Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę hydrolizy enzymatycznej, w której wykorzystuje się czytnik mikropłytek do pomiaru i klasyfikacji fosforu glebowego jako monoestrów P, diestrów P oraz fosforu nieorganicznego. W standardowych warunkach laboratoryjnych jednorazowo można zmierzyć do 96 próbek.

Streszczenie

W próbkach środowiskowych występuje wiele rodzajów organicznych cząsteczek fosforu (P)¹. Tradycyjne pomiary P nie wykrywają tych organicznych związków fosforu, ponieważ nie reagują one z odczynnikami kolorymetrycznymi^2,3. Hydroliza enzymatyczna (EH) jest nową metodą dokładnej charakterystyki form organicznego P w próbkach środowiskowych^4,5. Metoda ta ustępuje dokładnością jedynie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu-31 (³¹P-NMR) – metodzie kosztownej i wymagającej specjalistycznego przeszkolenia technicznego⁶. Zaadaptowaliśmy metodę hydrolizy enzymatycznej umożliwiającą pomiar trzech klas fosforu (P monoestrowego, P diestrowego i P nieorganicznego) do systemu czytnika mikropłytek⁷. Metoda ta zapewnia badaczom szybki, dokładny, niedrogi i łatwy w obsłudze sposób pomiaru form P w glebach, osadach, nawozach organicznych oraz, po zagęszczeniu, w próbkach wodnych. Jest to jedyna wysokoprzepustowa metoda pomiaru form i podatności enzymatycznej organicznego P, którą można przeprowadzić w standardowym laboratorium. Uzyskane dane dostarczają cennych informacji naukowcom badającym zawartość składników odżywczych w systemie oraz potencjał eutrofizacji.

Protokół

1. Ekstrakcja fosforu

1. Przygotować 1 L roztworu 0,25 M wodorotlenku sodu (NaOH, 40,00 g/mol) + 0,05 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 292,24 g/mol).
2. Do 2 g wilgotnej lub wysuszonej gleby/próbki w probówce stożkowej o pojemności 50 mL dodać 30 mL roztworu NaOH + EDTA.
3. Inkubować z wytrząsaniem przez 16 h w temperaturze pokojowej.
4. Wirować z prędkością 3000 ×g przez 3 minuty.

2. Regulacja pH ekstraktu z próbki

1. Przenieś 0,1 mL aliquotu do probówki do mikrocentryfugówki o pojemności 1,5 mL.
2. Dodaj 0,017 mL kwasu octowego 2,5 M, 0,144 mL buforu octanowego 0,4 M (70,5% octanu sodu [CH₃COONa, 82,03 g/mol] i 29,5% kwasu octowego, pH 5,0) oraz 0,739 mL wody dejonizowanej.
3. Końcowa objętość skorygowanego ekstraktu wyniesie 1 mL, a końcowe pH będzie wynosić 5,0.

3. Przygotowanie roztworu zapasowego enzymu

1. Przygotować 1 L 0,1 M roztworu octanu sodu (CH₃COONa, 82,03 g/mol) o pH 5,0.
2. Przygotować 2 x 10 mL roztworów stokowych fosfatazy kwaśnej w buforze octanowym sodu przygotowanym w kroku 3.1, tak aby stężenia końcowe wynosiły odpowiednio 0,5 Units/mL.
   Fosfataza kwaśna typu I z Triticum aestivum (zarodki pszenicy; GP, zazwyczaj 0,5 U mg-1 w postaci stałej, EC 3.1.3.2)
   Fosfataza kwaśna typu IV-S z Solanum tuberosum (ziemniak; PP, zazwyczaj 4,6 U mg-1 w postaci stałej, EC 3.1.3.2)
   * Jednostki aktywności są określane przez dostawcę, gdzie 1 Unit definiuje się jako uwolnienie 1 mikromola ortofosforanu do roztworu na godzinę w temperaturze 37°C.
3. Zrekonstytuować liofilizowaną nukleazę P1 (EC 3.1.30.1) z Penicillium citrinum (grzyb; NP1, zazwyczaj 500 U mg^-1 w postaci stałej) w jednym mL wody dejonizowanej – można ją teraz przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszego użycia.
4. Pipetować NP1 do jednej z probówek 10 mL przygotowanych w kroku 3.2, tak aby stężenie końcowe wynosiło 2,5 Units/mL NP1; delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
5. Wirować oba 10 mL roztwory enzymów przy 3000 xg przez 30 minut.

