Podstawowe techniki chirurgiczne u świnki w Getyndze: intubacja, cewnikowanie pęcherza moczowego, cewnikowanie naczynia udowego i perfuzja przezsercowa

Summary

Wykorzystanie domowych i miniaturowych świń w nauce znacznie wzrosło w ostatnich latach. Pokazując, jak wykonywać intubację, przezcewkowe cewnikowanie pęcherza moczowego, cewnikowanie tętnic i żył udowych, a także perfuzję przezsercową, dążymy do dalszego zwiększenia wartości miniświnek z Getyngi w badaniach biomedycznych.

Abstract

Pojawienie się miniświnki z Getyngi w badaniach takich tematów jak neuronauka, toksykologia, cukrzyca, otyłość i eksperymentalna chirurgia odzwierciedla bliskie podobieństwo tych zwierząt do ludzkiej anatomii i fizjologii ^1-6. Wielkość świnki miniaturowej w Getyndze pozwala na użycie sprzętu chirurgicznego i zaawansowanych metod obrazowania, podobnych do tych stosowanych u ludzi ^{w wieku 6-8} lat. Celem tego filmu instruktażowego jest zwiększenie świadomości na temat wartości świnek miniaturowych w badaniach biomedycznych, poprzez pokazanie, jak wykonywać intubację tchawicy, cewnikowanie przezcewkowe pęcherza moczowego, cewnikowanie tętnic i żył udowych, a także perfuzję przezsercową.

http://www.minipigs.com¹⁰. Aby uzyskać obszerne informacje na temat anatomii świń, odsyłamy do Nickel et al. Tom 1-5¹¹.

Protocol

1. Intubacja

1. Sprzęt potrzebny do intubacji dotchawiczej: środki wspomaganej wentylacji, zawiesia do otwierania ust, ssanie niskociśnieniowe z końcówką, laryngoskop weterynaryjny z prostym ostrzem o długości od 17 do 25 cm, stylet, strzykawka z powietrzem, stetoskop i taśma klejąca. Dla dorosłych świnek miniaturowych z Getyngi odpowiednia jest rurka dotchawicza o średnicy od 5 do 7 mm¹⁰. W tym filmie użyto rurki 5,5 mm ¹⁰.
2. Świnka miniaturowa jest umieszczana na plecach i odpowiednio podparta, aby zapewnić utrzymanie prostego przejścia krtaniowego.
3. Język jest lekko wyciągnięty, a szczęka otwarta przez asystenta bez nadmiernego rozciągania głowy. Rotacja dróg oddechowych lub nadmierne wyprostowanie głowy może zatkać drogi oddechowe, utrudniając identyfikację ujścia krtani i komplikując umieszczenie rurki tchawicy.
4. Laryngoskop jest wprowadzany do jamy gardłowej i służy do wciśnięcia języka, dzięki czemu nagłośnia jest widoczna. Końcówka ssania służy do wypierania nagłośni z podniebienia miękkiego. Końcówka laryngoskopu jest następnie używana do dociskania nagłośni w górę w kierunku podstawy języka, odsłaniając otwór krtani.
5. Pojawiają się chrząstki i struny głosowe, a rurka dotchawicza jest delikatnie przesuwana z lekkim obrotem do tchawicy podczas wydechu.
6. Mankiet rurki jest napompowany zgodnie ze specyfikacją producenta, przy jednoczesnym zachowaniu ostrożności, aby uniknąć nadmiernego napompowania, które może powodować obrzęk i obrzęk dróg oddechowych. Świnie mają oskrzela do wentylacji prawego czaszkowego płata płucnego. Dlatego ważne jest, aby umieścić rurkę powyżej rozwidlenia tchawicy. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu odpowiedniego rozmiaru rurki i co ważne poprzez przymocowanie bliższego końca rurki na poziomie pyska za pomocą taśmy klejącej.
7. Kiedy świnka miniaturowa jest prawidłowo zaintubowana, musi być wyczuwalny swobodny przepływ powietrza przez rurkę, a osłuchiwanie klatki piersiowej powinno ujawnić dźwięki oddychania zarówno po lewej, jak i prawej stronie klatki piersiowej.
8. Po podłączeniu respiratora z systemem monitorowania do miniświnki powinny być mierzone fizjologiczne wartości wydechowego dwutlenku węgla i można zaobserwować krzywą dwutlenku węgla, która podąża za wzorcem oddychania ustalonym przez ustawienia wentylatora^6,10.
9. Na wartości dwutlenku węgla i oksymetrii może początkowo wpływać premedykacja i indukcja znieczulenia. Jednak wartości te powinny szybko powrócić do normy przy odpowiedniej wentylacji^6,10. Wszelkie oznaki sinicy pomimo sztucznie wspomaganej wentylacji wskazują na niewłaściwe umieszczenie rurki. Najczęstszym błędem jest przypadkowe umieszczenie rurki w przełyku.

