Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonka przy użyciu techniki mikroiniekcji.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe polaryzują swoją błonę plazmatyczną na biochemicznie i funkcjonalnie odrębne domeny wierzchołkowe i podstawno-boczne, gdzie domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę 'wolnych' powierzchni, a błona podstawno-boczna styka się z substratem i sąsiednimi komórkami. Obie domeny błonowe są oddzielone szczelnymi połączeniami, które tworzą barierę dyfuzyjną. Polaryzacja wierzchołkowo-podstawno-boczna może być z powodzeniem rekapitulowana w hodowli, gdy komórki nabłonkowe, takie jak komórki nerki Madina-Darby'ego (MDCK), są wysiewane w dużej gęstości na filtrach poliwęglanowych i hodowane przez kilka dni ^{1, 2}. Ustalanie i utrzymywanie polaryzacji komórek jest regulowane przez szereg małych GTPaz z nadrodziny Ras, takich jak RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 i Rab13 ^{3 4 5 6 7}. Podobnie jak wszystkie GTPazy, białka te przechodzą cyklicznie między nieaktywnym stanem związanym z GDP a aktywnym stanem związanym z GTP. Specyficzne mutacje w regionach wiążących nukleotydy zakłócają ten cykl ⁸. Na przykład Rab13T22N jest trwale zablokowany w formie GDP i tym samym nazwany "dominującym ujemnym", podczas gdy Rab13Q67L nie może już hydrolizować GTP i tym samym jest zablokowany w "dominującym stanie aktywnym" ⁷. Aby przeanalizować ich funkcję w komórkach, zarówno dominujące ujemne, jak i dominujące aktywne allele GTPaz są zwykle wyrażane na wysokich poziomach, aby zakłócać funkcję endogennych białek ⁹. Eleganckim sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu nadekspresji w krótkim czasie jest wprowadzenie plazmidów kodujących odpowiednie białka bezpośrednio do jąder spolaryzowanych komórek hodowanych na nośnikach filtracyjnych za pomocą techniki mikroiniekcji. Jest to często połączone z jednoczesnym wstrzykiwaniem plazmidów reporterowych, które kodują receptory błony plazmatycznej, które są specyficznie posortowane do domeny wierzchołkowej lub podstawno-bocznej. Ładunkiem często używanym do analizy sortowania ładunków do domeny podstawno-bocznej jest wrażliwy na temperaturę allel glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSVGts045) ¹⁰. Białko to nie może prawidłowo fałdować się w temperaturze 39°C, a zatem zostanie zatrzymane w retikulum endoplazmatycznym (ER), podczas gdy białko regulatorowe będące przedmiotem zainteresowania zostanie złożone w cytozolu. Przesunięcie do 31°C pozwoli VSVGts045 prawidłowo się złożyć, opuścić ER i przemieścić się do błony plazmatycznej ¹¹. Ten pościg jest zwykle wykonywany w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek, co prowadzi do czystszych wyników. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę mikroiniekcji plazmidów do spolaryzowanych komórek i późniejszych inkubacji, w tym zmian temperatury, które pozwalają na kompleksową analizę białek regulatorowych zaangażowanych w sortowanie podstawno-boczne.

Protokół

1. Izolacja plazmidowego DNA

1. Użyj zestawu maxiprep bez endotoksyn Sigma-Aldrich, aby przygotować DNA wolne od endotoksyn zgodnie z protokołem producenta. Ten zestaw sprawdza się u nas, ponieważ niezawodnie usuwa wszelkie endotoksyny z preparatów DNA. Endotoksyny, które są wstrzykiwane wraz z DNA do jąder komórkowych, prowadzą do śmierci komórki.
2. Dodać 100 μl fenolu/chlorofomu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) do wyizolowanego DNA, wirować i wirować przez 1 minutę z prędkością 13 000 obr./min w mikrowirówce Eppendorfa. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki i dodać 100 μl chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1), odwirować i odwirować jak wyżej. Przenieś górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki. Ten krok jest potrzebny do usunięcia białka z DNA, co zapobiega zatykaniu się igły do mikroiniekcji.
3. Wytrącić DNA, dodając octan Na (pH 6,0) do końcowego stężenia 300 mM i 2 X obj. 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20°C przez noc. Wiruj DNA przez 20 minut z prędkością 13 000 obr./min w mikrowirówce Eppendorf, przemyj raz 70% etanolem i ponownie zawieś w 300 μl wody wolnej od endotoksyn (Sigma-Aldrich).
4. Określ stężenie DNA. Typowe stężenie DNA waha się od 1 do 5 μg/μl.