4. Krzywa kalibracyjna i kontrole P

1. Przygotować 1 L 1 mM roztworu zapasu fosforanu potasu (K2HPO4, 174,18 g/mol).
2. Do probówki wirówki o pojemności 1,5 mL dodać 1 mL 1 mM roztworu zapasu fosforanu potasu i wykonać siedem seryjnych rozcieńczeń po 0,5 mL.
3. Odrzucić pierwszą probówkę, aby uzyskać 7 rozcieńczeń w zakresie od 20 nmol do 0,625 nmol P.
4. Przenieść po 80 μL z każdej probówki w dwóch powtórzeniach do rzędów B – H standardowej płytki 96-dołkowej.
5. Do rzędu A w kolumnach 11 i 12 dodać 80 μL buforu octanu sodu (sekcja 3.1) – jest to punkt kalibracyjny 0 nmol P.
6. Każda z kolumn 11 i 12 zawiera teraz 8 próbek referencyjnych od 0 nmol do 20 nmol fosforanu nieorganicznego.
7. Kolumna 10 będzie zawierać następujące kontrole:
   1. Do pierwszych trzech dołków w kolumnie 10 dodać 40 μL roztworu enzymów PP+GP + 40 μL buforu octanu sodu (sekcja 3.1).
   2. Do kolejnych trzech dołków dodać 40 μL roztworu enzymów PP+GP+NP1 + 40 μL buforu octanu sodu.
   3. Do jednego dołka dodać 40 μL roztworu octanu sodu zawierającego 10 nmol glukozo-6-fosforanu (C₆H₁₁Na₂O₉P • xH₂O, 304,1 g/mol) + 40 μL roztworu enzymów PP+GP, a do ostatniego dołka w kolumnie 10 dodać roztwór octanu sodu zamiast roztworu enzymów.

5. Inkubacja próbki z enzymem

1. Każda badana próbka zajmie pierwsze 9 studzienek w jednym rzędzie standardowej płytki 96-dołkowej.
2. Należy rozdzielić 40 μL ekstraktów z próbek z skorygowanym pH z sekcji 2 do studzienek 1-9 w maksymalnie 8 rzędach.
3. Po rozdzieleniu wszystkich próbek* należy za pomocą pipety wielokanałowej nanieść roztwór enzymu PP+GP do kolumn 1-3, PP+GP+NP1 do kolumn 4-6 oraz bufor octanu sodu (przygotowany w sekcji 3.1) do kolumn 7-9.
   *Krok ten musi być wykonany szybko, aby zapewnić wszystkim próbkom równy czas inkubacji.
4. Należy przykryć płytkę 96-dołkową pokrywką i inkubować próbki z roztworami enzymów, kontrole oraz krzywą kalibracyjną dokładnie przez 1 hr w temperaturze 37°C.

6. Kolorymetryczny pomiar uwalnianego i tła nieorganicznego P

1. Przygotować po 50 mL z każdego z poniższych roztworów w wodzie dejonizowanej:
   Roztwór A*: 0,1 M kwasu askorbinowego (C6H8O6, 176,12 g/mol) + 0,5 M kwasu trichlorooctowego (Cl3CCOOH, 163,39 g/mol)
   Roztwór B: 0,01 M molibdenianu amonu ((NH4)2MoO4, 196,01 g/mol)
   Roztwór C: 0,1 M cytrynianu sodu (HOC(COONa)(CH2COONa)2 2H2O, 294,10 g/mol) + 0,2 M arsenianu sodu (NaAsO2, 129,91 g/mol) + 5 % lodowatego kwasu octowego
   (CH3CO2H, 60,05 g/mol) * Roztwór A musi być przygotowywany codziennie.
2. Do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej dodać 25 μL roztworu SDS, 100 μL roztworu A, 20 μL roztworu B oraz 50 μL roztworu C. Należy zrobić to szybko, używając pipety wielokanałowej.
3. Przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zmierzyć absorbancję przy 850 nm w dowolnym mikroczytniku płytek z możliwością regulacji długości fali.

7. Klasyfikacja związków P

1. Zaimportuj surowe dane do aplikacji arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel).
2. Wykreśl krzywą kalibracyjną dla fosforu nieorganicznego: od 0 do 40 nmol P na osi x oraz średnią z powtórzonych pomiarów absorbancji na osi y.
3. Przeprowadź regresję liniową i wyznacz równanie linii trendu.
4. Kolumny 1-3: Zastosuj bezpośrednio krzywą kalibracyjną – jest to tło fosforu nieorganicznego.
5. Kolumny 4-6: Wyznacz średnią z wartości próbek w trzech powtórzeniach i odejmij od całkowitej absorbancji wartości kontrolne (roztwór enzymu + tło fosforu nieorganicznego) – jest to P pochodzący z hydrolizowalnych monoestrów P.
6. Kolumny 7-9: Postępuj tak samo jak w punkcie 7.5, z wyjątkiem odjęcia wartości absorbancji z kolumn 4-6 – jest to P pochodzący z hydrolizowalnych diestrów P.
7. Przelicz dane absorbancji na nmol uwolnionego P, stosując równanie kalibracyjne.
8. Ilość uwolnionego nmol P można odnieść do mg P/kg pierwotnej gleby. Alternatywnie, przydatnym podejściem do analizy danych może być ocena proporcji każdej klasy P.

