Podstawowe techniki chirurgiczne u miniorśca göttingenskiego: intubacja, cewzowanie pęcherza moczowego, kaniulacja naczyń udowych oraz perfuzja transkardialna

Podsumowanie

Wykorzystanie świń domowych i miniaturowych w nauce znacząco wzrosło w ostatnich latach. Poprzez zaprezentowanie sposobu przeprowadzania intubacji, cewnikowania pęcherza przezcewkowej, cewnikowania tętnicy i żyły udowej, a także perfuzji przezsercowej, dążymy do dalszego zwiększenia wartości miniswiń rasy Göttingen w badaniach biomedycznych.

Streszczenie

Wykorzystanie minipig z Göttingen w badaniach nad takimi zagadnieniami jak neuronauka, toksykologia, cukrzyca, otyłość oraz chirurgia eksperymentalna wynika z dużego podobieństwa tych zwierząt do ludzkiej anatomii i fizjologii ^1-6. Wielkość minipiga z Göttingen umożliwia stosowanie sprzętu chirurgicznego i zaawansowanych metod obrazowania podobnych do tych używanych u ludzi ^6-8. Celem niniejszego filmu instruktażowego jest zwiększenie świadomości na temat wartości minipigów w badaniach biomedycznych poprzez zademonstrowanie sposobu wykonywania intubacji tchawicy, cewnikowania pęcherza przezcewkowej, cewnikowania tętnicy i żyły udowej, a także perfuzji transkardialnej.

Intubację endotrachealną należy przeprowadzić podczas każdej znieczulenia ogólnego minipigów, ponieważ zapewnia ona drożność dróg oddechowych, umożliwia wentylację wspomaganą i chroni drogi oddechowe przed aspiratami. Cewnikowanie pęcherza przez cewkę moczową może dostarczyć cennych informacji o stanie nawodnienia, a także o funkcji nerek i układu sercowo-naczyniowego podczas długotrwałych zabiegów chirurgicznych. Ponadto cewnikowanie pęcherza może zapobiec zanieczyszczeniu delikatnego sprzętu medyczno-technicznego oraz bolesnemu rozciągnięciu pęcherza, co mogłoby zaszkodzić zwierzęciu i niepotrzebnie wpłynąć na przebieg eksperymentu z powodu zwiększonego napięcia nerwu błędnego i zmienionych parametrów fizjologicznych. Kaniulacja tętnicza i żylna jest przydatna do pobierania wielokrotnych próbek krwi i monitorowania różnych parametrów fizjologicznych. W przypadku eksperymentów obejmujących neurochirurgię stereotaktyczną w ramie oraz obrazowanie mózgu, preferowana jest kaniulacja naczyń udowych ze względu na łatwiejszy dostęp niż w przypadku naczyń szyjnych. Podczas kaniulacji naczyń w badaniach przeżywalności należy stosować ścisłą technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji⁶. Perfuzja transkardialna jest najskuteczniejszą metodą utrwalania i daje najlepsze wyniki przy przygotowywaniu organów minipigów do badań histologicznych i histochemicznych^2,9. Po więcej informacji na temat znieczulenia, chirurgii i technik eksperymentalnych u świń w ogóle odsyłamy do publikacji Swindle 2007. Uzupełniające informacje dotyczące premedykacji i indukcji znieczulenia, wentylacji wspomaganej, analgesji oraz opieki przed- i pooperacyjnej nad minipigami rasy Göttingen są dostępne w internecie pod adresem http://www.minipigs.com¹⁰. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat anatomii świń odsyłamy do Nickel et al. Vol. 1-5¹¹.