2. Przezcewkowe cewnikowanie pęcherza moczowego

1. Ta procedura dotyczy tylko samic świń. Dla dorosłych świnek miniaturowych odpowiedni jest cewnik Foleya w rozmiarze francuskim 8 lub 10. Ze względu na krzywiznę i wielkość zewnętrznego otworu cewki moczowej preferowany jest cewnik ze styletem. Wziernik do nosa może być używany u małych świnek miniaturowych, podczas gdy wziernik z dłuższymi ostrzami może być przydatny dla dużych zwierząt. Niezbędny sprzęt obejmuje również kleszczyki z tępą końcówką, strzykawkę z solą fizjologiczną, lubrykantem i zamkniętym workiem do drenażu moczu.
2. Aby jak najlepiej uwidocznić zewnętrzny otwór cewki moczowej podczas cewnikowania, miniświnka jest umieszczana na plecach z podparciem pod odcinkiem lędźwiowym, podczas gdy asystent ciągnie tylne nogi czaszkowo.
3. Nasmarowany wziernik jest wprowadzany i otwierany w celu uwidocznienia ściany pochwy. Zewnętrzny otwór cewki moczowej kobiety znajduje się w dnie pochwy w około jednej trzeciej do połowy odległości od szyjki macicy (ryc. 1A). Ponieważ jednak zwierzę jest ułożone na plecach, pozycja ujścia cewki moczowej będzie wydawać się odwrócona.
4. Cewnik jest kontrolowany za pomocą kleszczy z końcówką, więc końcówka cewnika jest kontynuacją kleszczy. Ostrożnie wprowadzić cewnik do ujścia cewki moczowej (^{ryc. 1B}). Cewka moczowa łatwo ulega urazowi, jeśli podczas cewnikowania zostanie użyta zbyt duża siła. Jednak początkowo można odczuwać niewielki opór, dopóki cewnik nie przejdzie przez zwieracz moczowy zewnętrzny. Jeśli ten problem będzie się powtarzał, może to oznaczać, że zwierzę nie jest wystarczająco głęboko uspokojone. Rozwiązaniem jest odczekanie chwili i pozwolenie, aby znieczulenie zadziałało.
5. Gdy cewnik dotrze do pęcherza, wyjmij sztyft, a mocz będzie widoczny płynący.
6. Napompuj balon solą fizjologiczną zgodnie ze specyfikacją producenta i delikatnie wyciągnij cewnik, aż balon zaczepi się o szyję pęcherza.
7. Zamocuj worek do drenażu moczu w systemie zamkniętym.
8. Przyklej cewnik do ogona, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia cewnika podczas obchodzenia się ze zwierzęciem.