8. Reprezentatywne wyniki:

Szybka kontrola wizualna płytki 96-dołkowej po przeprowadzeniu reakcji kolorymetrycznych pozwoli stwierdzić, czy procedura została wykonana prawidłowo. W pierwszej kolejności należy sprawdzić poziom cieczy w każdym dołku, obserwując profil boczny płytki. We wszystkich dołkach powinno znajdować się dokładnie 275 μL odczynników. Następnie należy wizualnie ocenić kolor dołków z próbkami w trzech powtórzeniach oraz dołków kalibracyjnych w dwóch powtórzeniach. Te powtórzenia techniczne powinny mieć ten sam odcień niebieskiego. Kolejno należy zastosować krzywą kalibracyjną do dwóch dołków zawierających glukozo-6-fosforan i zweryfikować, czy uwolniono wszystkie 10 nmol nieorganicznego P. Po zmierzeniu całkowitego wyekstrahowanego P za pomocą ICP-OES lub alternatywnej metody, należy upewnić się, że wartości całkowitego P obliczone zgodnie z tym protokołem nie przekraczają ilości wyekstrahowanego P.
Uwaga: Staradne zarządzanie danymi w arkuszu kalkulacyjnym pomoże uniknąć błędów ilościowych. Będą Państwo operować dużą liczbą danych jednocześnie, dlatego stworzenie szablonu będzie wartościowym wykorzystaniem czasu.

Rysunek 1. Płytka 96-dołkowa przedstawiająca wyniki dla 8 próbek (wiersze A-H) oraz krzywą kalibracyjną (kolumny 11 i 12). Kontrole znajdują się w kolumnie 10. Wzrost intensywności koloru między kolumnami 1-3 a 4-6 wynika z obecności zhydrolizowanych związków P monoestrowych, a między kolumnami 4-6 a 7-9 z zhydrolizowanych związków P diesterowych.

Rysunek 2. Rozkład klas P w ekstrakcie z próbki gleby z Vermont otrzymanym przy użyciu 0,25 M NaOH-0,05 M EDTA z wykorzystaniem wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, n = 3.

Dyskusja

Z natury szybka metoda wykorzystująca małe objętości wymaga ogromnej staranności. Dlatego najbardziej krytyczne są etapy związane z pipetowaniem roztworów na płytkę. Precyzyjna, a przede wszystkim spójna technika pipetowania jest niezbędna dla powodzenia tego testu.

Ekstrakcja NaOH-EDTA pozwoli na podzielenie większości fosforu (P) w wielu próbkach na trzy klasy: ortofosforany, monoestry P i diestry P. Metoda ta może być zastosowana do gleb, nawozów organicznych, osadów lub jakichkolwiek innych próbek środowiskowych zawierających P wyekstrahowalny za pomocą NaOH-EDTA. Formy P w próbkach środowiskowych niekoniecznie są stabilne, a technika ta zapewni ich charakterystykę przed ewentualną degradacją próbek, bez konieczności angażowania licznych zespołów badawczych.

Analiza ta jest szczególnie odpowiednia w przypadku konieczności przetworzenia dużej liczby próbek. Zapotrzebowanie na odczynniki oraz wymagania przestrzenne zostały zredukowane do poziomu łatwiejszego w obsłudze (np. probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL zamiast szklanych kolb o pojemności 50 mL). Adaptacja ta ogranicza również powstawanie odpadów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
lodowaty kwas octowy	Sigma-Aldrich	242853
octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889
fosfataza kwaśna z pszenicy	Sigma-Aldrich	P3627
fosfataza kwaśna z ziemniaka	Sigma-Aldrich	P1146
nukleaza P1	Sigma-Aldrich	N8630
fosforan potasu	Sigma-Aldrich	P2222
glukozo-6-fosforan	Sigma-Aldrich	G7250
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A5960
TCA	Sigma-Aldrich	T9159
molibdan amonu	Sigma-Aldrich	A1343
cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	S1804
arsenian sodu	Sigma-Aldrich	S9663