Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Streszczenie

Fałdowanie białek błonowych jest rozwijającym się tematem o znaczeniu zarówno fundamentalnym, jak i zdrowotnym. Duża liczba białek błonowych w komórkach uzasadnia potrzebę kompleksowych badań nad fałdowaniem tej powszechnie występującej rodziny białek. Ponadto postępy w możliwościach charakteryzowania chorób związanych z nieprawidłowo sfałdowanymi białkami stały się motywacją do znaczących wysiłków eksperymentalnych i teoretycznych w dziedzinie fałdowania białek. Szybki postęp w tej ważnej dziedzinie jest niestety utrudniony przez inherentne wyzwania związane z białkami błonowymi oraz złożoność mechanizmu fałdowania. W niniejszej pracy przedstawiamy procedurę eksperymentalną służącą do pomiaru właściwości termodynamicznej, jaką jest energia swobodna Gibbsa rozfałdowania w obecności wody (bez denaturanta), ΔG°_H2O, dla reprezentatywnego integralnego białka błonowego z E. coli. Protokół ten koncentruje się na zastosowaniu spektroskopii fluorescencji w celu określenia populacji równowagowych stanów sfałdowanych i rozfałdowanych w funkcji stężenia denaturanta. Omówiono kwestie eksperymentalne dotyczące przygotowania syntetycznych pęcherzyków lipidowych oraz kluczowe etapy procedury analizy danych. Technika ta jest wszechstronna i może być stosowana z różnymi rodzajami denaturantów, w tym temperaturą i pH, a także w różnych środowiskach fałdowania, takich jak lipidy i micele. Przedstawiony protokół można uogólnić na dowolne białko błonowe lub rozpuszczalne, które spełnia zestaw kryteriów omówionych poniżej.

Protokół

1. Przygotowanie małych jednowarstwowych pęcherzyków (SUV) o średnicy ok. 50 nm do fałdowania białek błonowych

1. Roztwór lipidów 1,2-dimyristoylo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DMPC) w chloroformie jest nabywany i rozdzielany na alikwoty po 20 mg na fiolkę w czystych szklanych fiolkach do przechowywania. Do każdej fiolki dodaje się warstwę azotu, aby zapobiec utlenianiu lipidów, a następnie fiolki zamyka się nakrętkami i uszczelnia parafinią. Fiolki przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20° C do czasu użycia.
2. Do każdego eksperymentu wykorzystuje się jedną fiolkę zawierającą alikwot 20 mg lipidów w chloroformie. Zawartość fiolki jest suszona strumieniem azotu przez 1 godzinę, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
3. Wysuszone lipidy resuspenduje się w 1 mL 20 mM buforu fosforanowego potasu (pH = 7,3), używając sonikatora w kąpieli wodnej przez około 30 sekund. Roztwór zawiesiny lipidowej będzie mętny i zostaje przeniesiony do plastikowej probówki o pojemności 15 mL z stożkowym dnem. Kolejny alikwot 1 mL buforu fosforanowego dodaje się do pustej szklanej fiolki, w której pierwotnie znajdowały się lipidy, i powtarza sonikację; roztwór ten dodaje się następnie do tej samej probówki 15-mL. Proces ten powtarza się łącznie 4 razy, aż końcowa objętość w probówce wyniesie 4 mL, co daje stężenie lipidów 5 mg/mL w tym roztworze pęcherzyków zapasowym.
4. Objętość 4 mL roztworu pęcherzyków lipidowych umieszcza się w ciepłej (~ 30° C) kąpieli wodnej i poddaje sonikacji za pomocą mikrokońcówki sonikatora ultradźwiękowego przez 1 godzinę przy 50% cyklu pracy. Kąpiel wodna pełni podwójną funkcję. Po pierwsze, zapobiega nadmiernemu nagrzaniu roztworu lipidów podczas procesu sonikacji. Po drugie, ciepła kąpiel zapewnia, że temperatura wodnego roztworu lipidów pozostaje powyżej temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy podczas sonikacji; dla DMPC temperatura przejścia ta wynosi ~23° C.
5. Sonikowany roztwór przepuszcza się przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń z końcówki sonikatora, a tak przefiltrowany roztwór inkubuje się przez noc w temperaturze 37° C do uzyskania stanu równowagi.

