Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK

27.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2668

⸱

14 marca 2011

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, Rush University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Testy cytotoksyczności służące do pomiaru odpowiedzi litycznej komórek natural killer na komórki zakażone HIV są ograniczone przez czystość komórek docelowych. Prezentujemy tutaj izolację wysoce oczyszczonej populacji zakażonych HIV-1 pierwotnych blastów limfocytów T, wykorzystując zdolność HIV-1 do down-modulacji CD4.

Streszczenie

Komórki natural killer (NK) stanowią kluczowy element wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom zainfekowanym wirusami. Zrozumienie zdolności komórek NK do rozpoznawania i lizowania komórek zainfekowanych HIV-1 jest istotne, ponieważ zidentyfikowanie wszelkich nieprawidłowości w funkcji komórek NK wobec komórek zainfekowanych HIV mogłoby potencjalnie doprowadzić do opracowania terapii zwiększających ich aktywność cytolityczną. W testach cytotoksyczności konieczne jest zastosowanie zainfekowanych HIV pierwotnych blastów limfocytów T jako komórek docelowych, zamiast zainfekowanych linii komórkowych limfocytów T. Linie limfocytów T, nawet bez infekcji, są dość podatne na lizę przez komórki NK. Ponadto niezbędne jest użycie autologicznych komórek pierwotnych, aby zapobiec niezgodności głównego kompleksu histocompatybilności klasy I między komórką docelową a efektorową, co skutkowałoby lizą. Wczesne badania oceniające odpowiedzi cytolityczne komórek NK na pierwotne komórki zainfekowane HIV nie wykazały istotnego niszczenia zainfekowanych komórek 1,2. Jednakże wykorzystanie zainfekowanych HIV-1 pierwotnych limfocytów T jako komórek docelowych w testach funkcjonalnych komórek NK było utrudnione ze względu na obecność zanieczyszczających niezinfekowanych komórek 3. Taki niespójny stosunek komórek zainfekowanych do niezinfekowanych prowadzi do zmienności w niszczeniu przez komórki NK między próbkami, co może nie wynikać ze zmienności funkcji komórek NK dawcy. W związku z tym korzystne byłoby zastosowanie oczyszczonej populacji komórek zainfekowanych w celu standaryzacji stosunku komórek efektorowych do docelowych pomiędzy eksperymentami 3,4. W niniejszej pracy demonstrujemy izolację wysoce oczyszczonej populacji komórek zainfekowanych HIV-1, wykorzystując zdolność HIV-1 do modulacji w dół CD4 na zainfekowanych komórkach oraz dostępność komercyjnych zestawów do usuwania komórek martwych lub obumierających 3-6. Oczyszczone zainfekowane pierwotne blasty limfocytów T mogą być następnie wykorzystane jako cele w teście degranulacji lub teście cytotoksyczności z oczyszczonymi komórkami NK jako populacją efektorową 5-7. Wykorzystanie komórek NK jako efektorów w teście degranulacji pozwala ocenić zdolność komórki NK do uwalniania treści litycznej ze specjalistycznych lizosomów 8, nazywanych „granulami cytolitycznymi”. Poprzez barwienie przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem przeciwko CD107a — białku błony lizosomalnej, które pojawia się na powierzchni komórki NK podczas łączenia się granul cytolitycznych z błoną plazmatyczną — możemy określić, jaki procent komórek NK ulega degranulacji w odpowiedzi na rozpoznanie komórki docelowej. Alternatywnie, aktywność lityczną komórek NK można ocenić w teście cytotoksyczności, który umożliwia wyznaczenie procentu komórek docelowych poddanych lizie poprzez uwalnianie 51Cr z wnętrza komórki docelowej w obecności komórek NK.