Protokół

1. Intubacja

1. Wyposażenie niezbędne do intubacji endotrachealnej: zestaw do wentylacji wspomaganej, rozwieracze do otwierania pyska, ssak niskociśnieniowy z tępą końcówką, laryngoskop weterynaryjny z prostym ostrzem o długości od 17 do 25 cm, prowadnik (stylet), strzykawka z powietrzem, stetoskop i taśma klejąca. Dla dorosłych minipigów rasy Göttingen odpowiednia jest rurka endotrachealna o rozmiarze od 5 do 7 mm¹⁰. W niniejszym filmie zastosowano rurkę 5,5 mm ¹⁰.
2. Minipiga kładzie się na plecach i odpowiednio stabilizuje, aby zapewnić zachowanie linii prostej przejścia krtaniowego.
3. Język jest lekko wysuwany, a żuchwa utrzymywana w otwartej pozycji przez asystenta, bez nadmiernego wyprostu głowy. Rotacja dróg oddechowych lub nadmierne wyprosty głowy mogą doprowadzić do niedrożności dróg oddechowych, co utrudnia identyfikację wejścia do krtani i komplikuje wprowadzenie rurki do tchawicy.
4. Laryngoskop wprowadza się do jamie gardłowej i używa do odepchnięcia języka, aby odsłonić nagłośnię. Końcówkę ssaka wykorzystuje się do odsunięcia nagłośnika od podniebienia miękkiego. Następnie za pomocą końcówki laryngoskopu uciska się nagłośnię w górę, w kierunku nasady języka, odsłaniając wejście do krtani.
5. W polu widzenia pojawiają się chrząstki przynadgłośniowe i struny głosowe, a rurkę endotrachealną wprowadza się delikatnie, z lekkim obrotem, do tchawicy podczas wydechu.
6. Manżet rurki nadmuchuje się zgodnie ze specyfikacją producenta, dbając o to, aby uniknąć nadmiernego napompowania, które może spowodować obrzęk i wysięki w drogach oddechowych. Świnie posiadają oskrzele wentylujące prawy płat kranialny płuca. Dlatego ważne jest umieszczenie rurki powyżej rozwidlenia tchawicy. Ułatwia to zastosowanie odpowiedniego rozmiaru rurki oraz, co istotne, przymocowanie proksymalnego końca rurki na poziomie ryjka za pomocą taśmy klejącej.
7. Po prawidłowej intubacji minipiga należy wyczuć swobodny przepływ powietrza przez rurkę, a osłuchiwanie klatki piersiowej powinno wykazać dźwięki oddechowe po obu stronach klatki piersiowej.
8. Po podłączeniu respiratora z systemem monitorowania do minipiga powinny być mierzalne fizjologiczne wartości wydychanego dwutlenku węgla i powinna być widoczna krzywa dwutlenku węgla, która odpowiada wzorowi oddychania określonemu przez ustawienia respiratora^6,10.
9. Wartości dwutlenku węgla i oksymetrii mogą być początkowo zaburzone przez premedykację i indukcję znieczulenia. Wartości te powinny jednak szybko wrócić do normy przy prawidłowej wentylacji^6,10. Jakikolwiek objaw sinicy mimo wentylacji wspomaganej wskazuje na nieprawidłowe umieszczenie rurki. Najczęstszym błędem jest przypadkowe wprowadzenie rurki do przełyku.

2. Cewnikowanie pęcherza przezcewkowe

1. Niniejsza procedura dotyczy wyłącznie loch. W przypadku dorosłych minipigów odpowiedni jest cewnik Foleya o rozmiarze French 8 lub 10. Ze względu na krzywiznę i rozmiar zewnętrznego ujścia cewki moczowej preferowany jest cewnik ze zgłębnikiem. U małych minipigów można zastosować rozwierak nosowy, natomiast u dużych zwierząt użyteczny może być rozwierak z dłuższymi ramionami. Niezbędny sprzęt obejmuje również kleszczyki tępym końcem, strzykawkę z solą fizjologiczną, lubrykant oraz zamknięty system worka do drenażu moczu.
2. Aby zapewnić najlepszą wizualizację zewnętrznego ujścia cewki moczowej podczas cewnikowania, minipiga kładzie się na plecach z podparciem w odcinku lędźwiowym, podczas gdy asystent odciąga tylne kończyny w kierunku głowowym.
3. Smarowany lubrykantem rozwierak zostaje wprowadzony i otwarty w celu wizualizacji ściany pochwy. Zewnętrzne ujście cewki moczowej u samicy znajduje się w podłodze pochwy, w odległości około jednej trzeciej do połowy drogi do szyjki macicy (Rys. 1A). Jednak ze względu na ułożenie zwierzęcia na plecach, pozycja ujścia cewki moczowej będzie wydawać się odwrócona.
4. Cewnik jest prowadzony za pomocą kleszczyków tępym końcem, tak aby czubek cewnika stanowił przedłużenie kleszczyków. Ostrożnie wprowadź cewnik do ujścia cewki moczowej (^{Rys. 1B}). Cewka moczowa jest podatna na urazy, jeśli podczas cewnikowania zostanie użyta zbyt duża siła. Początkowo może być jednak odczuwalny lekki opór, dopóki cewnik nie przejdzie przez zewnętrzny zwieracz cewki moczowej. Jeśli problem ten będzie się utrzymywał, może to wskazywać na niewystarczające sedowanie zwierzęcia. Rozwiązaniem jest odczekanie chwili, aż znieczulenie zacznie działać.
5. Gdy cewnik dotrze do pęcherza, należy usunąć zgłębnik, co spowoduje wypłynięcie moczu.
6. Należy napełnić balonik solą fizjologiczną zgodnie ze specyfikacją producenta i delikatnie wyciągnąć cewnik, aż balonik zablokuje się na szyjce pęcherza.
7. Podłącz zamknięty system worka do drenażu moczu.
8. Przyklej cewnik taśmą do ogona, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia cewnika podczas manipulacji ze zwierzęciem.