2. Przygotowanie próbek do wstępnej krzywej rozwijania fluorescencji

1. Przygotowuje się roztwór zapasowy 10 M mocznika w 20 mM buforze fosforanowym (pH 7.3). Niezbędne jest dodawanie wody do substancji stałej (a nie odwrotnie), ponieważ duża ilość mocznika zajmuje znaczną objętość w roztworze. Roztwór mocznika można przygotować poprzez wsypanie substancji rozpuszczalnych do czystej, pustej butelki i dolanie wody do pożądanego objętości końcowej. Roztwór ten może wymagać podgrzania w łaźni wodnej lub na płycie grzejnej z mieszaniem w celu rozpuszczenia substancji. Mocznik jest higroskopijny, dlatego rzeczywiste stężenie roztworu zapasowego mocznika należy wyznaczyć za pomocą współczynnika załamania światła.¹
2. Przygotowuje się zapasowy roztwór buforu fosforanowego 20 mM (pH 7.3).
3. Przygotowuje się roztwór zapasowy rozfałdowanego białka. Ten zapasowy roztwór białka powinien mieć stężenie ~200 μM białka w 8 M mocznika i 20 mM buforze fosforanowym.
4. Próbki do badań fluorescencji przygotowuje się w następujący sposób. Odpowiednie objętości zapasowego roztworu białka (sekcja 2.3), zapasowego roztworu lipidów (5 mg/mL lipidów, sekcja 1), zapasowego 10 M roztworu mocznika (sekcja 2.1) oraz zapasowego buforu fosforanowego (sekcja 2.2) łączy się tak, aby uzyskać próbki zawierające ~4 μM białka, 1 mg/mL lipidów oraz od 0 do 8 M mocznika w przyrostach 1 M. Objętość całkowita każdej próbki wynosi 200 μL. Dołączono przykładową tabelę (Tabela 1), w której wymieniono objętości wymagane przy użyciu 200 μM zapasowego roztworu białka.
5. Próbki ślepe przygotowuje się zgodnie z opisem w sekcji 2.4, z pominięciem dodania białka. Zamiast białka można dodać 4 μL roztworu 8 M mocznika, aby stężenia pozostałych składników były identyczne z tymi opisanymi w sekcji 2.4. Próbki ślepe te służą do odjęcia rozpraszania oraz innego sygnału tła, który pojawia się w widmach fluorescencji białek.
6. Próbki z sekcji 2.4 i 2.5 inkubuje się w temperaturze 37° C przez co najmniej 2 godziny przed pomiarem widm fluorescencji, aby zapewnić całkowite sfałdowanie i równowagę.

3. Pomiar widm fluorescencji

Fluorescencję tryptofanu każdej próbki oraz próbki ślepej pomiaru wykonuje się za pomocą fluorometru w stanie stacjonarnym. Widma fluorescencji należy rejestrować przy długości fali wzbudzenia 290 nm, aby uniknąć wzbudzenia reszt tyrozyny, skanując zakres od 305 do 500 nm. Typowa szerokość szczeliny wejściowej i wyjściowej wynosi 3 nm. Przyrost długości fali oraz czas całkowania można zoptymalizować pod kątem stosunku sygnału do szumu. Typowe wartości przyrostu długości fali i czasu całkowania to odpowiednio 1 nm/step i 0,5 sec/step. Białka błonowe zazwyczaj fałdują się w syntetycznych lipidach tylko wtedy, gdy temperatura jest wyższa od temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy. Dlatego w przypadku DMPC temperatura próbki jest utrzymywana na stałym poziomie 30 °C. W eksperymentach tych wykorzystuje się mikrowolumenową kuwetę z topionego kwarcu o pojemności 160 μL.

4. Generowanie wstępnej krzywej rozwijania oraz szacowanie energii swobodnej Gibbsa podczas rozwijania białka błonowego

1. Widma fluorescencji w formie zestawu danych x-y są wczytywane do oprogramowania takiego jak Igor Pro, Matlab, Origin lub Excel.
2. Sygnał z tła mocznika i pęcherzyków lipidowych musi zostać odjęty zgodnie z następującą procedurą:
   Widmo A = surowe widmo fluorescencji białka w obecności pęcherzyków lipidowych i określonego stężenia mocznika.
   Widmo B = surowe widmo fluorescencji odpowiadającej próbki ślepej, która zawiera pęcherzyki lipidowe i takie samo stężenie mocznika jak w widmie A; próbki ślepe nie zawierają białka.
   Widmo skorygowane = Widmo A - C*widmo B. C jest skalarem zazwyczaj równym 1,0. W niektórych przypadkach C jest mniejsze lub większe od 1,0 ze względu na problemy z rozpraszaniem, które powodują nadmierne lub niedostateczne odjęcie w obszarze ~305-320 nm.
3. Długość fali maksymalnej fluorescencji, λ_max, jest zestawiana w tabeli na podstawie skorygowanych widm dla każdego stężenia mocznika. Typowa wartość dla całkowicie rozfałdowanego białka błonowego wynosi 350 nm, natomiast dla białka sfałdowanego ~330 nm. Zestawione długości fal są przeliczane na ułamek rozfałdowany poprzez konwersję zakresu wartości λ_max (~330 do ~350 nm) na zakres od 0,0 do 1,0, aby powiązać wartość λ_max z ułamkiem populacji rozfałdowanej. Na przykład wartość λ_max wynosząca 330 nm odpowiada 0,0, 350 nm odpowiada 1,0, a 340 nm odpowiada 0,5 w odniesieniu do ułamka rozfałdowanego. Ten ułamek rozfałdowanego białka jest następnie nanoszony na wykres w zależności od stężenia mocznika. Jak wspomniano wcześniej, stężenie mocznika powinno zostać określone eksperymentalnie poprzez pomiar współczynnika załamania światła.
4. Zakładamy, że białko może istnieć w jednym z dwóch stanów: sfałdowanym lub rozfałdowanym. Wykres ułamka rozfałdowanego, f, w funkcji stężenia mocznika, C, można dopasować do równania:²
   