3. Cewnikowanie tętnicy udowej i żyły

1. Niezbędny sprzęt obejmuje: skalpel, nożyczki chirurgiczne z końcówką, kleszczyki do tkanek, małe kleszcze chirurgiczne z końcówką, mały samozatrzymujący się retraktor tkankowy, uchwyt igły, wymienniki chirurgiczne, szew z igłą, heparynizowaną sól fizjologiczną jako płyn do płukania w celu utrzymania drożności cewnika, dwie kaniule dożylne o rozmiarze 18, dwie 4-francuskie osłonki końcówki brite z wprowadzaczem i prowadnikiem Seldingera.
2. Głębokość znieczulenia należy ocenić poprzez badanie międzypalcowego odruchu bólowego przed rozpoczęciem zabiegu.
3. Do tętnicy i żyły udowej zbliża się za pomocą miniświnki umieszczonej na plecach, a tylna noga cofnięta na boki. Zidentyfikuj w fałdzie skórnym między mięśniem gracilis a mięśniem sartorius, gdzie znika pulsacja powierzchownej części tętnicy odpiszczelowej przyśrodkowej.
4. Wykonaj podłużne powierzchowne nacięcie skóry czaszki do tego punktu, unikając w ten sposób przypadkowego uszkodzenia przyśrodkowych naczyń odpiszczelowych.
5. Użyj nożyczek z końcówką, aby wypreparować leżącą pod spodem tkankę podskórną.
6. Podział powięziowy mięśnia sartoriusa i gracilisa jest podzielony czaszkowo do miejsca penetracji przyśrodkowych naczyń odpiszczelowych, najpierw za pomocą małych kleszczy chirurgicznych z końcówką, a następnie cyfrowo.
7. Obie grupy mięśni są oddzielone małym samozatrzymującym się zwijaczem tkankowym, uważając, aby nie uszkodzić nerwu i naczyń udowych.
8. Tętnicę izoluje się na długości około 1 do 2 cm za pomocą rozwarstwienia.
9. Obróć skośną igłę venflonową tak, aby światło było skierowane do góry. Zegnij lekko igłę, aby łatwiej podążała za krzywizną naczynia. Pamiętaj, aby upewnić się, że igła nadal może poruszać się do przodu i do tyłu przy niewielkim wysiłku.
10. Tętnica jest przebijana, igła cofana, a drut prowadzący Seldingera jest wprowadzany przez rurkę venflon.
11. Wyjmij rurkę venflonową, delikatnie wywierając nacisk na tętnicę, aby zapewnić zamocowanie prowadnika.
12. Osłonę z wprowadzaczem wkłada się na przewód Seldinger i przesuwa do żądanej pozycji, po czym wprowadza się i przewód Seldinger jest usuwany.
13. Żyła udowa znajduje się tuż poniżej i przyśrodkowo do tętnicy. Po odizolowaniu żyły za pomocą rozwarstwienia, żyła jest kaniulowana zgodnie z wcześniejszym opisem dla tętnicy.
14. Aby sprawdzić, czy zarówno tętnica, jak i żyła są prawidłowo cewnikowane, pobierz krew z obu osłonek i porównaj kolor próbek. Za każdym razem, gdy pobierasz próbkę krwi, pamiętaj, aby następnie przepłukać cewniki heparynizowaną solą fizjologiczną w celu utrzymania drożności cewnika.
15. Cewniki są zabezpieczone, a skóra jest zamykana kilkoma szwami.
16. Wokół tętnicy i żyły można umieścić pętlę naczyniową w celu unieruchomienia naczyń przed nakłuciem. Pomimo swoich zalet, generalnie unikamy tego dodatkowego kroku, ponieważ wymaga on nadmiernego rozwarstwienia naczyń i może zwiększyć ryzyko uszkodzenia bocznych i głębokich gałęzi.

4. Perfuzja przezsercowa

1. Do zabiegu potrzebny jest następujący sprzęt: system perfuzyjny (ryc. 2), odpowiednie płyny perfuzyjne, skalpel, nożyczki chirurgiczne z końcówką, nożyce do kości i dwa duże kleszcze samopodtrzymujące, z których co najmniej jeden ma zakrzywioną końcówkę. Samozabezpieczający się retraktor mostka nie jest absolutnie konieczny, ale znacznie ułatwia procedurę.
2. Perfuzja przezsercowa musi być przeprowadzana w dobrze wentylowanym pomieszczeniu z systemem odsysania oparów o dużej mocy i urządzeniami umożliwiającymi pobieranie płynów perfuzyjnych i krwi w celu późniejszego bezpiecznego usunięcia.
3. Po dożylnym wstrzyknięciu śmiertelnej dawki pentobarbitalu, przed kontynuacją przetestuj międzypalcowy odruch bólowy.
4. Najlepszy dostęp do serca i aorty zapewnia sternotomia środkowa. Wykonaj głębokie podłużne nacięcie skóry, rozciągające się od manubrium do wyrostka mieczykowatego mostka. Uzyskaj dostęp do jamy klatki piersiowej, wykonując małe nacięcie w przeponie tuż pod wyrostkiem mieczykowatym.
5. Włóż nożyce do kości do jamy klatki piersiowej i przetnij mostek na pół. Należy zachować ostrożność podczas wykonywania tej procedury, ponieważ serce może przylegać w pewnym miejscu do wnętrza mostka. Dlatego upewnij się, że ostrze nożyc do kości spoczywa przez cały czas wewnątrz klatki piersiowej o wnętrze mostka.
6. Po podzieleniu mostka włóż samozabezpieczający się zwijacz mostka i otwórz klatkę piersiową.
7. Jeśli nadal jest nienaruszony, wykonaj małe nacięcie w osierdziu na wierzchołku serca, a następnie cyfrowo otwórz worek osierdziowy.
8. Zidentyfikuj lewą komorę, prawe małżowinę uszną i aortę wraz z żyłą główną górną (ryc. 1C)
9. Wykonaj małe powierzchowne nacięcie w pobliżu wierzchołka serca i uzyskaj dostęp do lewej komory, perforując mięsień sercowy narzędziem.
10. Wprowadź kaniulę perfuzyjną do lewej komory i wsuń końcówkę kaniuli czaszkowo do aorty.
11. Kiedy kaniula jest wyczuwalna między palcami w aorcie, zaciśnij kaniulę na miejscu za pomocą samopodtrzymujących się zakrzywionych kleszczy.
12. Wykonaj nacięcie w prawej małżowinie usznej i rozpocznij wstrzykiwanie utrwalacza przez kaniulę perfuzyjną. Przepływ perfuzatu w aorcie może być wyczuwalny, a krew będzie wylewać się przez naciętą prawą małżowinę uszną, gdy przepływ perfuzatu do naczyń miniświnki będzie kontynuowany. Zauważ, jak ogólnoustrojowa perfuzja z paraformaldehydem indukuje nadmierne wyprostowanie kończyn i drganie mięśni powierzchownych z powodu aldehydowego wiązania poprzecznego nerwów i mięśni. W przypadku korzystania z systemu perfuzyjnego zasilanego sprężonym powietrzem zamiast grawitacyjnie, należy wyjąć kaniulę lub zacisnąć przezroczystą silikonową rurkę, zanim kanister będzie pusty, aby uniknąć przedostawania się powietrza do układu naczyniowego.