3. Kanulacja tętnicy i żyły udowej

1. Niezbędny sprzęt obejmuje: skalpel, tępe nożyczki chirurgiczne, pęsetę anatomiczną, małą tępą pęsetę chirurgiczną, mały samoutrzymujący się rozwieracz tkanek, igłotrzymacz, tampony chirurgiczne, nici z igłą, sól fizjologiczną z heparyną jako płyn do przepłukiwania w celu utrzymania drożności cewnika, dwie kaniule do żył obwodowych 18-gauge oraz dwie osłonki 4-French z wprowadnikiem i prowadnikiem Seldingera.
2. Przed rozpoczęciem procedury należy ocenić głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch bólowy przestrzeni międzycyfrowych.
3. Dostęp do tętnicy i żyły udowej wykonuje się u minipig ułożonego na plecach, z tylną kończyną odciągniętą bocznie. W fałdzie skóry między mięśniem smukłym a mięśniem krawieckim należy zidentyfikować miejsce, w którym zanika pulsacja powierzchownej części tętnicy odpiszczelowej przyśrodkowej.
4. W miejscu tym należy wykonać podłużne, powierzchowne nacięcie skóry w kierunku kranialnym, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia naczyń tętnicy odpiszczelowej przyśrodkowej.
5. Używając tępych nożyczek, należy rozdzielić leżącą poniżej tkankę podskórną.
6. Powięź mięśnia krawieckiego i smukłego rozcina się w kierunku kranialnym od miejsca penetracji naczyń tętnicy odpiszczelowej przyśrodkowej, najpierw za pomocą małej tępej pęsety chirurgicznej, a następnie palcem.
7. Dwie grupy mięśni rozsuwa się za pomocą małego samoutrzymującego się rozwieracza tkanek, dbając o to, aby nie uszkodzić nerwu udowego i naczyń.
8. Tętnicę izoluje się na długości około 1 do 2 cm za pomocą rozdzielania tępego.
9. Należy obrócić ściętą igłę kaniuli tak, aby światło było skierowane ku górze. Igłę należy lekko wygiąć, aby łatwiej dopasowała się do krzywizny naczynia. Należy upewnić się, że igła nadal może swobodnie przesuwać się w przód i w tył.
10. Następuje nakłucie tętnicy, wycofanie igły i wprowadzenie prowadnika Seldingera przez rurkę kaniuli.
11. Rurkę kaniuli usuwa się, delikatnie uciskając tętnicę, aby zapewnić stabilizację prowadnika.
12. Osłonkę z wprowadnikiem wprowadza się po prowadniku Seldingera i posuwa do pożądanej pozycji, po czym usuwa się wprowadnik i prowadnik Seldingera.
13. Żyła udowa znajduje się tuż poniżej i przyśrodkowo od tętnicy. Po wyizolowaniu żyły metodą rozdzielania tępego, przeprowadza się kaniulację żyły w sposób opisany wcześniej dla tętnicy.
14. Aby zweryfikować poprawność kaniulacji tętnicy i żyły, należy pobrać krew z obu osłonek i porównać kolor próbek. Przy każdym pobieraniu krwi należy pamiętać o następującym przepłukaniu cewników solą fizjologiczną z heparyną w celu utrzymania ich drożności.
15. Cewniki zostają zabezpieczone, a skórę zamyka się kilkoma szwami.
16. W celu unieruchomienia naczyń przed nakłuciem wokół tętnicy i żyły można umieścić pętlę naczyniową. Pomimo zalet, zazwyczaj unikamy tego dodatkowego kroku, ponieważ wymaga on nadmiernego rozdzielania naczyń i może zwiększyć ryzyko uszkodzenia gałęzi bocznych i głębokich.