Protokół

1. Izolacja ludzkich limfocytów T CD4+ z krwi obwodowej (patrz Rycina 1)

  1. Krew obwodową z żyły (40 do 60 mLs) pobiera się do probówek Vacutainer zawierających heparynę sodową (Becton Dickenson).
  2. Następnie krew obwodową przenosi się z probówek Vacutainer do 50 mL polistyrenowych probówek stożkowych (20 mL krwi na probówkę).
  3. Odczynnik do izolacji limfocytów T CD4+ RosetteSep (StemCell Technologies) dodaje się w objętości 1 mL do nie więcej niż 20 mL krwi w probówce 50 ml i dokładnie miesza.
  4. Mieszaninę inkubuje się następnie w temperaturze 20-25°C przez 20 minut.
  5. Po 20 minutach do mieszanin dodaje się fosforanowy bufor solny pozbawiony wapnia i magnezu (CMF) [PBS (HyClone)] z 2% inaktywowaną ciepłem (56°C przez 30 minut) płodową surowicą bydlęcą [FBS (HyClone)] w celu uzyskania końcowej objętości 40 mL.
  6. Rozcieńczone mieszaniny (30 ml) nakłada się następnie na 15 mL medium do separacji limfocytów [LSM (Cellgro)] w nowych 50 mL polistyrenowych probówkach stożkowych.
  7. Probówki 50 mL wiruje się następnie przy 1200 x g przez 20 minut z wyłączonym hamulcem.
  8. Probówki 50 mL ostrożnie wyjmuje się z wirówki tak, aby nie naruszyć granicy faz między LSM a medium. Komórki znajdujące się na granicy faz zbiera się za pomocą pipety 10 mL i przenosi do nowych 50 mL polistyrenowych probówek stożkowych.
  9. Zebrane frakcje z granicy faz rozcieńcza się PBS z 2% FBS do końcowej objętości 50 mL.
  10. Probówki 50 mL zawierające rozcieńczone frakcje wiruje się przy 1200 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem.
  11. Po wirowaniu aspiruje się nadsącz, a osad resuspenduje w 10 mLs PBS z 2% FBS.
  12. Zawiesiny komórkowe łączy się następnie w jednej 50 mL probówce stożkowej i rozcieńcza do 50 mLs za pomocą PBS z 2% FBS.
  13. Probówkę zawierającą połączoną zawiesinę komórkową wiruje się przy 300 x g przez 10 minut, aby usunąć resztki LSM.
  14. Nadsącz aspiruje się, a osad resuspenduje w 10 mLs medium RPMI-1640 (HyClone) zawierającego 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 mcg/ml streptomycyny (HyClone) oraz 2 mM L-glutaminy (CellGro) (RPMI-complete), a następnie zlicza komórki za pomocą hemocytometru.
  15. Koncentrację oczyszczonych limfocytów T CD4+ dostosowuje się następnie do poziomu 3x106/mL za pomocą RPMI-complete.
  16. Limfocyty CD4+ stymuluje się, hodując je z przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 sprzężonymi z kuleczkami [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] w stosunku trzech kuleczek na komórkę przez 72 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% C02 i nawilżeniem.

2. Zakażanie limfocytów T CD4+ wirusem HIV-1 (patrz Rysunek 1)

  1. Zawiesinę komórkową zawierającą stymulowane limfocyty T CD4+ przenosi się z płytki hodowlanej i zlicza przy użyciu hemocytometru.
  2. komórki T CD4+ (~2x106) dodaje się do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu wykorzystania jako kontrolę niezakażoną.
  3. Pozostała część zawiesiny limfocytów T CD4+ zostaje przeniesiona do probówki stożkowej o objętości 50 ml w celu przeprowadzenia infekcji.
  4. Probówki zawierające zawiesiny limfocytów T CD4+ wiruje się przy 300 x g przez 10 minut, a następnie aspiruje się nadsącz z hodowli.
  5. Stymulowane limfocyty T CD4+ resuspensuje się bezpośrednio w płynach hodowlanych zawierających wiriony, a następnie poddaje wirusowej infekcji w wirowaniu (spin-infection) przy 1200 x g przez 2 godziny w temperaturze 20-25°C 9Zazwyczaj zakażamy limfocyty T CD4+ przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 5 w przypadku szczepu HIV z defektem replikacyjnym (np. DHIV-3) lub MOI wynoszącej 0,01 w przypadku wirusa zdolnego do replikacji (np. HIV-1)NL4/3). Objętość końcowa nie jest istotna, jednak probówki muszą być zrównoważone do wirowania. Polybrene (Santa Cruz) dodaje się do cieczy hodowlanej przed spinfekcją w końcowym stężeniu 10 mcg/ml.
  6. Po zakończeniu procedury spinfekcji usuwa się supernatanty, a komórki resuspenduje do gęstości 3x106/ml w pożywce RPMI-complete uzupełnionej o 100 J/ml IL-2. Zakażone i niezakażone komórki hoduje się przez 72 godziny w przypadku użycia wirusa niezdolnego do replikacji lub przez 5–7 dni w przypadku użycia wirusa zdolnego do replikacji. Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin w trakcie hodowli.

