Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Podsumowanie

Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.

Streszczenie

Rola poszczególnych neuronów oraz ich funkcja w obwodach neuronalnych są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych funkcji sensorycznych i motorycznych. Większość badań nad mechanizmami sensoromotorycznymi opiera się albo na badaniu neuronów w stanie spoczynku zwierzęcia^1,2, albo na rejestracji pozakomórkowej aktywności neuronalnej podczas ruchu.^3,4 Choć badania te dostarczyły fundamentalnych podstaw wiedzy o funkcji sensoromotorycznej, nie oceniają one informacji funkcjonalnych pojawiających się podczas ruchu lub mają ograniczone możliwości pełnej charakterystyki anatomii, fizjologii i fenotypu neurochemicznego neuronu. Zaprezentowana tutaj technika umożliwia rozległą charakterystykę poszczególnych neuronów podczas ruchu in vivo. Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do badania pierwotnych neuronów doprowadzających, ale także do charakterystyki motoneuronów i sensoromotorycznych interneuronów. Początkowo odpowiedź pojedynczego neuronu jest rejestrowana za pomocą metod elektrofizjologicznych podczas różnych ruchów żuchwy, po czym następuje wyznaczenie pola recepcyjnego danego neuronu. Następnie do neuronu wstrzykuje się wewnątrzkomórkowo marker neuronalny, a mózg jest przetwarzany w taki sposób, aby neuron mógł zostać zwizualizowany za pomocą mikroskopii świetlnej, elektronowej lub konfokalnej (Ryc. 1). Następnie rekonstruowana jest szczegółowa morfologia scharakteryzowanego neuronu, co pozwala na skorelowanie morfologii neuronalnej z odpowiedzią fizjologiczną neuronu (Ryc. 2,3). W niniejszym opracowaniu przedstawiono kluczowe szczegóły i wskazówki niezbędne do skutecznego wdrożenia tej techniki. Dzięki połączeniu tej metody z innymi technikami można uzyskać cenne dodatkowe informacje o badanym neuronie. Markerowanie neuronalne wsteczne może być wykorzystane do zidentyfikowania neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron, co pozwala na szczegółowe określenie obwodów neuronalnych. Metodę tę można połączyć z immunocytochemią w celu zbadania neuroprzekaźników w znakowanym neuronie oraz określenia fenotypów chemicznych neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron. Znakowany neuron może być również przygotowany do mikroskopii elektronowej w celu określenia cech ultrastrukturalnych i mikroobwodów danego neuronu. Podsumowując, technika ta jest potężną metodą dokładnej charakterystyki neuronów podczas ruchu in vivo, co pozwala na uzyskanie istotnych informacji o roli neuronu w funkcji sensoromotorycznej.

Protokół

1. Przygotowanie zwierząt

1. Zanurzyć szczura w narkozie za pomocą pentobarbalku sodowego (50mg/kg IP) i umieścić na macie grzewczej. Wygolić skórę nad tylną częścią czaszki za pomocą trymera dla zwierząt. Sprawdzić zwierzę, aby upewnić się, że osiągnięto poziom znieczulenia chirurgicznego, testując brak odruchu wycofania i wokalizacji podczas uszczypnięcia palców oraz brak odruchu powiekowego. Kontrolować poziom znieczulenia co 15 minut i utrzymywać poziom chirurgiczny poprzez iniekcje pentobarbalku sodowego w dawce 15mg/kg co 45 minut.
2. Stosując technikę aseptyczną, wykonać nacięcie w okolicy pachwinowej, tuż za fałdą tworzoną przez brzuch i wewnętrzną stronę uda, a następnie wprowadzić kaniulę (średnica 1mm, Clay Adams) do żyły udowej oraz tętnicy udowej. Wykonać nacięcie w linii środkowej w okolicy podżuchwowej i odsunąć mięśnie podjęzykowe. Wykonać małe nacięcie w tchawicy i wprowadzić kaniulę (średnica 2mm), aby umożliwić wentylację. Obwiązać kaniulę tchawiczą szwem, aby zabezpieczyć ją na miejscu. Monitorować systemowe ciśnienie skurczowe i rozkurczowe krwi za pomocą kaniuli tętniczej. Oprócz monitorowania odruchu wycofania i odruchu powiekowego, monitorować teraz ciśnienie krwi w celu oceny poziomu znieczulenia. W razie potrzeby podawać dodatkowe środki znieczulające przez kaniulę żylną.
3. Umieścić szczura w aparacie stereotaksycznym i przeprowadzić kraniotomię w celu odsłonięcia móżdżku. Podłączyć kaniulę tchawiczą do respiratora dla gryzoni. Wentylować zwierzę objętością 2 cm³ przy częstotliwości 100/min wilgotnym powietrzem. Należy utrzymać dodatnie ciśnienie końcowowydechowe (PEEP) na poziomie 1 cm H₂O, aby zapobiec zapadnięciu się płuc. Co 15 minut wykonywać hiperwentylację płuc, aby zapobiec atelektazie. Następnie pokryć powierzchnię mózgu ogrzanym olejem mineralnym (30°C). Należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.
4. Nałożyć klej cyjanoakrylowy na pręt sprzężony z wibratorem elektromagnetycznym i przymocować pręt w diastemie żuchwy. Poruszać żuchwą za pomocą sygnałów sterujących wibratorem pochodzących z wyjścia komputera A/D lub generatora sygnałów.
5. Umieścić elektrodę uziemiającą srebro-chlorek srebra pod skórą w sąsiedztwie miejsca kraniotomii.

