Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rola poszczególnych neuronów oraz ich funkcja w obwodach neuronalnych są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych funkcji sensorycznych i motorycznych. Większość badań nad mechanizmami sensoromotorycznymi opiera się albo na badaniu neuronów w stanie spoczynku zwierzęcia1,2, albo na rejestracji pozakomórkowej aktywności neuronalnej podczas ruchu.3,4 Choć badania te dostarczyły fundamentalnych podstaw wiedzy o funkcji sensoromotorycznej, nie oceniają one informacji funkcjonalnych pojawiających się podczas ruchu lub mają ograniczone możliwości pełnej charakterystyki anatomii, fizjologii i fenotypu neurochemicznego neuronu. Zaprezentowana tutaj technika umożliwia rozległą charakterystykę poszczególnych neuronów podczas ruchu in vivo. Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do badania pierwotnych neuronów doprowadzających, ale także do charakterystyki motoneuronów i sensoromotorycznych interneuronów. Początkowo odpowiedź pojedynczego neuronu jest rejestrowana za pomocą metod elektrofizjologicznych podczas różnych ruchów żuchwy, po czym następuje wyznaczenie pola recepcyjnego danego neuronu. Następnie do neuronu wstrzykuje się wewnątrzkomórkowo marker neuronalny, a mózg jest przetwarzany w taki sposób, aby neuron mógł zostać zwizualizowany za pomocą mikroskopii świetlnej, elektronowej lub konfokalnej (Ryc. 1). Następnie rekonstruowana jest szczegółowa morfologia scharakteryzowanego neuronu, co pozwala na skorelowanie morfologii neuronalnej z odpowiedzią fizjologiczną neuronu (Ryc. 2,3). W niniejszym opracowaniu przedstawiono kluczowe szczegóły i wskazówki niezbędne do skutecznego wdrożenia tej techniki. Dzięki połączeniu tej metody z innymi technikami można uzyskać cenne dodatkowe informacje o badanym neuronie. Markerowanie neuronalne wsteczne może być wykorzystane do zidentyfikowania neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron, co pozwala na szczegółowe określenie obwodów neuronalnych. Metodę tę można połączyć z immunocytochemią w celu zbadania neuroprzekaźników w znakowanym neuronie oraz określenia fenotypów chemicznych neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron. Znakowany neuron może być również przygotowany do mikroskopii elektronowej w celu określenia cech ultrastrukturalnych i mikroobwodów danego neuronu. Podsumowując, technika ta jest potężną metodą dokładnej charakterystyki neuronów podczas ruchu in vivo, co pozwala na uzyskanie istotnych informacji o roli neuronu w funkcji sensoromotorycznej.
Protokół
1. Przygotowanie zwierząt
- Zanurzyć szczura w znieczuleniu za pomocą pentobarbitalu sodu (50mg/kg IP) i umieścić na podkładce grzewczej. Wygolić skórę nad tylną częścią czaszki za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Sprawdzić, czy zwierzę osiągnęło poziom znieczulenia chirurgicznego, testując brak odruchu wycofania i wokalizacji przy ucisku palców stopy, a także brak odruchu powiekowego. Kontrolować poziom znieczulenia co 15 minut i utrzymywać poziom chirurgiczny poprzez wstrzykiwanie pentobarbitalu sodu w dawce 15mg/kg co 45 minut.
- Stosując technikę aseptyczną, wykonać nacięcie w regionie pachwinowym, tuż za fałdem utworzonym przez brzuch i wewnętrzną stronę uda, a następnie wprowadzić kaniulę (średnica 1mm, Clay Adams) do żyły udowej oraz tętnicy udowej. Wykonać nacięcie w linii pośrodkowej w regionie podżuchwowym i odsunąć mięśnie podjęzykowe. Wykonać małe nacięcie w tchawicy i wprowadzić kaniulę (średnica 2mm), aby umożliwić wentylację. Przywiązać szew wokół kaniuli tchawiczej, aby zabezpieczyć ją na miejscu. Monitorować systemowe ciśnienie skurczowe i rozkurczowe krwi za pomocą kaniuli tętniczej. Oprócz monitorowania odruchu wycofania i powiekowego, monitorować teraz ciśnienie krwi w celu oceny poziomu znieczulenia. W razie potrzeby podawać dodatkowe środki znieczulające za pomocą kaniuli żylnej.
- Umieścić szczura w aparacie stereotaktycznym i przeprowadzić kraniotomię w celu odsłonięcia móżdżku. Podłączyć kaniulę tchawiczą do wentylatora dla gryzoni. Wentylować zwierzę objętością 2 cm3 z częstotliwością 100/min wilgotnym powietrzem. Należy utrzymać dodatnie ciśnienie końcowowydechowe 1 cm H2O, aby zapobiec zapadnięciu się płuc. Co 15 minut przeprowadzać hiperwentylację płuc, aby zapobiec niedodmie. Następnie pokryć powierzchnię mózgu ogrzanym olejem mineralnym (30°C). Należy uważać, aby nie uszkodzić dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.
