do stężenia końcowego 300 mM oraz 2-krotną objętość 100% etanolu. Inkubuj przez noc w temperaturze -20°C. Wiruj DNA przez 20 min przy 13,000 rpm w mikrowirówce Eppendorf, przemyj raz 70% etanolem i resuspenduj w 300 μl wody wolnej od endotoksyn (Sigma-Aldrich).
4. Oznacz stężenie DNA. Typowe stężenie DNA mieści się w zakresie od 1 do 5 μg/μl.

2. Hodowla komórek MDCK

1. Przeprowadź pasaż komórek MDCK. Policz komórki i wysiej 4 X 10⁵ komórek na przezroczyste filtry Transwell o średnicy 12 mm (rozmiar porów 0,4 μm, Corning Costar, 3460). W przypadku eksperymentu obejmującego kontrolę z pozorowaną injekcją (mock-injection) oraz dwa różne mutanty białek Rab, należy wysiać komórki na trzy filtry.
2. Hoduj komórki MDCK w pożywce MEM z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 0,1 mg/ml penicyliny/streptomycyny oraz 7% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (= pożywka wzrostowa MEM) w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂.
3. Codziennie wymieniaj pożywkę w komorze basolateralnej. Wspomaga to proces polaryzacji, ponieważ naśladuje sytuację komórek nabłonkowych u zwierząt.
4. 2 dni po wysianiu sprawdź pod mikroskopem, czy komórki rosną w postaci zwartej monowarstwy. Jeśli w monowarstwie nie występują żadne przerwy, przeprowadź eksperyment w 3. dniu. Jeśli przerwy nadal są widoczne, przeprowadź eksperyment w 4. dniu.

3. Procedura mikroiniekcji i inkubacje poiniekcyjne

1. W dniu eksperymentu przygotować 5 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES w jednej płytce 60 x 15 mm dla każdego filtra i umieścić w inkubatorze w temperaturze 39°C. Dodatkowo, przygotować jedną studzienkę płytki 12-dołkowej z 1 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu na filtr i umieścić w inkubatorze w temperaturze 31°C.
2. Włączyć mikroskop do mikroiniekcji i ustawić podgrzewany stolik na 39°C. Używamy mikroskopu odwróconego (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) z podgrzewanym stolikiem, obiektywami 10X i 32X oraz urządzenia Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Na koniec otworzyć butlę z azotem zasilającą stół pneumatyczny.
3. Rozcieńczyć DNA w wodzie filtrowanej (używając filtra 0,2 μm) do stężenia końcowego 0,2 mg/ml w całkowitej objętości 10 - 100 μl. Następnie wirować DNA w mikrocentryfudze Eppendorf przy 13 000 rpm przez 30 min. Usunąć górną część i przenieść do nowej probówki. Krok ten gwarantuje, że podczas ładowania rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji załaduje się precyzyjnie „czyste” DNA. DNA jest teraz gotowe do mikroiniekcji.
4. Przygotować komórki, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego. Za pomocą skalpela (Feather Surgical Blade, stal nierdzewna, nr 11) wyciąć filtr z uchwytu i umieścić w 5 ml podgrzanej do 39°C pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES (płytka 60 x 15 mm). Przycisnąć filtr w płytce hodowlanej skalpelem użytym do wycinania, tak aby otwór skalpela otaczał środek filtra. Umieścić płytkę hodowlaną na podgrzewanym stoliku mikroskopu.