4. Perfuzja transkardialna

1. Do procedury niezbędny jest następujący sprzęt: system perfuzyjny (Rys. 2), odpowiednie płyny perfuzyjne, skalpel, chirurgiczne nożyczki z tępym końcem, kleszcze do kości oraz dwie duże kleszczyki samozaciskowe, z czego co najmniej jeden musi mieć zakrzywioną końcówkę. Samozaciskowy rozwierak mostka nie jest absolutnie niezbędny, ale znacznie ułatwia procedurę.
2. Perfuzję transkardialną należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu z wydajnym systemem odciągu oparów oraz zapleczem umożliwiającym zbieranie płynów perfuzyjnych i krwi w celu ich późniejszej bezpiecznej utylizacji.
3. Po dożylnym wstrzyknięciu śmiertelnej dawki pentobarbitalu, przed kontynuacją należy sprawdzić odruch bólowy między palcami.
4. Najlepszy dostęp do serca i aorty zapewnia medianowa sternotomia. Wykonaj głębokie podłużne nacięcie skóry, rozciągając je od manubrium do wyrostka xifoidego mostka. Uzyskaj dostęp do jamy klatki piersiowej, wykonując niewielkie nacięcie w przeponie tuż poniżej wyrostka xifoidego.
5. Wprowadź kleszcze do kości do jamy klatki piersiowej i przetnij mostek na pół. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować ostrożność, ponieważ serce może być w niektórych miejscach przylegać do wewnętrznej strony mostka. Dlatego należy upewnić się, że ostrze kleszczy do kości spoczywa przez cały czas wewnątrz jamy klatki piersiowej, opierając się o wewnętrzną ścianę mostka.
6. Po rozdzieleniu mostka wprowadź samozaciskowy rozwierak mostka i otwórz jamę klatki piersiowej.
7. Jeśli jest nienaruszone, wykonaj niewielkie nacięcie w osierdziu w okolicy wierzchołka serca, a następnie palcami otwórz worek osierdziowy.
8. Zidentyfikuj lewą komorę, prawy przedsionek oraz aortę wraz z żyłą główną górną (Rys. 1C)
9. Wykonaj niewielkie, powierzchowne nacięcie w pobliżu wierzchołka serca i uzyskaj dostęp do lewej komory, perforując mięsień sercowy instrumentem z tępym końcem.
10. Wprowadź kaniulę perfuzyjną do lewej komory i przesuń końcówkę kaniuli w kierunku kranialnym do aorty.
11. Gdy kaniula zostanie wyczuta palcami w aorcie, przymocuj ją w tym miejscu za pomocą zakrzywionych kleszczyków samozaciskowych.
12. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku i rozpocznij wstrzykiwanie utrwalacza przez kaniulę perfuzyjną. Przepływ perfuzatu w aorcie można wyczuć, a krew będzie wypływać przez nacięty prawy przedsionek w miarę kontynuowania przepływu perfuzatu do naczyń minipig. Zauważ, że perfuzja systemowa paraformaldehydem indukuje hyperekstensję kończyn i drgania powierzchownej muskulatury z powodu sieciowania nerwów i mięśni przez aldehyd. W przypadku używania systemu perfuzyjnego zasilanego sprężonym powietrzem zamiast grawitacji, należy pamiętać o usunięciu kaniuli lub zacisnięciu przezroczystej rurki silikonowej przed opróżnieniem pojemnika, aby zapobiec przedostaniu się powietrza do układu naczyniowego.