3. Izolacja ludzkich komórek Natural Killer z krwi obwodowej

  1. Krew obwodowa z żyły (~100 ml) jest pobierana od tego samego dawcy, u którego izolowano limfocyty T CD4+, do probówek Vacutainer zawierających heparynę sodową (Becton Dickenson).
  2. Krew jest następnie przenoszona z probówek Vacutainer do stożkowych probówek 50 mL w aliquotach po 20 mL.
  3. Probówki Vacutainer są następnie płukane 8 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa CMF [HBSS (Hyclone)], a płukanki są przenoszone do probówek stożkowych 50 mL zawierających 20 mL krwi obwodowej. Końcowa objętość w każdej probówce stożkowej 50 mL wynosi 35 mL.
  4. Rozcieńczoną krew warstwuje się na 15 mL LSM w nowej probówce stożkowej 50 mL, a następnie probówki wiruje przy 400 x g przez 30 minut z wyłączonym hamulcem.
  5. Probówki są ostrożnie wyjmowane z wirówki, a powstała granica między LSM a podłożem jest zbierana z każdej probówki za pomocą pipety 10 mL i przenoszona do nowych probówek stożkowych 50 mL.
  6. zawiesiny komórkowe są płukane raz za pomocą CMF HBSS (wirowanie przy 400 x g przez 15 minut z włączonym hamulcem).
  7. Po pierwszym płukaniu usuwa się nadosady, a powstałe osady łączy się w jednej probówce stożkowej 50 mL i płucze dwukrotnie CMF HBSS (wirowanie przy 30 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem), aby usunąć pozostałe LSM.
  8. Po ostatnim płukaniu osad resuspendsuje się w 10 mL buforu lizującego ACK (150 mM NH4Cl, 1,0 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA pH 7,3) i inkubuje w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez 5 min. Krok ten jest niezbędny do usunięcia erytrocytów zanieczyszczających mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC).
  9. Po 10 min. do zawiesiny komórkowej dodaje się 40 mL CMF PBS w celu zatrzymania reakcji lizy.
  10. Probówkę z zawiesiną komórkową zawierającą PBMC i lizowane erytrocyty wiruje się przy 300 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem.
  11. Nadosad jest usuwany, a osad resuspendsuje się w 5 mL PBS z 2% FBS i 2 mM EDTA, a następnie zlicza za pomocą hemocytometru.
  12. Komórki NK (natural killer) są następnie izolowane z PBMC przy użyciu zestawu do izolacji komórek NK [selekcja negatywna – człowiek (Miltenyi Biotec)] zgodnie z instrukcjami producenta.
  13. Przesącz z kolumn zbiera się do probówek 15 ml, a następnie wiruje przy 300 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem.
  14. Nadosady są usuwane, a osady resuspendsowane. Resuspendsowane osady łączy się w jednej probówce do całkowitej objętości 1 mL zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Iscove'a [IMDM (Gibco)] uzupełnionego o 10% inaktywowanej ciepłem (56°C przez 30 minut) ludzkiej surowicy (HS) AB+ i zlicza za pomocą hemacytometru.
  15. Objętość zawiesiny komórkowej dopasowuje się za pomocą IMDM z 10% HS tak, aby końcowa gęstość komórek NK wynosiła 3x106/mL. Zawiesinę komórkową dzieli się na pół. Jedna partia komórek NK otrzymuje 200 U/mL rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2. Druga partia komórek pozostaje w podłożu bez aplikacji cytokiny.
  16. Kultury komórek NK są następnie inkubowane przez noc w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2.
  17. Otrzymane komórki NK są następnie wykorzystywane jako komórki efektorowe w teście degranulacji CD107a lub teście uwalniania 51Cr.