5. Nabrać 2-3 μl rozcieńczonego DNA (w tym przypadku plazmidów kodujących VSVGts045-GFP = kontrola mikroiniekcji pozornej) do igły do mikroiniekcji (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), odkręcić osłonkę ochronną igły i odłożyć ją. Teraz igła jest gotowa do wkręcenia w uchwyt. Aby to zrobić, nacisnąć klawisz menu w urządzeniu Injectman i upewnić się, że zawór jest zamknięty. Wkręcić igłę w uchwyt, uważając, aby nie dokręcić jej zbyt mocno, co mogłoby doprowadzić do jej złamania. Następnie ponownie nacisnąć klawisz menu; przyłożone P_c zapobiegnie zasysaniu pożywki do igły podczas procedury mikroiniekcji. Na koniec dotknąć dżojstika, aby wymazać zapamiętaną pozycję startową.
6. Aby opuścić igłę na komórki, użyć obiektywu 10X i wprowadzić igłę w wiązkę światła nad cieczą. Następnie ustawić ostrość na komórkach, ponownie przesunąć punkt ostrości w górę, obracając pokrętło ostrości o 180°, i odnaleźć igłę. Następnie powoli wprowadzić igłę w obszar ostrości, potem ponownie ją rozmyć (dążąc do ponownego ustawienia ostrości na komórkach), a następnie znów wprowadzić igłę w obszar ostrości. Powtarzać do momentu, aż igła dotknie powierzchni pożywki, co objawi się widocznym halo. Gdy komórki będą ostre, a igła wciąż rozmyta (tj. poza płaszczyzną ogniskową), zmienić obiektyw na 32X i dostroić ustawienia wstępne.
7. Ustawić limit osi z, dotykając błony apikalnej końcówką igły i odejmując około 10 μm, ponieważ jądra znajdują się mniej więcej 10 μm pod błoną apikalną.
8. Po ustawieniu limitu z dobrać odpowiednie ciśnienie iniekcji. Rozpocząć od 95 PSI. Jeśli ciśnienie będzie zbyt wysokie, komórki ulegną rozerwaniu. Jeśli ciśnienie będzie zbyt niskie, pojawi się biała kropka, która nie zniknie, ale nic innego się nie stanie. Przy udanej iniekcji nastąpi zmiana fazy bez zmiany wielkości komórki. Podczas iniekcji jak najszybciej przesunąć igłę o kilka mikronów poza płaszczyznę ogniskową. Wycelować igłą nad jądrem (tj. w środek pojedynczej komórki) i nacisnąć przycisk iniekcji w dżojstiku, nie przytrzymując go.
9. Wykonać iniekcję w 100-500 komórkach znajdujących się w obrębie otworu skalpela leżącego na komórkach. Po zakończeniu umieścić komórki wraz z naczyniem hodowlanym i skalpelem w inkubatorze w temperaturze 39°C i inkubować przez 2 h. W tym czasie VSVGts045-GFP jest eksprymowany i wydzielany do ER. Jednak w temperaturze 39°C VSVGts045-GFP nie może prawidłowo przyjąć konformacji i w związku z tym nie może opuścić ER. Jednocześnie w eksperymentach z ko-iniekcją badana mała GTPaza będzie gromadzić się w cytozolu.
10. Po 2 h przenieść komórki do 1 ml pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu w płytce 12-dołkowej i inkubować przez 2 h w temperaturze 31°C. Podczas tego okresu „pościgu” (chase period) VSVGts045-GFP prawidłowo przyjmie konformację, opuści ER i zostanie dostarczony na powierzchnię komórki.
11. Powtórzyć kroki 3.1 – 3.10 dla filtra drugiego (iniekcja plazmidów kodujących VSVGts045-GFP oraz np. Rab13T22N z tagiem V5) i trzeciego (iniekcja plazmidów kodujących VSVGts045-GFP oraz np. Rab13Q67L z tagiem V5). Każda iniekcja zajmie około 20 - 60 min. Jest jednak absolutnie kluczowe, aby traktować każdy filtr w ten sam sposób podczas inkubacji ze zmianą temperatury oraz barwienia powierzchniowego, aż do momentu utrwalenia komórek. Po utrwaleniu można przeprowadzić resztę protokołu barwienia dla wszystkich filtrów jednocześnie.