2. Przygotowanie elektrody

1. Wytworzyć mikroelektrody z kwarcowego lub glinokrzemianowego szkła przy użyciu poziomej wyciągarki mikroelektrod.
2. Napełnić mikroelektrodę roztworem 5-10% biotinamidu rozpuszczonego w 0,25M KCl i 0,5M buforze Tris HCl (pH 7,6) lub 2% tetrametylorodaminy w soli fizjologicznej (pH 6). Sprawdzić impedancję elektrody za pomocą testera elektrod. Do rejestracji z aksonów o dużym średnicy należy przygotować elektrody o impedancji 60-80M Ω, a dla małych aksonów i interneuronów elektrody o impedancji 80-150MΩ.
3. Umieścić mikroelektrodę w głowicy elektrometru. Elektrody należy obserwować przez mały teleskop (20X z wbudowanym siatkowym celownikiem), który jest zamocowany za głową zwierzęcia. Użycie teleskopu jest istotne, ponieważ pozwala na precyzyjne stereotaktyczne pozycjonowanie elektrod.

3. Rejestracja elektrofizjologiczna i barwienie wewnątrzkomórkowe

1. Wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej i zastosuj nadkompensację sprzężenia pojemnościowego, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Pozwala to na precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu.
2. Wywołaj powtarzalne przemieszczenie żuchwy i wprowadź elektrodę do mózgu za pomocą silnika krokowego.
3. Rozpoznaj przebicie neuronów po nagłych spadkach potencjału DC i zidentyfikuj przebicia wewnątrzsomatyczne po trwającej aktywności synaptycznej. Wibrowanie elektrodą poprzez nadkompensację pojemności lub delikatne stukanie rzadko prowadzi do skutecznej penetracji komórki. Ze względu na wysoką impedancję elektrod, odpowiedzi neuronalne są rzadko obserwowane przed penetracją.
4. Po przebiciu neuronu i uznaniu penetracji za stabilną, scharakteryzuj odpowiedź neuronalną, stosując rampy i utrzymywanie potencjału oraz sinusoidalne ruchy żuchwy.⁵ Mapuj pole recepcyjne neuronu, badając skórę wokół głowy oraz jamę ustną za pomocą nieprzewodzącej sondy, np. drewnianego patyczka. Jeśli jest to istotne dla badania, sprawdź odpowiedź neuronu na inne funkcjonalnie istotne bodźce, takie jak skurcz mięśni i bodźce nocyceptywne.⁶ Pierwotne aferentne receptory neuronalne nocyceptywne reagują na bodźce nocyceptywne. Środki znieczulające ogólne, takie jak pentobarbital sodu, nie blokują przewodnictwa aksonalnego w pierwotnych neuronach aferentnych, lecz hamują przekazywanie synaptyczne. W związku z tym przewodnictwo aksonalne w aksonie pierwotnego neuronu aferentnego zostaje zachowane.
5. Wstrzyknij prąd (DC, 1-4nA) przez całkowity czas wstrzykiwania wynoszący 15-70nA minut. Monitoruj penetrację elektrody podczas wstrzykiwania prądu i przerwij procedurę, jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż -30mV.

4. Obróbka tkanek

1. Zutylizuj zwierzę poprzez przedawkowanie pentobarbitalu (140mg/kg IV) i przeprowadź perfuzję za pomocą płukanki naczyniowej (0.9% NaCl 38°C zawierającej 500 jednostek heparyny i 1ml 2% ksylokainy), a następnie 4% paraformaldehydu w 0.1M buforze fosforanowym (pH 7.4).
2. Wyjmij mózg i wykonaj przekroje o grubości 50-100μm za pomocą wibratomu w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej. Przekroje zbiera się w formie wolnopływającej w PBS o temperaturze 25°C.
3. Przygotuj mózg do barwienia DAB, inkubując go w 1-2% normalnym surowicy koziej i 1% Triton X-100 w 0.01M PBS, a następnie inkubując w kompleksie awidyna-biotyna (1:50 Elite Vectastain). Przeprowadź reakcję przekrojów z użyciem nikiel-DAB oraz H₂O₂. Aby przygotować preparat do barwienia Texas Red, inkubuj przekroje w kompleksie awidyna-biotyna (1:50) w PBS przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubuj w 4% Texas Red avidin DCS w PBST przez noc w temperaturze 4°C. Wykonaj przeciwbarwienie przekrojów fluorescencyjnym barwnikiem Nissla (NeuroTrace) przez 20min w temperaturze 23°C.
4. Jeśli neuron został wstrzyknięty rodamyną, zwizualizuj wstrzyknięty neuron bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Ex 545nm).