2. Hodowla komórek MDCK

1. Podziel komórki MDCK. Policz komórki i zasiej 4 X 10⁵ komórek na przezroczystych 12-milimetrowych filtrach Transwell (wielkość porów 0,4 μm, Corning Costar, 3460). W przypadku eksperymentu zawierającego próbną kontrolę iniekcji i dwa różne zmutowane białka Rab należy zasiać trzy filtry.
2. Hodowla komórek MDCK w pożywce MEM z 2 mM L-glutaminą, 0,1 mg/ml penicyliny/streptomycyny i 7% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (= pożywka wzrostowa MEM) w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
3. Codziennie zmieniaj pożywkę w komorze podstawno-bocznej. Wspomaga to proces polaryzacji, ponieważ naśladuje sytuację komórek nabłonkowych u zwierząt.
4. 2 dni po wysiewie sprawdź pod mikroskopem, czy komórki rosną w zamkniętej monowarstwie. Jeśli nie możesz wykryć żadnych w monowarstwie, przeprowadź eksperyment w dniu 3. Jeśli nadal są, przeprowadź eksperyment w 4 dniu.

3. Procedura mikroiniekcji i inkubacje po iniekcji

1. W dniu eksperymentu należy przygotować 5 ml pożywki hodowlanej MEM oraz 50 mM HEPES na jednej płytce o wymiarach 60 x 15 mm dla każdego filtra i umieścić w inkubatorze o temperaturze 39°C. Ponadto należy umieścić jedną studzienkę na 12-dołkowej płytce z 1 ml pożywki hodowlanej MEM oraz 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu na filtr i umieścić w inkubatorze o temperaturze 31°C.
2. Włącz mikroskop do mikroiniekcji i ustaw jego podgrzewany stolik na 39°C. Używamy mikroskopu odwróconego (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) z podgrzewanym stolikiem, obiektywów 10X i 32X oraz Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Na koniec otwórz zbiornik azotu, który zaopatruje stół powietrzny w azot.
3. Rozcieńczyć DNA przefiltrowaną wodą (użyć filtra 0,2 μm) do końcowego stężenia 0,2 mg/ml w całkowitej objętości 10 - 100 μl. Następnie należy wirować DNA w mikrowirówce Eppendorf z prędkością 13 000 obr./min przez 30 minut. Wyjmij górną część i umieść w nowej tubie. Ten krok zapewnia, że po załadowaniu rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji można dokładnie załadować "czyste" DNA. Twoje DNA jest teraz gotowe do mikroiniekcji.
4. Przygotuj swoje komórki, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego. Za pomocą ostrza chirurgicznego (ostrze chirurgiczne z piór, stal nierdzewna, nr 11) wytnij filtr z uchwytu filtra i umieść go w ciepłym pożywce MEM o pojemności 5 ml i temperaturze 39°C plus 50 mM HEPES (płytka 60 x 15 mm). Obciąż filtr na płytce hodowlanej ostrzem chirurgicznym, którego użyłeś do jego wycięcia. Umieść go na filtrze tak, aby otwór ostrza chirurgicznego otaczał środek filtra. Umieść płytkę hodowlaną na podgrzewanym stoliku mikroskopu.
5. Załaduj 2-3 μl rozcieńczonego DNA (w tym przypadku plazmidy kodujące VSVGts045-GFP = pozorowana kontrola iniekcji) do igły do mikroiniekcji (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), przekręć osłonę ochronną igły i pozwól jej opaść na podłogę. Teraz igła jest gotowa do wkręcenia w uchwyt. Aby to zrobić, naciśnij przycisk menu wtryskiwacza i upewnij się, że zawór jest zamknięty. Wkręć igłę w uchwyt, uważając, aby nie wkręcać igły zbyt mocno, ponieważ może to doprowadzić do złamania. Teraz ponownie naciśnij menu, zastosowane P_c zapobiegnie zassaniu podłoża do igły podczas procedury mikroinjecitonu. Na koniec dotknij joysticka, aby usunąć zapisane bazowanie.