4. Oczyszczanie komórek zakażonych HIV-1 (patrz Rysunek 1)

  1. Płyny hodowlane zawierające zainfekowane komórki są usuwane z płytek i wirowane przy 300 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem.
  2. Nadnadpław jest odsysany, a osady resuspenderowane w 2 mL PBS z 2% FBS i 2 mM EDTA, po czym wykonuje się zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
  3. Komórki zainfekowane, które nie zawierają HIV-1, są oddzielane od tych, które przenoszą wirusa, wykorzystując fakt, że HIV-1 powoduje obniżenie ekspresji CD4. W tym celu stosuje się zestaw CD4 Positive Isolation Kit (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem zastosowania stosunku jednego paciorka α-CD4 na jedną komórkę.
  4. Po usunięciu limfocytów T CD4+, martwe komórki są usuwane z oczyszczonej populacji komórek przenoszących wirusa przy użyciu zestawu Dead Cell Removal Kit (Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Frakcja przepływowa po usunięciu martwych komórek w kolumnach jest wirowana przy 300 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem. Nadnadpław jest usuwany, osady resuspenderowane w 1 mL RPMI-complete, a następnie wykonuje się zliczanie komórek.
  6. Oczyszczone zainfekowane komórki są teraz gotowe do użycia jako cele w teście degranulacji CD107a lub teście uwalniania 51Cr.

5. Test degranulacji CD107a (patrz Rycina 2)

  1. Kultury komórek NK są usuwane z płytek, a następnie wykonuje się zliczenie zawiesiny komórkowej.
  2. Suspensje komórek NK są wirowane przy 300 x g przez 10 minut przy włączonym hamulcu.
  3. Komórki NK resuspensuje się w pełnym medium RPMI i dostosowuje końcową stężenie do 106 komórek/ml
  4. Suspensje komórkowe z wyizolowanych zakażonych i niezakażonych limfocytów T, otrzymane w poprzednich krokach, odwiruje się przy 300 x g przez 10 minut przy włączonym hamulcu.
  5. Nadpłyny zostają usunięte, a osady resuspendowane w pełnym medium RPMI w stężeniu 2x106 komórek/ml
  6. Komórki K562 są wykorzystywane jako docelowe komórki kontrolne dodatnie, ponieważ wykazują wysoką podatność na lizę przez komórki NK. Komórki są wirowane przy 300 x g przez 10 minut z włączoną hamulcem wirówką, supernatanty są usuwane, a osady resuspendowane w pełnym medium RPMI w stężeniu 2x106 komórek/ml
  7. Do studzienek płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaje się 100 µL komórek docelowych oraz 100 µL efektorów.
  8. Do oceny nieswoistej degranulacji komórek NK wykorzystana zostanie studzienka zawierająca 100 $\mu$L efektorów i 100 $\mu$L pożywki bez komórek docelowych.
  9. Do każdej studzienki dodaje się 10 µl przeciwciała anty-CD107a sprzężonego z FITC (BDIS).
  10. Następnie płytkę wiruje się przy 20 x g przez 2 minuty przy włączonym hamulcu.
  11. OdwirCowaną płytkę inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37°C oraz 5% CO22.
  12. Po inkubacji płytkę wiruje się w wirówce z prędkością 400 x g przez 5 minut z włączonym hamulcem.
  13. Nadnadkład usuwa się z osadu.
  14. Następnie każdą studzienkę barwi się na lodzie przez 20 minut przy użyciu następującego panelu przeciwciał koniugowanych z fluorochromami w łącznej objętości 100 µL buforu do cytometrii przepływowej (PBS z 2% FBS i 0,1% NaN3).3)
    1. anty-CD3/14/20 [sprzężony z Pacific Blue (Biolegend)]
    2. anty-CD56 [APC(Biolegend)]
  15. Po 20-minutowej inkubacji do każdej studzienki dodaje się 200 μl buforu do cytometrii przepływowej, a następnie płytkę wiruje przy 400 x g przez 5 minut z włączonym hamulcem.
  16. Następnie z każdej dołki ostrożnie odsysa się bufor przepływowy za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml z założonym końcem do mikropipety 200 mcL, dbając o to, aby nie naruszyć osadu.
  17. Kroki 15 i 16 powtarza się raz jeszcze.
  18. Osady resuspendowano w 200 μl 1% paraformaldehydu w buforze CMF PBS. Następnie zawiesiny komórkowe przeniesiono do probówek do cytometrii przepływowej.
  19. Objętość całkowitą zwiększa się do 300 µL poprzez dodanie do każdej probówki około 100 µL 1% paraformaldehydu w PBS z CMF.
  20. Zdarzenia (2x104) odpowiadające komórkom NK, są zbierane za pomocą cytometru przepływowego przy użyciu systemu FACS DIVABDIS) oprogramowanie do akwizycji, a analiza została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Flow Jo(TreeStar).