- Nanieść klej cyjanoakrylanowy na pręt połączony z wibratorem elektromagnetycznym i przymocować pręt w diastemie żuchwy. Poruszać żuchwą, przesyłając sygnały sterujące do wibratora z wyjścia komputera A/D lub generatora sygnałowego.
- Umieścić srebrno-chlorkową elektrodę uziemiającą pod skórą w sąsiedztwie miejsca kraniotomii.
2. Przygotowanie elektrod
- Wytworzyć mikroelektrody z kwarcu lub szkła glino-krzemianowego, używając poziomego wyciągacza mikroelektrod.
- Napełnić mikroelektrodę 5-10% biotynamidą rozpuszczoną w 0,25M KCl i buforze 0,5M Tris HCl (pH 7,6) lub 2% tetrametylorodaminą w soli fizjologicznej (pH 6). Sprawdzić impedancję elektrody za pomocą testera elektrod. Do rejestracji z aksonów o dużej średnicy wykonać elektrody o impedancji 60-80M Ω, a dla małych aksonów i interneuronów elektrody o impedancji 80-150MΩ.
- Umieścić mikroelektrodę w głowicy wzmacniacza elektrometru. Wizualizować elektrodę za pomocą małego teleskopu (20X z wbudowanym siatkowym celownikiem), który jest zamocowany za głową zwierzęcia. Użycie teleskopu jest istotne, ponieważ umożliwia stereotaktyczne pozycjonowanie elektrod z dużą precyzją.
3. Rejestracja elektrofizjologiczna i barwienie wewnątrzkomórkowe
- Wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej i zastosuj nadkompensację sprzężenia pojemnościowego, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Pozwala to na precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu.
- Wykonywanie powtarzalnych przemieszczeń żuchwy i wprowadzanie elektrody do mózgu za pomocą silnika krokowego.
- Rozpoznawanie przebicia neuronów po nagłych spadkach potencjału DC oraz identyfikacja przebić wewnątrzsomatycznych po trwającej aktywności synaptycznej. „Buczenie” elektrody przy nadkompensacji pojemności lub opukiwanie rzadko prowadzą do skutecznej penetracji komórki. Ze względu na wysoką impedancję elektrod, odpowiedzi neuronowe są rzadko obserwowane przed penetracją.
- Po przebiciu neuronu i uznaniu penetracji za stabilną, scharakteryzuj odpowiedź neuronową, stosując ruchy żuchwy typu ramp and hold oraz sinusoidalne.5 Zmapuj pole recepcyjne neuronu, badając skórę wokół głowy i jamę ustną za pomocą nieprzewodzącej sondy, np. drewnianego patyczka. Jeśli jest to istotne dla badania, sprawdź odpowiedź neuronu na inne funkcjonalnie istotne bodźce, takie jak skurcz mięśni i bodźce nocycepcyjne.6 Pierwotne nocyceptywne receptory neuronowe reagują na bodźce nocycepcyjne. Środki znieczulające ogólne, takie jak pentobarbital sodu, nie blokują przewodzenia aksonalnego w pierwotnych neuronach aferentnych, lecz hamują przekaźnictwo synaptyczne. W związku z tym przewodzenie aksonalne w aksonie pierwotnego neuronu aferentnego zostaje zachowane.
- Wstrzyknij prąd (DC, 1-4nA) przez całkowity czas wstrzykiwania wynoszący 15-70nA minut. Monitoruj penetrację elektrody podczas wstrzykiwania prądu i przerwij proces, jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż -30mV.
4. Obróbka tkanek
- Uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie pentobarbitalu (140mg/kg IV) i przeprowadź perfuzję przy użyciu płynu płuczącego naczynia (0,9% NaCl 38°C zawierający 500 jednostek heparyny i 1ml 2% ksylokainy), a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym (pH 7,4).
- Wyjmij mózg i wykonaj przekroje o grubości 50-100μm za pomocą wibratomu w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej. Przekroje zbiera się metodą wolnopływającą w PBS 25°C.
- Przygotuj mózg do barwienia DAB, inkubując go w 1-2% normalnym surowicy koziej i 1% Triton X-100 w 0,01M PBS, a następnie inkubując w kompleksie awidyna-biotyna (1:50 Elite Vectastain). Przebarw przekroje za pomocą nikiel-DAB z H2O2. Aby przygotować próbki do barwienia Texas Red, inkubuj przekroje w kompleksie awidyna-biotyna (1:50) w PBS przez noc w 4°C, a następnie inkubuj w 4% Texas Red avidin DCS w PBST przez noc w 4°C. Przebarw przekroje fluorescencyjnym barwnikiem Nissla (NeuroTrace) przez 20min w 23°C.