6. Aby opuścić igłę na komórki, użyj obiektywu 10X i umieść igłę w wiązce światła nad cieczą. Teraz skoncentruj się na komórkach, ponownie zwiększ ostrość, obracając pokrętło ostrości o 180° w górę i znajdź igłę. Następnie powoli przesuń igłę do ostrości, a następnie ponownie wyłącz ostrość (pracując nad ponownym ustawieniem ostrości komórek), ponownie ustaw ostrość igły w dół. Powtarzaj, aż igła dotknie powierzchni podłoża, w którym to momencie zobaczysz tylko aureolę. Gdy dojdziesz do punktu, w którym komórki są ostre, ale igła jest nadal rozmyta (tj. poza płaszczyzną ogniskowej), zmień ustawienie na obiektyw 32X i drobne ustawienia zgrubne.
7. Ustaw granicę z, dotykając błony wierzchołkowej końcówką igły i odejmując około 10 μm, ponieważ jądra leżą około 10 μm pod błoną wierzchołkową.
8. Po ustawieniu limitu Z znajdź odpowiednie ciśnienie wtrysku. Zacznij od 95 PSI. Jeśli ciśnienie jest zbyt wysokie, twoje komórki eksplodują. Jeśli twoje ciśnienie jest zbyt niskie, zobaczysz białą kropkę, która zostaje, ale nic więcej się nie dzieje. Po udanym wstrzyknięciu zaobserwujesz zmianę fazy bez zmiany wielkości komórki. Do wstrzyknięcia należy jak najszybciej usunąć igłę o kilka mikronów z płaszczyzny ogniskowej. Wycelować igłą powyżej jądra komórkowego (tj. środka pojedynczej komórki) i nacisnąć przycisk wstrzyknięcia na joysticku, ale nie przytrzymywać go.
9. Wstrzyknij 100-500 komórek w otwór ostrza chirurgicznego, który leży na komórkach. Po zakończeniu umieść komórki wraz z naczyniem hodowlanym i ostrzem chirurgicznym w inkubatorze o temperaturze 39°C i inkubuj przez 2 godziny. W tym czasie VSVGts045-GFP ulega ekspresji i jest wydzielany do ER. Jednak w temperaturze 39°C VSVGts045-GFP nie może się prawidłowo złożyć, a tym samym nie może opuścić ER. Tymczasem mała GTPaza, która jest przedmiotem zainteresowania, będzie gromadzić się w cytozolu w eksperymentach z jednoczesnym wstrzykiwaniem.
10. Po 2 godzinach umieść komórki w 1 ml pożywki wzrostowej MEM plus 50 mM HEPES i 0,1 mg/ml cykloheksymidu na 12-dołkowej płytce i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze 31°C. W tym okresie pościgu VSVGts045-GFP złoży się prawidłowo, opuści ER i zostanie dostarczony na powierzchnię komórki.
11. Powtórz kroki 3.1 - 3.10 dla filtrów drugiego (wstrzykiwanie plazmidów kodujących VSVGts045-GFP i na przykład Rab13T22N znakowane V5) i trzech (wstrzykiwanie plazmidów kodujących VSVGts045-GFP i na przykład Rab13Q67L znakowane V5). Każde wstrzyknięcie trwa około 20 - 60 minut. Jednak absolutnie konieczne jest traktowanie każdego filtra w ten sam sposób przez cały okres inkubacji zmiany temperatury i barwienia powierzchni, aż do utrwalenia komórek. Po utrwaleniu możesz wykonać resztę protokołu barwienia dla wszystkich filtrów w tym samym czasie.