Rysunek 1. Odp .: Samica miniświni z Getyngi ma zewnętrzny otwór cewki moczowej. Z punktu widzenia Ujście cewki moczowej po wprowadzeniu cewnika. Ład: Widok brzuszny serca świni miniaturowej po sternotomii środkowej.

Rysunek 2. Odp .: System perfuzyjny składa się z rurki wlotowej z regulowanym zaworem ciśnieniowym i dźwignią służącą do kontrolowania wlotu sprężonego powietrza do pojemnika zawierającego perfuzat. Przezroczysta silikonowa rurka łączy pojemnik z kaniulą wykonaną ze stalowej rurki o średnicy 4 mm. B i C: Ściskając dźwignię wlotową, ciśnienie w pojemniku wzrasta, a perfuzat jest napędzany przez kaniulę. D: Gdy przezroczysta silikonowa rurka i kaniula są wypełnione perfuzatem, przepływ zostaje zatrzymany za pomocą zacisku i system jest gotowy do użycia.

Discussion

Niniejsza prezentacja zawiera instrukcje wizualne krok po kroku, jak wykonać cztery często stosowane procedury w badaniach na świnkach^{miniaturowych 12,13}. Opisane techniki mogą być stosowane z niewielką lub żadną adaptacją u świń rasy lądowej i innych dużych zwierząt badawczych, takich jak psy i owce¹⁴. W celu uniknięcia zakażeń należy stosować technikę aseptyczną podczas wykonywania procedur opisanych w badaniach dotyczących przeżycia.

Indukcja znieczulenia jest ważna ze względu na dobrostan zwierząt i ze względów naukowych i powinna zapewnić brak odruchów rogówkowych i dobre rozluźnienie mięśni przed próbą intubacji dotchawiczej. Ponieważ jednak środki znieczulające stosowane do indukcji nie są podawane w stałych dawkach, ale podawane do momentu zaobserwowania pożądanego efektu, ważne jest, aby ściśle monitorować zwierzę ze względu na ryzyko wystąpienia bezdechu, zwłaszcza w przypadku stosowania propofolu^6,10. Do intubacji tchawicy zastosowanie sprayu ksylocainy lub środka zwiotczającego mięśnie może ułatwić wprowadzenie rurki, ale stosowanie blokerów nerwowo-mięśniowych powinno być wykonywane wyłącznie przez personel, który jest dobrze przeszkolony w takich procedurach, aby zachować zgodność z wymogami etycznymi. Należy zachować ostrożność, aby nie dojść do uszkodzenia kanału krtaniowego podczas intubacji, aby uniknąć obrzęku tchawicy. Obrzęk dróg oddechowych można leczyć NLPZ lub podobnymi lekami przeciwzapalnymi¹⁰. Świnie mogą być intubowane z różnych pozycji, ale trzymanie zwierzęcia na grzbiecie jest łatwiejsze dla tych, którzy regularnie przeprowadzają intubację człowieka, ponieważ przedstawia drogi oddechowe w podobny sposób⁶. Najczęstszym błędem podczas intubacji jest przypadkowe umieszczenie rurki w przełyku, który znajduje się tuż poniżej kanału krtaniowego, gdy zwierzę jest ułożone na grzbiecie. Uwaga, nigdy nie należy wysuwać rurki bez uprzedniego wyraźnego zidentyfikowania arytenoidy, chrząstki i struny głosowe.