Rycina 1. A: Zewnętrzny otwór cewki moczowej samicy miniorślep Göttingen. B: Otwór cewki moczowej po wprowadzeniu cewnika. C: Widok brzuszny serca miniorślep po medianowej sternotomii.

Rysunek 2. A: Układ perfuzyjny składa się z przewodu wlotowego z regulowanym zaworem ciśnienia oraz dźwigni służącej do kontrolowania dopływu sprężonego powietrza do pojemnika z perfuzatem. Przezroczysty przewód silikonowy łączy pojemnik z kaniulą o tępym zakończeniu, wykonaną ze stalowej rurki o średnicy 4 mm. B i C: Poprzez naciśnięcie dźwigni wlotowej wzrasta ciśnienie w pojemniku, a perfuzat jest wypychany przez kaniulę. D: Po napełnieniu przezroczystego przewodu silikonowego i kaniuli perfuzatem, przepływ zostaje zatrzymany za pomocą zacisku, a układ jest gotowy do użycia.

Dyskusja

Niniejsza prezentacja zawiera szczegółowe instrukcje wizualne krok po kroku dotyczące przeprowadzania czterech powszechnie stosowanych procedur w badaniach na miniprosiętach^12,13. Opisane techniki mogą być stosowane z niewielkimi modyfikacjami lub bez nich u świń rasowych oraz u innych dużych zwierząt laboratoryjnych, takich jak psy i owce¹⁴. Podczas wykonywania opisanych procedur w badaniach na zwierzętach przeżywalniczych należy stosować technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji.

Indukcja znieczulenia jest istotna ze względu na dobrostan zwierząt oraz powody naukowe i powinna zapewnić brak odruchów rogówków oraz dobre rozluźnienie mięśni przed próbą intubacji endotrachealnej. Ponieważ jednak środki anestetyczne stosowane do indukcji nie są podawane w stałych dawkach, lecz aż do uzyskania pożądanego efektu, konieczne jest ścisłe monitorowanie zwierzęcia ze względu na ryzyko bezdechu, szczególnie w przypadku stosowania propofolu^6,10. Przy intubacji tchawicy zastosowanie sprayu z ksylokainą lub leku rozluźniającego mięśnie może ułatwić wprowadzenie rurki, jednak blokery nerwowo-mięśniowe powinny być podawane wyłącznie przez personel przeszkolony w takich procedurach, aby zachować wymagania etyczne. Należy zachować ostrożność, aby nie urazić przejścia krtani podczas intubacji, co pozwoli uniknąć obrzęku tchawicy. Obrzęk dróg oddechowych można leczyć za pomocą NLPZ lub podobnych leków przeciwzapalnych¹⁰. Świnie można intubować w różnych pozycjach, jednak ułożenie zwierzęcia na plecach jest zazwyczaj łatwiejsze dla osób regularnie wykonujących intubację u ludzi, ponieważ drogi oddechowe są wówczas prezentowane w podobny sposób⁶. Najczęstszym błędem podczas intubacji jest przypadkowe wprowadzenie rurki do przełyku, który znajduje się bezpośrednio pod przejściem krtani, gdy zwierzę leży na plecach. Należy pamiętać, że rurki nie wolno wprowadzać bez uprzedniej wyraźnej identyfikacji chrząstek przynadgardzinnych i strun głosowych.

Cewnikowanie pęcherza moczowego przez cewkę moczową jest łatwe do przeprowadzenia u loch, natomiast procedura ta jest niezwykle trudna, a być może nawet niemożliwa, u samców⁶. Należy zwrócić uwagę, że ponieważ ujście cewki moczowej u samicy znajduje się przed pochwą, większy otwór pochwy może zostać błędnie ocewnikowany. W badaniach przeżywalności zaleca się stosowanie sterylnego i dezynfekującego środka nawilżającego. Ponadto środek nawilżający z działaniem znieczulającym miejscowo może ułatwić procedurę cewnikowania.