4. Barwienie powierzchni do analizy immunofluorescencyjnej

Zauważ, że aby uniknąć bielenia sygnału GFP VSVGts045-GFP, chroń próbki przed światłem, przykrywając je folią aluminiową podczas wszystkich następnych procedur.

1. Jeśli chcesz przeprowadzić barwienie powierzchni, umieść komórki w naczyniu hodowlanym na metalowej płytce na lodzie i umyj komórki 1X lodowatym PBS²⁺ (PBS [0,2 g/litr KCl, 0,2 g/litr KH₂PO₄, 8 g/litr NaCl i 2,17 g/litr Na₂HPO₄ x 7 H₂O] plus 0,1 g/litr CaCl₂ i 0,1 g/litr MgCl₂ x 6 H₂Następnie umieść 30 μl przeciwciała, które rozpoznaje ektodomenę twojego białka, w tym przypadku mysiego przeciwciała monoklonalnego TK1 (IgG₁, uzyskanego od zmarłego Thomasa Kreisa), na czystym parafilmie umieszczonym na metalowej płytce na lodzie. Umieść filtr z komórkami do góry nogami na kropli i dodaj kilka kropli przeciwciała na tylnej stronie filtra. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
2. Umieść komórki na 12-dołkowej płytce, przemyj 3X lodowatym PBS²⁺ (lub RT ciepłym PBS²⁺ bez uprzedniego barwienia powierzchni) i utrwal 3% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Umyj komórki raz PBS²⁺ i pozostaw w PBS²⁺ na 5 minut.
4. Inkubować komórki w buforze blokującym/permeabilizacyjnym (BPB) (2% [wag./obj.] BSA, 0,4% [wt/obj.] saponiny w PBS²⁺) z 10% [obj./obj.] surowicy koziej. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w celu wykrycia ekspresji GTPazy Rab, w tym przykładzie anty-V5 (mysie przeciwciało monoklonalne IgG_2a, Invitrogen), 1:200 w BPB. Wirować rozcieńczone przeciwciała w mikrowirówce Eppendorfa przez 10 minut z prędkością 13 000 obr./min. Umieścić 30 μl roztworu przeciwciała na czystym parafilmie umieszczonym w mokrej komorze. Umieścić komórki na filtrze do góry nogami na kropli przeciwciała i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umieść komórki z powrotem (prawą stroną do góry) w 12-dołkowej płytce i przemyj 5X przez 30 minut BPB w temperaturze RT.
7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe, w tym przypadku kozie przeciwciała anty-mysie IgG₁ znakowane Alexa 594 (do wykrywania VSVG na powierzchni, Invitrogen) i przeciwciała drugorzędowe znakowane Cy5, aby rozpoznać GTPazę Rab, w tym przykładzie kozioł anty-mysi IgG_2a znakowany Cy5 (Jackson ImmunoResearch), 1:200 do BPB i wirować jak powyżej. Umieścić 30 μl roztworu przeciwciała na czystym parafilmie w mokrej komorze i umieścić komórki na filtrze do góry nogami na kropli przeciwciała. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Powtórz krok 4.6.
9. Zanurz komórki na filtrze 3X w wodzie dejonizowanej i umieść prawą stroną do góry na mikroszkiełkach. Dodaj 10-15 μl mocowania (10% [wag./obj.] DABCO, 50% [wt/obj.] glicerolu w wodzie destylowanej) na wierzch komórek. Umieść na wierzchu mikro szkło nakrywkowe 18X18 mm i za pomocą chusteczek do twarzy delikatnie dociśnij mikro szkło nakrywkowe do komórek. Uszczelnij lakierem do paznokci.
10. Analizuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyliśmy mikrosystemu LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., który był wyposażony w obiektyw zanurzeniowy 63X.
11. Aby przygotować figury, dostosuj i połącz obrazy za pomocą programów takich jak Adobe Photoshop i Adobe Illustrator.

5. Reprezentatywne wyniki

Na przykłady, jak koekspresja małych GTPaz zakłóca sortowanie VSVG, prosimy o zapoznanie się z opublikowanymi artykułami dotyczącymi błędnego sortowania wierzchołkowego ^{3, 4} lub hamowania dostarczania powierzchniowego ⁷.

Rysunek 1. W próbnym wstrzyknięciu, tj. wstrzyknięciu tylko plazmidu kodującego VSVGts045-GFP, białko jest dostarczane do podstawno-bocznej powierzchni dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co ocenia się na podstawie barwienia powierzchni (na czerwono, ryc. 1 A). Należy zauważyć, że nie cały VSVGts045-GFP jest dostarczany do błony podstawno-bocznej podczas pościgu w temperaturze 31 ° C, o czym świadczy rozległy sygnał wewnątrzkomórkowy dla całego białka (na zielono, ryc. 1 A i B). W komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane, VSVGts045-GFP zostanie dostarczony również do błony wierzchołkowej (ryc. 1 B). Jeśli twoje próbki kontrolne wyglądają jak komórka na rysunku 1 B, nie możesz ufać swoim danym i musisz powtórzyć eksperyment z lepiej spolaryzowanymi komórkami. Podziałka wynosi 5 μm.

Dyskusja

Najważniejszymi krokami udanego eksperymentu z mikroiniekcją są jakość i czystość DNA oraz polaryzacja komórek. Bez spolaryzowanych komórek, kontrola iniekcji będzie już miała źle ukierunkowany VSVG i eksperyment nie będzie mógł być użyty. Jeśli DNA jest złej jakości, może zatkać igłę do wstrzykiwań, prowadząc do słabej ekspresji pożądanego białka lub jego braku. Wskazane jest również stosowanie plazmidów ekspresyjnych, o których wiadomo, że prowadzą do wysokich poziomów ekspresji, takich jak pRKV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop Axiovert 200 z podgrzewaną scenografią	Carl Zeiss, Inc.	Na zamówienie
Injectman NI2 Mikromanipulator Femtojet	Eppendorf	Na zamówienie
Femtotips II (igły do mikroiniekcji)	Eppendorf	930000043
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	930001007
Przezroczyste 12-milimetrowe wsporniki filtrów transwell	Corning	3460
Zestaw maxiprep	plazmidu bez endotoksynSigma-Aldrich	NA0400