6. Strategia bramkowania dla CD107a (patrz Rycina 3)

  1. Bramki dla pojedynczych komórek są tworzone na podstawie wykresu wysokości rozproszenia przedniego (FSC-H) względem szerokości rozproszenia przedniego (FSC-W).
  2. W celu analizy wielkości względem ziarnistości, na bramce dla pojedynczych komórek tworzony jest wykres rozproszenia przedniego (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC). Typowo limfocyty charakteryzują się stosunkowo niską ziarnistością i średnią wielkością komórek.
  3. Komórki z bramki limfocytów są następnie naniesione na wykres kropkowy komórek barwionych na CD3/14/20 względem komórek barwionych na CD56, aby wyodrębnić komórki NK, pomijając monocyty (CD14), limfocyty T (CD3) i limfocyty B (CD20).
  4. Populacja z bramki CD56pos jest następnie oceniana pod kątem ekspresji CD107a.
  5. Grupa komórek NK bez komórek docelowych służy do ustawienia bramek określających populację CD107a ujemną.

7. Test uwalniania 51Cr (patrz Rysunek 4)

  1. Zainfekowane komórki docelowe znakuje się 125 mcCi 51Cr (Perkin Elmer) w soli fizjologicznej w stosunku 106 komórek w całkowitej objętości 500 mcL przez 2 h w temperaturze 37°C i 5% CO2. Jako kontrolę pozytywną 106 komórek K562 znakuje się 100 mcCi 51Cr przez 2 h w całkowitej objętości 500 mcL w temperaturze 37°C i 5% CO2. Objętość uzupełnia się do 500 mcL za pomocą medium RPMI-complete. Objętość 51Cr dodawaną do komórek docelowych oblicza się tutaj: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
  2. Podczas znakowania komórek docelowych, wcześniej wyizolowane komórki NK usuwa się z hodowli i przelicza. Kultury komórkowe zawierające komórki NK wiruje się przy 300 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem.
  3. Osady zawierające komórki NK resuspendsuje się w medium RPMI-complete i rozdziela do 3 probówek. Gęstość komórek dostosowuje się do 105/mL w pierwszej probówce, 2,5x105/ml w drugiej probówce i 5x105/mL w trzeciej probówce.
  4. Znakowane komórki docelowe wyjmuje się z inkubatora i do każdej probówki dodaje 4,5 mL medium RPMI-complete. Następnie probówki wiruje się przy 300 x g przez 10 minut.
  5. Nadsącz odlewa się ostrożnie, aby nie zaburzyć osadu, do pojemnika na radioaktywne odpady płynne.
  6. Kroki 4 i 5 powtarza się jeszcze dwukrotnie, aby usunąć cały niezaabsorbowany 51Cr. Nadsącz z trzeciego przemycia można zutylizować w pojemniku na nieradioaktywne odpady płynne.
  7. Znakowane komórki docelowe resuspendsuje się następnie w medium RPMI-complete do końcowej gęstości komórek 105/mL.
  8. 100 mcL znakowanych komórek docelowych nanosi się do dołków płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, aby uzyskać końcową liczbę 104 komórek docelowych na dołek.
  9. Tabela 1 przedstawia przykład typowego układu dla testu uwalniania 51Cr. Każda grupa jest wykonywana w trzech powtórzeniach.