- Jeśli neuron został wstrzyknięty rodaminą, zwizualizuj wstrzyknięty neuron bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Ex 545nm).
5. Połączenie metody z markowaniem retrogradnym, immunocytochemią, obrazowaniem konfokalnym oraz ilościową analizą kolokalizacji
Sukces połączenia tej techniki z innymi metodami zależy w dużej mierze od prawidłowego znakowania wewnątrzkomórkowego.
- Metoda tutaj zaprezentowana może zostać łatwo połączona z retrogradowym znakowaniem neuronów.7-10 W tym celu należy znieczulić zwierzę i, stosując technikę aseptyczną, wstrzyknąć znacznik neuronalny, taki jak peroksydazy chrzanowej (20% horseradish peroxidase. Sigma VI, Sigma) oraz 1% aglutynowanej zarodkami pszenicy peroksydazy chrzanowej (Sigma), do obwodowych obszarów docelowych, np. mięśnia żwacza. Znacznik neuronalny zostanie pobrany do aksonów obwodowych i przetransportowany drogą aksonalną do ciał motoneuronów. W przypadku mięśnia żwacza, 15μl znacznika wstrzykuje się do mięśnia za pomocą sterylnej mikrosstrzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie zwierzęta umieszcza się na macie grzewczej i monitoruje do momentu wybudzenia z narkozy, po czym przenosi się je do klatek w celu rekonwalescencji. Po 24h należy znieczulić zwierzęta, przeprowadzić fizjologiczną charakterystykę neuronów i zabarwić je wewnątrzkomórkowo. Następnie perfunduje się zwierzę zgodnie z powyższym opisem i przetwarza skrawki tkankowe w celu wykrycia HRP, używając tetrametylobenzydyny (TMB) jako chromogenu i tungstenu sodu jako stabilizatora, z intensyfikacją kobaltem. Skrawki umieszcza się w 1% tungstanie sodu rozpuszczonym w 0.1M PBS (pH 6.5) oraz 0.0007% TMB rozpuszczonym w absolutnym etanolu i acetonie w temperaturze 15°C przez 20 min. Następnie przeprowadza się reakcję skrawków tkankowych, dodając 1.0 ml 0.3% H2O2 na 100ml roztworu inkubacyjnego przez 60 min. Tkankę płucze się w 0.1M PBS (pH 6.5) i umieszcza w 0.05% diaminobenzydynie (pH 7.4), 0.02% kobalcie i 0.01% H2O2 w 0.1M PBS (pH 7.4) przez 10 min. w 37°C. Tkankę przetwarza się w celu wizualizacji neuronu wstrzykniętego z biotinamidą zgodnie z opisem, a następnie analizuje relacje między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi motoneuronami.
- Przedstawiona technika może być również łatwo łączona z immunocytochemią.6 Przykładowo, należy przetworzyć immunocytochemicznie mózg pod kątem obecności synaptofizyny, aby dokładnie zlokalizować synapsy wewnątrz znakowanych neuronów (Ryc. 3). W tym celu skrawki mózgu inkubuje się w przeciwciałach mysich przeciwko synaptofizynie (1:10,000) przez 2 dni w 4°C, a następnie inkubuje się w przeciwciałach antymysich FITC (1:400) przez 1h w 23°C.
- Neurony znakowane markerami fluorescencyjnymi lub przygotowane do obrazowania fluorescencyjnego idealnie nadają się do obrazowania konfokalnego. Rycina 3 przedstawia przykład przekroju optycznego uzyskanego za pomocą mikroskopii konfokalnej przez buton aksonalny (Ryc. 3). Animacje znakowanych neuronów generuje się poprzez wykonanie wielu przekrojów optycznych przez znakowany neuron (Ryc. 4).
