Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową metodę hydrolizy enzymatycznej, która wykorzystuje czytnik mikropłytek do pomiaru i klasyfikacji fosforu glebowego jako monoestrów P, diestrów P i nieorganicznych P. W standardowym laboratorium można jednocześnie zmierzyć do 96 próbek.

Streszczenie

Wiele rodzajów organicznych cząsteczek fosforu (P) istnieje w próbkach środowiskowych¹. Tradycyjne pomiary P nie wykrywają tych organicznych związków P, ponieważ nie reagują one z odczynnikami kolorymetrycznymi^2,3. Hydroliza enzymatyczna (EH) jest nową metodą dokładnego charakteryzowania organicznych form P w próbkach środowiskowych^4,5. Metoda ta jest przewyższana dokładnością tylko przez spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego Phosphorus-31 (³¹P-NMR) - metodę, która jest droga i wymaga specjalistycznego szkolenia technicznego⁶. Dostosowaliśmy metodę hydrolizy enzymatycznej umożliwiającą pomiar trzech klas fosforu (monoester P, diester P i nieorganiczny P) do systemu czytnika mikropłytek⁷. Metoda ta zapewnia naukowcom szybki, dokładny, niedrogi i przyjazny dla użytkownika sposób pomiaru gatunków P w glebie, osadach, oborniku i, jeśli są skoncentrowane, w próbkach wodnych. Jest to jedyna wysokoprzepustowa metoda pomiaru form i labilności enzymatycznej organicznego P, którą można wykonać w standardowym laboratorium. Uzyskane dane dostarczają informacji naukowcom badającym zawartość składników odżywczych w systemie i potencjał eutrofizacji.

Protokół

1. Ekstrakcja fosforu

1. Przygotować 1 l roztworu 0,25 M wodorotlenku sodu (NaOH, 40,00 g/mol) + 0,05 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 292,24 g/mol).
2. Dodać 30 ml roztworu NaOH + EDTA do 2 g mokrej lub wysuszonej gleby/próbki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
3. Inkubować z mieszaniem przez 16 godzin w temperaturze pokojowej.
4. Wirować 3000 xg przez 3 minuty.

2. Dostosowanie pH ekstraktu próbki

1. Przenieść podwielokrotność o pojemności 0,1 ml do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 0,017 ml 2,5 M kwasu octowego, 0,144 ml 0,4 M buforu octanowego (70,5% octanu sodu [CH₃COONa, 82,03 g/mol] i 29,5% kwasu octowego, pH 5,0), i 0,739 ml wody dejonizowanej.
3. Ostateczna objętość dostosowanego ekstraktu wyniesie 1 ml, a końcowe pH wyniesie 5,0.

3. Przygotowanie roztworu podstawowego enzymu

1. Przygotować 1 l 0,1 M roztworu octanu sodu (_CH3COONa, 82,03 g/mol) o pH 5,0.
2. Przygotować 2 x 10 ml roztworów podstawowych fosfatazy kwasowej w buforze octanu sodu przygotowanym w kroku 3.1 tak, aby końcowe stężenia wynosiły po 0,5 jednostki/ml.
   Fosfataza kwasowa typu I z Triticum aestivum (kiełki pszenicy; GP, ogólnie 0,5 U mg-1 ciało stałe, EC 3.1.3.2)
   Fosfataza kwasowa typu IV-S z Solanum tuberosum (ziemniak; PP, ogólnie 4,6 U mg-1 ciało stałe, EC 3.1.3.2)
   * Jednostki aktywności są określone przez dostawcę, gdzie 1 jednostka jest zdefiniowana jako uwolnienie 1 mikromola ortofosforanu do roztworu na godzinę w temperaturze 37°C.
3. Rozpuść liofilizowaną nukleazę P1 (EC 3.1.30.1) z Penicillium citrinum (grzyby; NP1, zwykle 500 U ^mg-1 w stanie stałym) w jednym ml dejonizowanego woda - można ją teraz przechowywać w temperaturze 4°C do wykorzystania w przyszłości.
4. Odpipetować NP1 do jednej z 10 ml probówek przygotowanych w kroku 3.2 tak, aby końcowe stężenie wynosiło 2,5 jednostki/ml NP1; delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając.
5. Odwirować dwa 10 ml roztworów enzymatycznych o stężeniu 3000 xg przez 30 minut.