     123456789
    AK562 E:T (1:1)K562 E:T (1:1)K562 E:T (1:1)K562 E:T (2,5:1)K562 E:T (2,5:1)K562 E:T (2,5:1)K562 E:T (5:1)K562 E:T (5:1)K562 E:T (5:1)
    BUI E:T (1:1)UI E:T (1:1)UI E:T (1:1)UI E:T (2,5:1)UI E:T (2,5:1)UI E:T (2,5:1)UI E:T (5:1)UI E:T (5:1)UI E:T (5:1)
    CZakażone HIV-1 E:T (1:1)Zakażone HIV-1 E:T (1:1)Zakażone HIV-1 E:T (1:1)Zakażone HIV-1 E:T (2,5:1)Zakażone HIV-1 E:T (2,5:1)Zakażone HIV-1 E:T (2,5:1)Zakażone HIV-1 E:T (1:1)Zakażone HIV-1 E:T (1:1)Zakażone HIV-1 E:T (1:1)
    D         
    E         
    FSpontaniczne uwalnianie K562Spontaniczne uwalnianie K562Spontaniczne uwalnianie K562Spontaniczne uwalnianie UISpontaniczne uwalnianie UISpontaniczne uwalnianie UISpontaniczne uwalnianie zakażonych HIV-1Spontaniczne uwalnianie zakażonych HIV-1Spontaniczne uwalnianie zakażonych HIV-1
    GMaksymalne uwalnianie K562Maksymalne uwalnianie K562Maksymalne uwalnianie K562Maksymalne uwalnianie UIMaksymalne uwalnianie UIMaksymalne uwalnianie UIMaksymalne uwalnianie zakażonych HIV-1Maksymalne uwalnianie zakażonych HIV-1Maksymalne uwalnianie zakażonych HIV-1
  10. 100 mcL powyższych zawiesin komórek NK dodaje się do każdego dołka zawierającego komórki docelowe.
  11. 100 mcL komórek docelowych dodaje się do odpowiadających im dołków, w których brakuje komórek efektorowych, dla grup uwalniania maksymalnego i spontanicznego. Grupę uwalniania spontanicznego inkubuje się z dodatkowymi 100 mcL medium RPMI-complete.
  12. Płytkę 96-dołkową wiruje się przy 20 x g przez 2 minuty z włączonym hamulcem.
  13. Odwirowaną płytkę inkubuje się następnie w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 4 godziny.
  14. Po 4-godzinnej inkubacji do każdego dołka, z wyjątkiem dołków uwalniania maksymalnego, dodaje się 5 mcL rozcieńczenia 1:10 ludzkich erytrocytów w medium RPMI-complete.
  15. Do dołków uwalniania maksymalnego dodaje się 100 mcL 10% dodecylosiarczanu sodu.
  16. Płytkę wiruje się przy 400 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek.
  17. Z każdego dołka pobiera się 100 mcL nadsączu wolnego od komórek i przelewa do osobnych probótek do licznika gamma (Perkin Elmer). Probótki umieszcza się w automatycznym liczniku gamma 2470 (Perkin Elmer). Ilość 51Cr obecną w cieczy hodowlanej mierzy się jako liczbę zliczeń na minutę, wyciągając średnią z odczytu 2-minutowego.
  18. Odczyty liczby zliczeń na minutę (CPM) próbek i kontroli są wykorzystywane do obliczenia % specyficznej lizy za pomocą następującego równania:
    [(eksperymentalne CPM - średnie CPM spontaniczne) / (średnie CPM maksymalne - średnie CPM spontaniczne)] x 100

8. Reprezentatywne wyniki:

Schemat izolacji komórek i zakażania HIV; diagram przetwarzania PBMC, aktywacji limfocytów T CD4+ oraz spinfekcji.
Rycina 1. Etapy izolacji komórek natural killer oraz generowania zakażonych HIV-1 komórek docelowych z krwi obwodowej.