Przezcewkowe cewnikowanie pęcherza moczowego przez cewkę moczową jest łatwe do wykonania u samic świń, podczas gdy procedura ta jest niezwykle trudna, a być może niemożliwa, u samców⁶. Należy zauważyć, że ponieważ żeński otwór cewki moczowej znajduje się przed pochwą, większy otwór pochwy może być błędnie cewnikowany. Stosowanie sterylnego i dezynfekującego lubrykantu jest wskazane w badaniach nad przeżyciem. Ponadto lubrykant o działaniu miejscowo znieczulającym może ułatwić procedurę cewnikowania.

Podczas wykonywania cewnikowania tętnic udowych i żył wybór cewników naczyniowych i sposób ich mocowania różnią się w zależności od tego, czy cewniki nie przeżywają, czy też przeżywają, zwłaszcza gdy cewniki są wszczepiane na dłuższy okres czasu⁶. Na przykład cewniki do przewlekłej implantacji powinny być wysoce biokompatybilne, mieć koraliki retencyjne lub mankiety do mocowania, a także nie uszkadzać ściany naczynia z upływem czasu, wywołując w ten sposób zakrzepicę lub nadżerkę⁶.

W niniejszym filmie używamy zamkniętego systemu zasilanego sprężonym powietrzem do perfuzji przezsercowej. Inną opcją jest zastosowanie systemu napędzanego grawitacją. Zaletą systemów grawitacyjnych w porównaniu z systemami wykorzystującymi sprężone powietrze jest to, że są proste, wydajne i nie stwarzają ryzyka przedostania się sprężonego powietrza do układu naczyniowego. Jednak ciśnienie hydrostatyczne wywierane przez systemy grawitacyjne zmienia się w sposób ciągły podczas perfuzji, co może wpływać na wyniki histologiczne¹⁵. W zależności od rodzaju badań histopatologicznych, które chce się wykonać, korzystne może być uprzednie perfuzja zwierzęcia za pomocą heparynizowanej soli fizjologicznej. Jest to szczególnie ważne podczas barwienia immunofluorescencyjnego w celu uniknięcia problemów z autofluorescencją spowodowanych przez erytrocyty. Ponadto, jeśli narządem zainteresowania jest mózg, aorta zstępująca może zostać zaciśnięta, aby uratować utrwalacz. Jednak u świń ten krok pociąga za sobą dodatkowe rozwarstwienie i przedłuży procedurę.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Respirator do intubacji
	GE Healthcare	1009-9002-000
Ssanie z końcówką	Unomedical
Laryngoskop	Miller	85-0045 (zestaw laryngoskopowy)
Rurka dotchawicza 5,5 mm ID	Smiths Medical	100/199/055
Stylet	Hudson RCI	5-151001
Strzykawka 5ml
Stetoskop	Martin	17-262-00
Cewnik pęcherza
moczowego AquaFlate glicerynowy silikonowy cewnik Foleya 8-francuski ze styletem	Rü sch	178003
Wziernik nosowy	Martin	36-859-50
Wziernik doodbytniczy	Martin	30-613-15
Kleszczyki tępo-końcówkowe	Martin	13-374-16
			do smarowania cewników
Cathejell Lidocain	Montavit	CJL08501
Grzebień do wkraplania.	Falcon BD	08-40-200
A4 Worek do drenażu moczu	Unomedical	38 155 1S
Taśma klejąca
Cewnik tętnic i żył udowych
Skalpel	Martin	10-295-11
Nożyczki chirurgiczne z tępą końcówką	Martin	11-881-18
Kleszczyki do tkanek	Martin	12-100-14
Małe kleszcze chirurgiczne z końcówką	Martin	13-375-13
Mały samozatrzymujący się retraktor tkanek	Martin	15-753-13
Uchwyt na igłę	Martin	20-634-14
Wymiana
Szew z igłą Sól fizjologiczna
Heparine	Leo Laboratories	585679
18-gauge venflon	BD Biosciences	393206
4-francuskie osłony końcówki brite z wprowadzaczem i przewodem prowadzącym Seldinger	Cordis	154-2629-1/0017
Perfuzja przezsercowa
System perfuzji ciśnieniowej	Domowy
opar system ekstrakcji	Gram A/S	01750000 i 0303700
Perfusant 5L
Nożyczki chirurgiczne z końcówką	Martin	11-881-18
Nożyce do kości	FST	16150-24
Kleszcze samotrzymające z dużą zakrzywioną końcówką	Martin	13-421-18
Samozabezpieczający zwijacz mostka	Rudolf Medical	7520-10
Pentobarbital	Królewski Uniwersytet Weterynaryjny i Rolniczy (KVL)	200 mg/ml
Venflon w rozmiarze 22	BD Biosciences	393202