4. Krzywa kalibracji P i kontrole

1. Przygotować 1 l 1 mM roztworu podstawowego fosforanu potasu (K2HPO4, 174,18 g/mol).
2. Dodać 1 ml 1 ml roztworu podstawowego fosforanu potasu o stężeniu 1 ml do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wykonać siedem seryjnych rozcieńczeń po 0,5 ml.
3. Wyrzuć pierwszą probówkę, aby uzyskać 7 rozcieńczeń w zakresie od 20 nmol-0,625 nmol P.
4. Przenieść 80 μl z każdej probówki w dwóch odstępach do rzędów B - H standardowej płytki 96-dołkowej.
5. Dodać 80 μl buforu octanu sodu (sekcja 3.1) do wiersza A kolumn 11 i 12 - jest to 0 nmol P punkt kalibracji.
6. Każda kolumna 11 i 12 zawiera teraz 8 próbek referencyjnych o stężeniu od 0 nmol do 20 nmol fosforanu nieorganicznego.
7. Kolumna 10 będzie zawierać następujące kontrole:
   1. Dodać 40 μl roztworu enzymatycznego PP+GP + 40 μl buforu octanu sodu (sekcja 3.1) do pierwszych trzech studzienek w kolumnie 10.
   2. Dodać 40 μl roztworu enzymatycznego PP+GP+NP1 + 40 μl buforu octanu sodu do następnych trzech dołków.
   3. Dodać 40 μl roztworu octanu sodu zawierającego 10 nmol fosforanu glukozy-6 (C_{, 6}, H_{, 11}, Na_{, 2}, O_{, 9}P • xH₂O, 304,1 g/mol) + 40 μL roztworu enzymu PP+GP do jednego dołka i do dołka końcowego w kolumnie 10 dodać octan sodu roztwór zamiast roztworu enzymu.

5. Próbka + inkubacja enzymów

1. Każda badana próbka zajmie pierwsze 9 dołków w 1 rzędzie standardowej 96-dołkowej płytki.
2. Rozprowadzić 40 μl ekstraktów próbek o dostosowanym pH z sekcji 2 do studzienek 1-9 w maksymalnie 8 rzędach.
3. Po rozprowadzeniu wszystkich próbek* za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić roztwór enzymu PP+GP do kolumn 1-3, PP+GP+NP1 do kolumn 4-6 i bufor octanu sodu (przygotowany w sekcji 3.1) do kolumn 7-9.
   *Ten krok musi być wykonany szybko, aby zapewnić wszystkim próbkom równoważny czas inkubacji.
4. Przykryj 96-dołkową płytkę pokrywką i inkubuj próbki + roztwory enzymatyczne, kontrole i krzywą kalibracyjną dokładnie przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

6. Pomiar kolorymetryczny uwolnionych i tła nieorganicznych P

1. Przygotować 50 ml każdego z następujących roztworów w wodzie dejonizowanej:
   Roztwór A*: 0,1 M kwas askorbinowy (C6H8O6, 176,12 g/mol) + 0,5M kwas trichlorooctowy (Cl3CCOOH, 163,39 g/mol)
   Roztwór B: 0,01 M molibdenian amonu ((NH4)2MoO4, 196,01 g/mol)
   Roztwór C: 0,1 M cytrynian sodu (HOC(COONa)(CH2COONa)2 2H2O, 294,10 g/mol) + 0,2 M arsenian sodu (NaAsO2, 129,91 g/mol) + 5 % lodowaty kwas octowy
   (CH3CO2H, 60,05 g/mol) * Roztwór A należy przygotowywać codziennie.
2. Dodać 25 μl roztworu SDS, 100 μl roztworu A, 20 μl roztworu B i 50 μl roztworu C do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej. Zrób to szybko za pomocą pipety wielokanałowej.
3. Przykryj płytkę i inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 850 nm w dowolnym przestrajalnym czytniku mikropłytek.

7. Klasyfikacja związków P

1. Importuj surowe dane do aplikacji arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel).
2. Wykreślić krzywą kalibracyjną fosforu nieorganicznego: od 0 do 40 nmol P na osi x i średnią z podwójnych pomiarów absorbancji na osi y.
3. Wykonaj regresję liniową i znajdź równanie linii najlepszego dopasowania.
4. Kolumny 1-3: Bezpośrednio zastosuj krzywą kalibracyjną - to jest nieorganiczne P tła.
5. Kolumny 4-6: Średnie wartości próbki trzykrotnie i odejmij kontrole (roztwór enzymu + tło nieorganiczne P) od absorbancji brutto - jest to P pochodząca z hydrolizowalne monoestry P.
6. Kolumny 7-9: Takie same jak 7.5, z wyjątkiem odjęcia wartości absorbancji z kolumn 4-6 - to jest P od hydrolizowalnych diestrów P.
7. Przelicz dane absorbancji na nmol P uwolnione, stosując równanie kalibracyjne.
8. Uwolniony nmol P można odnieść z powrotem do mg P/kg pierwotnej gleby. Alternatywnie, ocena proporcji każdej klasy P może być również użytecznym podejściem do analizy danych.