5. Łączenie metody z transportem wstecznym, immunocytochemią, obrazowaniem konfokalnym oraz ilościową analizą kolokalizacji

Sukces łączenia tej techniki z innymi metodami w dużej mierze zależy od prawidłowego znakowania wewnątrzkomórkowego.

1. Przedstawioną tutaj metodę można łatwo połączyć z retrogradnym znakowaniem neuronów.^7-10 W tym celu należy poddać zwierzę narkozie i, stosując technikę aseptyczną, wstrzyknąć znacznik neuronalny, taki jak peroksydaza chrzanowa (20% peroksydaza chrzanowa, Sigma VI, Sigma) oraz 1% peroksydaza chrzanowa aglutynowana zarodkami pszenicy (Sigma), do obwodowych obszarów docelowych, np. do mięśnia żwacza. Znacznik ten zostanie pobrany przez aksony obwodowe i przetransportowany drogą transportu aksonalnego do ciał motoneuronów. W przypadku mięśnia żwacza 15μl znacznika wstrzykuje się do mięśnia za pomocą sterylnej mikrosyringi o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie zwierzęta umieszcza się na podkładce grzewczej i monitoruje do czasu wybudzenia z narkozy, po czym przenosi się je do klatek w celu rekonwalescencji. Po 24h należy poddać zwierzęta narkozie, przeprowadzić charakterystykę fizjologiczną neuronów oraz zabarwić je wewnątrzkomórkowo. Następnie wykonuje się perfuzję zwierzęcia zgodnie z powyższym opisem i przetwarza skrawki tkanki w celu wykrycia obecności HRP, stosując tetrametylobenzydynę (TMB) jako chromogen i tungstinian sodu jako stabilizator, z intensyfikacją kobaltem. Skrawki umieszcza się w 1% tungstianie sodu rozpuszczonym w 0.1M PBS (pH 6.5) oraz 0.0007% TMB rozpuszczonym w bezwodnym etanolu i acetonie w temperaturze 15°C przez 20 min. Następnie utrwala się reakcję w skrawkach tkanki, dodając 1.0 ml 0.3% H₂O₂ na każde 100ml roztworu inkubacyjnego na 60 min. Tkankę płucze się w 0.1M PBS (pH 6.5) i umieszcza w 0.05% diaminobenzydynie (pH 7.4), 0.02% kobalcie i 0.01% H₂O₂ w 0.1M PBS (pH 7.4) na 10 min w temperaturze 37°C. Tkankę przetwarza się w celu wizualizacji neuronu wstrzykniętego z biotinamidem zgodnie z opisem, a następnie analizuje zależności między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi motoneuronami.
2. Przedstawioną tutaj technikę można również łatwo połączyć z immunocytochemią.⁶ Przykładowo, można poddać mózg obróbce immunocytochemicznej w kierunku synaptofizyny, aby dokładnie zlokalizować synapsy w znakowanych neuronach (Rys. 3). W tym celu skrawki mózgu inkubuje się w przeciwciałach mysich przeciwko synaptofizynie (1:10 000) przez 2 dni w temperaturze 4°C, a następnie inkubuje w przeciwciałach anty-mysich FITC (1:400) przez 1h w temperaturze 23°C.
3. Neurony znakowane markerami fluorescencyjnymi lub przygotowane do obrazowania fluorescencyjnego są idealne do obrazowania konfokalnego. Rysunek 3 przedstawia przykład przekroju optycznego uzyskanego za pomocą mikroskopii konfokalnej przez kolbkę aksonalną (Rys. 3). Animacje znakowanych neuronów generuje się poprzez pozyskiwanie wielu przekrojów optycznych przez znakowany neuron (Rys. 4).
4. Neurony znakowane tą metodą mogą być wykorzystane do ilościowej analizy kolokalizacji. W tym celu należy użyć publicznie dostępnego makra programowego wraz z programem NIH Image (dostępnym pod adresem http://phy.ucsf.edu/°idl/colocalization.htm). Lokalizację synaptofizyny w pojedynczych zakończeniach aksonalnych przeprowadza się poprzez połączenie znakowania wewnątrzkomórkowego z immunocytochemią synaptofizyny.⁶