- Neurony znakowane tą metodą mogą być wykorzystane do ilościowej analizy kolokalizacji. W tym celu należy użyć publicznie dostępnego makra oprogramowania w połączeniu z NIH Image (dostępnym pod adresem http://phy.ucsf.edu/°idl/colocalization.htm). Lokalizację synaptofizyny w pojedynczych terminalach aksonalnych wyznacza się poprzez połączenie znakowania wewnątrzkomórkowego z immunocytochemią synaptofizyny.6
6. Reprezentatywne wyniki:
Przegląd reprezentatywnych wyników, jakie można uzyskać za pomocą tej metody, przedstawiono na Rysunku 1. Ten pojedynczy neuron pnia mózgu był rejestrowany elektrofizjologicznie podczas ruchu żuchwy i, jak wyraźnie widać, odpowiedź tego neuronu (Rysunek 1 dół po lewej, jasnoniebieski) była modulowana podczas ruchu. Po charakterystyce elektrofizjologicznej do neuronu wstrzyknięto biotynamid, a następnie poddano go obróbce w celu wizualizacji. Zrekonstruowany neuron (Rysunek 1 środek, zielony) można odnieść do punktu orientacyjnego w anatomii, w tym przypadku do zaznaczonego jądra ruchowego nerwu trójdzielnego (czerwona obramowanie). Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu oraz rekonstrukcji neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecionka mięśniowego. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny przykład odpowiedzi fizjologicznej neuronu podczas przemieszczania żuchwy. Odpowiedź neuronu jest przedstawiona jako chwilowa częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź neuronalna ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron dostarcza sprzężenia zwrotnego sensorycznego związanego z pozycją żuchwy. Rysunek 3 to obraz w dużym powiększeniu aksonu barwionego wewnątrzkomórkowo, połączony z barwieniem na synaptofizynę oraz barwieniem Nissla. Zwróć uwagę na kolokalizację synaptofizyny (żółty) w obrębie pączka aksonalnego. Rysunek 4 to animacja pojedynczego, scharakteryzowanego fizjologicznie i znakowanego wewnątrzkomórkowo neuronu.
Rysunek 1. Przegląd metody. Góra po lewej: przemieszczenie żuchwy. Środek: rejestracja wewnątrzkomórkowa (zielony) z pojedynczego neuronu (żółty). Morfologia tego neuronu została zrekonstruowana po rejestracji wewnątrzkomórkowej i iniekcji. Czerwony obrys wskazuje położenie jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Dół po lewej: odpowiedź fizjologiczna tego neuronu podczas ruchu żuchwy.
Rysunek 2. Reprezentatywna odpowiedź fizjologiczna pojedynczego neuronu sensorycznego mięśnia zarejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Zwróć uwagę na podobieństwo odpowiedzi neuronalnej do przemieszczenia żuchwy.
Rysunek 3. Końcowe rozgałęzienie aksonalne z przysynaptycznymi guzkami (czerwone wybrzuszenia) neuronu sensorycznego barwionego wewnątrzkomórkowo, który zareagował podczas stymulacji mięśnia. Następująca po tym obróbka immunocytochemiczna w kierunku synaptofizyny wykazuje lokalizację synaptofizyny w obrębie guzka aksonalnego (żółty). Kolor zielony oznacza fluorescencyjne barwienie Nissla.
Rysunek 4. Animacja aksonu pierwotnego neuronu aferentnego wrzecionka mięśniowego, którego odpowiedź fizjologiczna była rejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Akson został następnie zabarwiony wewnątrzkomórkowo i poddany obróbce w celu wizualizacji.
Pobierz film w wysokiej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj
Pobierz film w średniej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda jest potężną techniką, która dostarcza istotnych informacji na temat funkcji pojedynczych neuronów oraz tego, w jaki sposób odpowiedź poszczególnych neuronów wpływa na obwody neuronalne.9 Wiedza ta jest fundamentalna dla zrozumienia funkcji sensoryczno-motorycznych. Największą zaletą tej techniki jest możliwość określenia wielu parametrów neuronu, w tym jego fizjologii, morfologii oraz morfologii i rozmieszczenia synaps. W połączeniu z innymi technikami, takimi jak wsteczna znakowani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja NIH nr 86-23, wersja z 1985 r.) oraz przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Maryland.
Podziękowania
Dziękuję Anthony'emu Taylorowi za wstępne szkolenie z zakresu rejestracji wewnątrzkomórkowej in vivo oraz A. Brown i Davidowi Maxwellowi za pomoc w początkowym opracowaniu techniki barwienia wewnątrzkomórkowego. Dziękuję M. Silver za pomoc w przygotowaniu makra do kolokalizacji. Wiele osób, z którymi współpracowałem, przyczyniło się do rozwoju tej techniki, w tym R. Donga, M. Moritani, P. Luo oraz R. Ambalavanar. Technika ta została opracowana przy znacznym wsparciu z grantów NIH DE10132, DE15386 oraz RR017971.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| wibrator elektromagnetyczny | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| generator sygnałów | Feedback Systems | PFG605 | zdolny do generowania trapezoidalnego sygnału wyjściowego |
| szkło elektrodowe | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | z włóknem |
| wyciągacz elektrod | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 lub P-80 | |
| biotinamid | Vector Laboratories | SP-1120 | przechowywany w 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetrametylorodamina | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | masa cząsteczkowa 3000, z możliwością wiązania do lizyny |
| przeciwciało mysie anty-synaptofizyna | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescencyjny barwnik Nissla | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| tester elektrod | Winston Electronics | BL-1000-B | do pomiaru impedancji elektrod |
| elektrometr | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
Bibliografia
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