8. Reprezentatywne wyniki:

Szybkie oględziny płytki 96-dołkowej po chemii kolorymetrycznej dostarczy wskazówek, czy procedura była czy nie wykonane poprawnie. Pierwszą rzeczą do sprawdzenia jest poziom cieczy w każdej studzience poprzez zeskanowanie bocznego profilu płytki. Powinno być dokładnie 275 μl odczynników we wszystkich studzienkach. Następnie sprawdź wzrokowo kolor trzech dołków na próbki i zduplikowanych dołków kalibracyjnych. Te techniczne repliki powinien być w tym samym odcieniu niebieskiego. Następnie zastosuj krzywą kalibracyjną do dwóch studzienek zawierających fosforan glukozy-6 i sprawdź, czy uwolniły wszystkie 10 nmol nieorganicznego P. Po zmierzeniu całkowitej ilości wyekstrahowanego P za pomocą ICP-OES lub metody alternatywnej, należy upewnić się, że całkowite wartości P obliczone przy użyciu tego protokół nie przekracza ilości P, która została wyodrębniona.
Uwaga: Staranne zarządzanie danymi w arkuszu kalkulacyjnym pomoże uchronić się przed błędami ilościowymi. Będziesz miał do czynienia z wieloma liczbami na raz, więc stworzenie szablonu będzie dobrze spędzonym czasem.

Rysunek 1. Płytka 96-dołkowa przedstawiająca wyniki dla 8 próbek (rzędy A-H) i krzywą kalibracyjną (kolumny 11 i 12). Elementy sterujące znajdują się w kolumnie 10. Wzrost intensywności koloru między kolumnami 1-3 i 4-6 jest spowodowany hydrolizowanymi związkami monoestru P, między kolumnami 4-6 i 7-9 jest spowodowany hydrolizowanym diestrem Związki P.

Rysunek 2. Rozkład klas P w 0,25 M ekstrakcie NaOH-0,05 M EDTA próbki gleby Vermont przy użyciu wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe, n = 3.

Dyskusja

Ze względu na swój charakter szybka metoda wykorzystująca małe objętości wymaga dużej staranności. Dlatego najbardziej krytycznymi etapami są te polegające na pipetowaniu roztworów na płytkę. Dokładna i, co najważniejsze, spójna technika pipetowania ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego testu.

Ekstrakcja NaOH-EDTA pozwoli na scharakteryzowanie większości P w wielu próbkach w trzech klasach: ortofosforanu, monoestru P i diestru P. Można scharakteryzować glebę, obornik, osady lub inne próbki środowiskowe, które zawierają P ekstrahowalne NaOH-EDTA. Formy P w próbkach środowiskowych niekoniecznie są stabilne, a ta technika zapewni scharakteryzowanie próbek, zanim próbki zostaną naruszone, bez konieczności zatrudniania armii badaczy.

Test ten jest szczególnie przydatny, gdy ma zostać przetworzona duża liczba próbek. Zapotrzebowanie na odczynniki i wymagania przestrzenne zostały zmniejszone do możliwego do opanowania poziomu (np. probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zamiast szklanych kolb o pojemności 50 ml). Adaptacja ta ogranicza również produkcję odpadów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS Lodowaty
kwas octowy	Sigma-Aldrich	242853
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889
Fosfataza kwasu pszennego	Sigma-Aldrich	P3627
Fosfataza kwasu ziemniaczanego	Sigma-Aldrich	P1146
Nukleaza P1	Sigma-Aldrich	N8630
Fosforan potasu	Sigma-Aldrich	P2222
Fosforan glukozy-6	Sigma-Aldrich	G7250
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A5960
TCA	Sigma-Aldrich	T9159
Molibdenian amonu	Sigma-Aldrich	A1343
Cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	S1804
Arsenian sodu	Sigma-Aldrich	S9663