6. Reprezentatywne wyniki:

Przegląd reprezentatywnych wyników, jakie można uzyskać za pomocą tej metody, przedstawiono na Rysunku 1. Odpowiednio zarejestrowano elektrofizjologicznie ten pojedynczy neuron pnia mózgu podczas ruchu żuchwy i, jak wyraźnie widać, odpowiedź tego neuronu (Rysunek 1 lewy dół, jasnoniebieski) była modulowana w czasie ruchu. Po charakterystyce elektrofizjologicznej do neuronu wstrzyknięto biotinamid, a następnie poddano go obróbce w celu wizualizacji. Zrekonstruowany neuron (Rysunek 1 środek, zielony) można powiązać z punktem orientacyjnym anatomicznym, w tym przypadku z zaznaczonym jądrem ruchowym nerwu trójdzielnego (czerwony obrys). Na podstawie odpowiedzi neuronu podczas ruchu oraz jego rekonstrukcji, neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecion mięśniowych. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny przykład odpowiedzi fizjologicznej neuronu podczas przemieszczania żuchwy. Odpowiedź neuronu przedstawiono jako chwilową częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź neuronu ściśle naśladuje przemieszczanie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron zapewnia sprzężenie zwrotne sensoryczne związane z pozycją żuchwy. Rysunek 3 to obraz o dużym powiększeniu aksonu barwionego wewnątrzkomórkowo w połączeniu z barwieniem na synaptofizynę oraz barwieniem Nissla. Zwróć uwagę na kolokalizację synaptofizyny (żółty) wewnątrz kolbki aksonalnej. Rysunek 4 to animacja pojedynczego, scharakteryzowanego fizjologicznie i znakowanego wewnątrzkomórkowo neuronu.

Rysunek 1. Przegląd metody. Górny lewy róg: przemieszczenie żuchwy. Środek: rejestracja wewnątrzkomórkowa (zielona) z pojedynczego neuronu (żółty). Morfologia tego neuronu została zrekonstruowana po rejestracji wewnątrzkomórkowej i iniekcji. Czerwony obrys wskazuje położenie jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Dolny lewy róg: odpowiedź fizjologiczna tego neuronu podczas ruchu żuchwy.

Rysunek 2. Reprezentatywna odpowiedź fizjologiczna pojedynczego sensorycznego neuronu mięśniowego zarejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Zwróć uwagę na podobieństwo odpowiedzi neuronalnej do przesunięcia żuchwy.

Rysunek 3. Terminalna arboryzacja aksonalna z butonami synaptycznymi (czerwone wybrzuszenia) neuronu sensorycznego barwionego wewnątrzkomórkowo, który zareagował podczas stymulacji mięśni. Następująca po tym obróbka immunocytochemiczna na obecność synaptofizyny wykazuje lokalizację synaptofizyny wewnątrz butona aksonalnego (żółty). Kolor zielony to fluorescencyjne barwienie Nissla.

Rysunek 4. Animacja aksonu pierwotnego neuronu aferentnego wrzecionka mięśniowego, którego odpowiedź fizjologiczna była rejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Akson został następnie zabarwiony wewnątrzkomórkowo i poddany obróbce w celu wizualizacji.
Pobierz film w wysokiej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj
Pobierz film w średniej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda jest potężną techniką, która dostarcza istotnych informacji na temat funkcji pojedynczych neuronów oraz tego, w jaki sposób odpowiedź poszczególnych neuronów wpływa na obwody neuronalne.⁹ Wiedza ta jest fundamentalna dla zrozumienia funkcji sensoryczno-motorycznych. Największą zaletą tej techniki jest możliwość określenia wielu parametrów neuronu, w tym jego fizjologii, morfologii oraz morfologii i rozmieszczenia synaps. W połączeniu z innymi technikami, takimi jak wsteczna znakowani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wibrator elektromagnetyczny	Ling Dynamic Systems	V101
generator sygnałów	Feedback Systems	PFG605	zdolny do generowania trapezoidalnego sygnału wyjściowego
szkło elektrodowe	Sutter Instrument Co.	AF100-68-10	z włóknem
wyciągacz elektrod	Sutter Instrument Co.	Model P-2000 lub P-80
biotinamid	Vector Laboratories	SP-1120	przechowywany w 4°C
Texas Red avidin DCS	Vector Laboratories	A-2016
tetrametylorodamina	Molecular Probes, Life Technologies	D-3308	masa cząsteczkowa 3000, z możliwością wiązania do lizyny
przeciwciało mysie anty-synaptofizyna	Chemicon International	MAB5258
fluorescencyjny barwnik Nissla	Neurotrace, Life Technologies	N-21480
tester elektrod	Winston Electronics	BL-1000-B	do pomiaru impedancji elektrod
elektrometr	Axon Instruments	Axoprobe 1A, Axoclamp 2B