Schemat eksperymentu z komórkami NK: komórki NK traktowane i nietraktowane IL-2 z przeciwciałem anty-CD107a. Wyniki cytometrii przepływowej.
Rycina 2. Etapy konstrukcji testu degranulacji CD107a z wykorzystaniem komórek NK jako efektorów oraz komórek K562, niezakażonych limfocytów T CD4+ i limfocytów T zakażonych HIV-1 jako celów.

Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej; analiza markerów CD; proces bramkowania populacji komórek; znakowanie fluorescencyjne.
Rycina 3. Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej dla testu degranulacji CD107a. (A) Bramkowanie pojedynczych komórek i wykluczanie agregatów lub dubletów na wykresie FSC-A (pole rozproszenia przedniego) względem FSC-H (wysokość rozproszenia przedniego). (B) Bramka pojedynczych komórek przedstawiona jako FSC-A względem SSC (rozproszenie boczne) w celu wyznaczenia populacji limfocytów. (C) Bramka limfocytów przedstawiona jako CD3/14/20 (limfocyty T, monocyty, limfocyty B) względem CD56 (komórki NK) w celu wyznaczenia populacji CD56pos i CD3/14/20neg (bramka NK). (D) Bramka NK przedstawiona jako CD107a względem CD56 w celu wizualizacji komórek NK, które uległy degranulacji (CD107apos).

Schemat testu limfocytów T; test uwalniania 51Cr, interakcja komórek NK, płytka 96-dołkowa, analiza licznikiem gamma.
Rycina 4. Etapy konstrukcji testu uwalniania 51Cr z wykorzystaniem komórek NK jako efektorów oraz komórek K562, niezakażonych limfocytów T CD4+ i limfocytów T zakażonych HIV-1 jako celów.

Schemat testu uwalniania CD107a i 51Cr; wykresy cytometrii przepływowej i wykres słupkowy; analiza komórek odpornościowych.
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki oceny odpowiedzi cytotoksycznej komórek natural killer przeciwko komórkom zakażonym HIV-1. (A) Zdolność komórek NK do degranulacji oceniano bez obecności komórek docelowych oraz w odpowiedzi na komórki K562, pierwotne limfocyty T CD4+ i pierwotne limfocyty T zakażone HIV, mierząc odsetek komórek NK wykazujących ekspresję powierzchniowego białka CD107a. Liczby w każdym kwadracie reprezentują procent całkowitej liczby komórek NK. B) Zdolność komórek NK do lizy komórek K562, niezakazionych limfocytów T CD4+ oraz limfocytów T zakażonych HIV-1 oceniano w teście uwalniania 51Cr przy różnych stosunkach liczby komórek efektorowych do komórek docelowych (E:T).