4. Barwienie powierzchniowe do analizy immunofluorescencyjnej

Uwaga: aby uniknąć blaknięcia sygnału GFP białka VSVGts045-GFP, należy chronić preparaty przed światłem, owijając je folią aluminiową podczas wszystkich kolejnych procedur.

1. W przypadku chęci przeprowadzenia barwienia powierzchniowego, naczynie hodowlane z komórkami należy umieścić na metalowej płytce w lodzie i przemyć komórki 1X lodowatym PBS²⁺ (PBS [0,2 g/litr KCl, 0,2 g/litr KH₂PO₄, 8 g/litr NaCl oraz 2,17 g/litr Na₂HPO₄ x 7 H₂O] oraz 0,1 g/litr CaCl₂ i 0,1 g/litr MgCl₂ x 6 H₂O). Następnie na czystą parafilm położoną na metalowej płytce w lodzie należy nanieść 30 μl przeciwciała rozpoznającego ektodomenę badanego białka, w tym przypadku mysiego przeciwciała monoklonalnego TK1 (IgG₁, otrzymanego od śp. Thomasa Kreisa). Filtr z komórkami należy położyć odwróconą stroną na kropli przeciwciał, a następnie nanieść kilka kropli przeciwciał na tylną stronę filtra. Inkubować przez 1 h w lodzie.
2. Komórki należy przenieść do płytki 12-dołkowej, przemyć 3X lodowatym PBS²⁺ (lub PBS²⁺ w temperaturze pokojowej RT, jeśli nie przeprowadzono uprzedniego barwienia powierzchniowego) i utrwalić 3% paraformaldehydem przez 15 min w RT.
3. Komórki należy przemyć raz PBS²⁺ i pozostawić w PBS²⁺ na 5 min.
4. Komórki należy inkubować w buforze blokującym i permeabilizującym (BPB) (2% [mas/obj] BSA, 0,4% [mas/obj] saponiny w PBS²⁺) z dodatkiem 10% [obj/obj] surowicy koziej. Inkubować przez 1 h w RT.
5. Przeciwciała pierwszorzędowe do wykrywania ekspresyjnej Rab GTPazy, w tym przykładzie anty-V5 (mysie przeciwciało monoklonalne IgG_2a, Invitrogen), należy rozcieńczyć 1:200 w BPB. Rozcieńczone przeciwciała należy wirować w mikrowirówce Eppendorf przez 10 min przy 13 000 rpm. Na czystą parafilm umieszczoną w komorze wilgotnościowej należy nanieść 30 μl roztworu przeciwciał. Komórki na filtrze należy położyć odwróconą stroną na kropli przeciwciał i inkubować przez 1 h w RT.
6. Komórki należy przenieść z powrotem (stroną górną do góry) do płytki 12-dołkowej i przemyć 5X w ciągu 30 min buforem BPB w RT.
7. Należy rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała wtórne, w tym przypadku kozie anty-mysie IgG₁ znakowane Alexa 594 (do wykrywania VSVG na powierzchni, Invitrogen) oraz przeciwciała wtórne znakowane Cy5 do rozpoznawania Rab GTPazy, w tym przykładzie kozie anty-mysie IgG_2a znakowane Cy5 (Jackson ImmunoResearch), w stosunku 1:200 w BPB i wirować jak opisano powyżej. Na czystą parafilm w komorze wilgotnościowej należy nanieść 30 μl roztworu przeciwciał i położyć komórki na filtrze odwróconą stroną na kropli przeciwciał. Inkubować przez 1 h w RT.
8. Powtórzyć krok 4.6.
9. Filtr z komórkami należy zanurzyć 3X w wodzie dejonizowanej i położyć stroną górną do góry na szkiełkach mikroskopowych. Na komórki należy nanieść 10-15 μl medium montażowego (10% [mas/obj] DABCO, 50% [mas/obj] glicerolu w wodzie destylowanej). Na wierzch należy położyć szkiełko nakrywkowe 18x18 mm i za pomocą chusteczek higienicznych delikatnie docisnąć nakrywkę do komórek. Zamocować lakierem do paznokci.
10. Preparaty należy analizować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyto systemu Microsystem LSM 510 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) wyposażonego w obiektyw imersyjny wodny 63X.
11. Do przygotowania rycin należy dostosować i połączyć obrazy przy użyciu programów takich jak Adobe Photoshop oraz Adobe Illustrator.

5. Reprezentatywne wyniki

W celu zapoznania się z przykładami tego, jak koekspresja małych GTPaz zakłóca sortowanie VSVG, prosimy o zapoznanie się z opublikowanymi artykułami dotyczącymi błędnego sortowania apikalnego ^{3, 4} lub hamowania dostarczania na powierzchnię ⁷.

Rycina 1. W przypadku tzw. mock-injection, czyli wstrzyknięcia samego plazmidu kodującego VSVGts045-GFP, białko jest dostarczane na powierzchnię basolateralną dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co stwierdzono na podstawie barwienia powierzchniowego (kolor czerwony, Rycina 1 A). Należy zauważyć, że podczas inkubacji (chase) w 31°C nie całe białko VSVGts045-GFP jest dostarczane do błony basolateralnej, o czym świadczy rozległy wewnątrzkomórkowy sygnał dla białka całkowitego (kolor zielony, Ryciny 1 A i B). W komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane, VSVGts045-GFP będzie dostarczane również do błony apikalnej (Rycina 1 B). Jeśli preparaty kontrolne wyglądają jak komórka na Rycini 1 B, dane są niewiarygodne i należy powtórzyć eksperyment z użyciem lepiej spolaryzowanych komórek. Paski skali wynoszą 5 μm.

Dyskusja

Kluczowymi czynnikami dla sukcesu eksperymentu z mikroiniekcją są jakość i czystość DNA oraz polaryzacja komórek. Bez spolaryzowanych komórek kontrola iniekcji będzie już wykazywać błędne targetowanie VSVG, co uniemożliwi wykorzystanie eksperymentu. Jeśli DNA będzie słabej jakości, może ono zapchać igłę iniekcyjną, co doprowadzi do niskiej lub całkowitego braku ekspresji pożądanego białka. Zaleca się również stosowanie plazmidów ekspresyjnych znanych z wysokich poziomów ekspresji, takich jak pRKV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop Axiovert 200 z podgrzewanym stolikiem	Carl Zeiss, Inc.	Zamówienie indywidualne
Mikromanipulator Injectman NI2 Femtojet	Eppendorf	Zamówienie indywidualne
Femtotips II (Igły do mikroiniekcji)	Eppendorf	930000043
Końcówki do microloadera	Eppendorf	930001007
Przezroczyste podkładki filtracyjne transwell 12-mm	Corning	3460
Zestaw do maxiprepu plazmidów wolnych od endotoksyn	Sigma-Aldrich	NA0400