   Współczynnik m odpowiada szybkości zmiany energii swobodnej w odniesieniu do stężenia denaturanta, a C_m odpowiada środkowemu stężeniu mocznika, przy którym populacja sfałdowana jest równa populacji rozfałdowanej. Wartości te są zmiennymi dopasowania uzyskanymi metodą najmniejszych kwadratów przez oprogramowanie do analizy danych. R (0,001987 kcal/mol • K) to stała gazowa, a T to temperatura (303 K).
5. Współczynniki uzyskane z dopasowania są wykorzystywane do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa (kcal/mol) rozfałdowania w obecności mocznika: .

5. Zoptymalizowana krzywa rozfałdowania dla bardziej precyzyjnego pomiaru energii swobodnej Gibbsa rozfałdowania.

1. Opisana powyżej krzywa rozwijania ujawnia zakres stężeń mocznika, które powodują największą zmianę λ_max. Zakres ten jest zazwyczaj wąski, a większość procesu rozwijania zachodzi właśnie w tym przedziale. Aby precyzyjnie określić wolną energię rozwijania, w tym obszarze analizuje się dodatkowe próbki, aby uzyskać wykres zawierający wiele punktów danych, niezbędnych do zoptymalizowanego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Na przykład, jeśli białko rozwija się w zakresie od 2 do 4 M mocznika, można przygotować próbki zawierające 2 - 4 M mocznika w odstępach 0,2 M, aby dokładniej określić kształt tego istotnego obszaru na krzywej rozwijania. Nie jest konieczne pomiar widm ślepych dla każdego stężenia mocznika; wystarczy zmierzyć widmo ślepe co około 0,5 M.
2. Wolna energia rozwijania uzyskana z tego wykresu może nieznacznie różnić się od wartości otrzymanej z pierwotnej krzywej rozwijania, ale odzwierciedla wartość bardziej precyzyjną.

6. Reprezentatywne wyniki:

Próbka	końcowe [mocznik], M	białko zapasowe (μL)	roztwór zapasowy lipidów (μL)	roztwór zapasowy 10 M mocznika (μL)	bufor treściwy (μL)
1	~ 0.16	4	40	0	156
2	1	4	40	20	136
3	2	4	40	40	116
4	3	4	40	60	96
5	4	4	40	80	76
6	5	4	40	100	56
7	6	4	40	120	36
8	7	4	40	140	16

Tabela 1. Objętość roztworów zapasowych wymagana do przygotowania próbek fluorescencyjnych

Rysunek 1. Widma fluorescencji tryptofanu reprezentatywnego białka błonowego o stężeniu ~ 5 μM, zawierającego jedną resztę tryptofanu. (A) Surowe widma fluorescencji białka (widmo A z pkt 4.2); (B) Surowe widma fluorescencji próbki ślepej (widmo B z pkt 4.2); (C) Skorygowane widmo z pkt 4.2.

Rycina 2. Skorygowane widma fluorescencji tryptofanu białka błonowego z Ryciny 1 dla licznych stężeń mocznika.

Rysunek 3. Krzywa rozfałdowania uzyskana z danych na Rysunku 2, z dopasowaniem do równania w sekcji 4.4. Energia swobodna Gibbsa została obliczona zgodnie z sekcją 4.5.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje generowanie krzywych rozfałdowania białek i peptydów związanych z błoną, które zawierają reszty tryptofanu. Przyjęto tutaj, że fluorescencja tryptofanu odzwierciedla, czy białko jest sfałdowane i wbudowane w syntetyczne pęcherzyki lipidowe, czy też rozfałdowane w roztworze. W niniejszym raporcie przyjęto dodatkowe założenia, takie jak dwustanowe sfałdowanie i liniowa zależność energii swobodnej od stężenia denaturanta; zmiana tych założeń prowadzi do zastosowania innych równań.² Prot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMPC	Avanti Polar Lipid, Inc	850345C
Mocznik	MP Biomedicals	04821527
Fosforan potasu dwuzasadowy	Fisher Scientific	P288
Fosforan potasu jednozasadowy	Fisher Scientific	P285