Podczas cewnikowania tętnicy i żyły udowej wybór cewników naczyniowych oraz sposób ich mocowania różnią się w zależności od tego, czy prowadzone są badania z przeżyciem, czy bez przeżycia, zwłaszcza gdy cewniki są implantowane na dłuższy czas⁶. Przykładowo, cewniki do implantacji przewlekłej powinny być wysoko biokompatybilne, posiadać kuleczki lub mankiety retencyjne służące do stabilizacji oraz nie mogą z czasem urazzać ściany naczynia, co zapobiega indukowaniu zakrzepicy lub erozji⁶.

W niniejszym filmie wykorzystujemy zamknięty system zasilany sprężonym powietrzem do perfuzji transkardialnej. Inną opcją jest zastosowanie systemu napędzanego grawitacyjnie. Przewagą systemów grawitacyjnych w porównaniu do systemów wykorzystujących sprężone powietrze jest ich prostota, wydajność oraz brak ryzyka przedostania się sprężonego powietrza do układu naczyniowego. Jednakże ciśnienie hydrostatyczne generowane przez systemy grawitacyjne zmienia się stale podczas perfuzji, co może wpływać na wyniki histologiczne¹⁵. W zależności od rodzaju planowanych badań histopatologicznych, korzystne może być uprzednie przeprowadzenie perfuzji zwierzęcia roztworem soli fizjologicznej z dodatkiem heparyny. Ma to szczególne znaczenie przy wykonywaniu barwienia immunofluorescencyjnego, aby uniknąć problemów z autofluorescencją wywoływaną przez erytrocyty. Ponadto, jeśli analizowanym organem jest mózg, można zacisnąć zstępującą aortę w celu oszczędności utrwalacza. Jednak w przypadku świń krok ten wiąże się z dodatkową dyssekcją i wydłuża procedurę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Intubacja
Respirator	GE Healthcare	1009-9002-000
Odsysanie końcówką tępą	Unomedical	34091181
Laryngoskop	Miller	85-0045 (Zestaw laryngoskopowy)
Rurka endotrachealna o średnicy wewnętrznej 5,5 mm	Smiths Medical	100/199/055
Kaniula prowadząca	Hudson RCI	5-151001
Strzykawka 5 ml
Stetoskop	Martin	17-262-00
Cewnikowanie pęcherza moczowego
Cewnik Foleya AquaFlate z gliceryny i silikonu, 8-French z prowadnikiem	Rüsch	178003
Wziernik nosowy	Martin	36-859-50
Spekulum odbytnicze	Martin	30-613-15
Pinceta z tępymi końcówkami	Martin	13-374-16
Żel poślizgowy do cewników
Cathejell z lidokainą	Montavit	CJL08501
Instillagel Comb.	Falcon BD	08-40-200
Worek do drenażu moczu A4	Unomedical	38 155 1S
Taśma klejąca
Kaniulacja tętnicy i żyły udowej
Skalpel	Martin	10-295-11
Nożyczki chirurgiczne z tępymi końcami	Martin	11-881-18
Pinceta chirurgiczna	Martin	12-100-14
Małe chirurgiczne pęsety z tępym końcem	Martin	13-375-13
Mały rozwieracz tkanek samopodtrzymujący się	Martin	15-753-13
Igłotrzymacz	Martin	20-634-14
Wymazy chirurgiczne
Szycie z igłą
Sól fizjologiczna
Heparyna	Leo Laboratories	585679
kaniula do infuzji typu Venflon 18G	BD Biosciences	393206
Osłonki do końcówek typu brite o rozmiarze 4 French z wprowadzaczem i drutem prowadzącym Seldingera	Cordis	154-2629-1/0017
Perfuzja transkardiakalna
System perfuzji ciśnieniowej	Własnej produkcji
System odciągu oparów	Gram A/S	01750000 oraz 0303700
Perfusat 5 L
Nożyczki chirurgiczne z tępymi końcami	Martin	11-881-18
Kleszcze do kości	F.S.T.	16150-24
Kleszczyki samopodtrzymujące z dużym zakrzywionym końcem	Martin	13-421-18
Samopodtrzymujący się retraktor mostka	Rudolf Medical	7520-10
Pentobarbital	Królewski Uniwersytet Weterynaryjny i Rolniczy (KVL)	200 mg/ml
wenflon 22G	BD Biosciences	393202