Dyskusja

Przy prawidłowym wykonaniu testy opisane w niniejszym protokole powinny dostarczyć reprezentatywnego obrazu zdolności komórek NK do degranulacji i lizy komórek zakażonych HIV-1 (patrz Rycina 5). Degranulacja komórek NK w odpowiedzi na komórki zakażone HIV oraz lizy komórek zakażonych HIV przez komórki NK powinny być bezpośrednio proporcjonalne10. Wiarygodne wyniki dwóch funkcjonalnych testów komórek NK służących do pomiaru odpowiedzi cytotoksycznej na komórki zakażone HIV zależą od izolacji wysoko oczyszczonych komórek NK, jak i wysoko oczyszczonej populacji komórek zakażonych. Posiadanie oczyszczonych komórek NK i komórek zakażonych HIV-1 jest kluczowe dla uzyskania dość dokładnego stosunku komórek efektorowych do docelowych. Podobnie, usunięcie martwych i apoptotycznych komórek z populacji komórek docelowych jest istotne przed znakowaniem 51Cr lub inkubacją z komórkami efektorowymi. 51Cr może być internalizowany przez komórki przechodzące apoptozę, a obecność martwych lub apoptotycznych komórek podczas etapu znakowania izotopowego spowoduje wysokie uwalnianie spontaniczne i zniekształci obliczony % specyficznej lizy. Co więcej, obecność martwych lub apoptotycznych komórek może wyzwolić degranulację komórek NK, prowadząc do nienaturalnie wysokich poziomów ekspresji CD107a. Precyzyjne pipetowanie jest niezbędne podczas usuwania bezkomórkowych supernatantów po inkubacji komórek NK i komórek docelowych w testach uwalniania 51Cr, ponieważ różnice w objętości supernatantu usuniętego z każdej powtórzonej serii w studzienkach spowodują wysokie odchylenia standardowe. Protokoły te można modyfikować w celu oceny roli specyficznych receptorów NK w wyzwalaniu lizy komórek zakażonych HIV przez komórki NK poprzez inkubację efektorów lub celów przed kokulturą z przeciwciałami antagonistycznymi do specyficznych receptorów lub ligandów 6,11. Do oceny funkcjonalności stymulowanych komórek NK można użyć komórek NK traktowanych cytokinami (np. IL-2, IL-15) 12. Podobnie, zgodnie z tymi protokołami można przeprowadzić testy cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. Przeciwciała anty-HIV (np. anty-gp120) można dodać do komórek docelowych w celu rozpoznania przez receptor CD16 o niskim powinowactwie do Fc komórek NK 13. Testy te, choć zaprojektowane do pomiaru odpowiedzi cytotoksycznej komórek NK na komórki zakażone HIV, mogą być również modyfikowane w celu pomiaru zdolności komórek NK do produkcji cytokin po rozpoznaniu komórek zakażonych HIV. Chociaż w niniejszym protokole opisaliśmy zastosowanie komórek zakażonych in vitro jako komórek docelowych, ostatnio opisaliśmy generowanie komórek docelowych od pacjentów zakażonych HIV. Wymaga to izolacji limfocytów T CD4+ i ich następującej ekspansji przez okres dwóch tygodni po stymulacji mitogenami w obecności interleukiny-2 11. Po dwutygodniowym okresie ekspansji stosuje się protokoły opisane w tym artykule w celu izolacji komórek docelowych.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki Vacutainer (z heparyną sodową)BD Biosciences367874
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+ RosetteSepTechnologie komórek macierzystych15062
CMF PBSHycloneSH30256.01
płytki surowicy bydlęcej (FBS)Hyclone10437-028
Medium do separacji limfocytówCellgro25-072-CV
RPMI-1640HycloneSH30096.01
Penicylina / StreptomycynaHycloneSV30010
L-glutaminaCellgro25-005-Cl
Zestaw do ekspansji limfocytów TMiltenyi Biotec130-091-441
CMF HBSS (1x)HycloneSH30588.01
0,5 M EDTA46-034-Cl
Zestaw do negatywnej izolacji komórek NKMiltenyi Biotec130-092-657
IMDMGIBCO, by Life Technologies12440-046
Zestaw do izolacji komórek CD4+Invitrogen113,31 D
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi Biotec130-090-101
PolybreneSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-134220
CD3 PacificBlueBD Biosciences558117
CD14 PacificBlueBiolegend325616
CD20 PacificBlueBiolegend302328
CD56 APCBioLegend318310
CD69 PEBD Biosciences555531
CD107a FITCBD Biosciences555800
51ChromPerkinElmer, Inc.NEZ030002MC
Probówki do licznika gammaPerkinElmer, Inc.1270-401
Automatyczny licznik gamma 2470PerkinElmer, Inc.2470-0050
FACS DivaBD Biosciences643629
FlowJoTree Star, Inc.FJ-9-1YR

Bibliografia

  1. Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
  2. Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
  3. Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
  4. Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
  5. Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
  6. Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
  7. Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
  8. Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
  9. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
  12. Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
  13. Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

T-komórki zainfekowane HIV-1cytotoksyczność komórek NKizolacja limfocytów T CD4+analiza cytometrycznatest uwalniania chromu 51test degranulacjistosunki efektorowe komórek NKoczyszczanie pierwotnych komórekautologiczna hodowla komórkowaprotokół infekcji wirusowej
Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.