Immunocytochemia: Ludzkie neuronalne komórki macierzyste

Podsumowanie

Immunocytochemia to skuteczna metoda określania obecności, lokalizacji subkomórkowej i względnej obfitości interesującego antygenu w hodowanych komórkach. Protokół ten przedstawia łatwą do wykonania serię kroków, które pozwolą zachować przeciwciała i jak najlepiej wykorzystać swoje barwienie.

Streszczenie

Immunocytochemia to bardzo skuteczna i dość prosta metoda określania obecności, lokalizacji subkomórkowej i względnej obfitości interesującego antygenu, najczęściej białka, w hodowanych komórkach. Protokół ten przedstawia łatwą do wykonania serię kroków, które umożliwią naukowcom zachowanie pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał przy jednoczesnym uzyskaniu wysokiej jakości, powtarzalnych danych jakościowych i ilościowych z ich barwienia. Istnieją dwa aspekty tego protokołu, które pomagają zachować objętość przeciwciał niezbędną do barwienia. Po pierwsze, komórki są hodowane na małych, okrągłych szkiełkach nakrywkowych, które umieszcza się w studzienkach płytki do hodowli tkankowej. Po utrwaleniu komórki na szkiełkach nakrywkowych można usunąć z dołków płytki. W przypadku barwienia przeciwciał szkiełko nakrywkowe z komórkami odwraca się na małą kroplę roztworu przeciwciała na parafilmie i przykrywa się drugim kawałkiem parafilmu, aby zapobiec wysuszeniu. Stosując tę metodę, do barwienia każdego szkiełka nakrywkowego (lub próbki) potrzebne jest tylko ~25 μl roztworu przeciwciała. Protokół ten opisuje barwienie immunologiczne ludzkich nerwowych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPC), ale może być stosowany do wielu innych typów komórek.

Protokół

Dzień 1: Przygotowanie niemieckich szklanych szkiełek nakrywkowych i komórek wysiewających

Uwaga: Niemieckie szkiełka nakrywkowe są często preferowane do hodowli pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i neuronów. Stosujemy następujący protokół czyszczenia, aby poprawić adhezję komórek i ich rozprzestrzenianie. Umieść szkiełka nakrywkowe w małym stojaku, który umożliwi dostęp płynów po obu stronach szkiełka nakrywkowego. Najpierw inkubuj szkiełka nakrywkowe w 1% Liquinox przez 10 minut, a następnie 3 przepłucz wodą dejonizowaną. Upewnij się, że nie pozostały żadne bańki mydlane. Następnie inkubuj szkiełka w 1M HCl przez 30 minut, a następnie 3 przepłucz wodą dejonizowaną. Szkiełka nakrywkowe suszyć w temperaturze 65°C przez noc. Przenieś szkiełka nakrywkowe do szklanego naczynia i autoklawu w celu sterylizacji.

1. W kapturze do hodowli tkankowych umieść sterylne szkiełka nakrywkowe w płytce dołka o odpowiedniej wielkości .
   
   
2. Pokryj szkiełka nakrywkowe lamininą w celu adhezji komórek. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 10 μg/ml poli D-lizyny (PDL) w sterylnej wodzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PDL i inkubować szkiełka nakrywkowe w 20 μg/ml lamininy w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C.
   
   
   
   1. Uwaga: Zapoznaj się z artykułem Passaging Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263) oraz artykułem Counting Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262), aby dowiedzieć się, jak ponownie zawiesić i policzyć hNSPCs.
      
      
3. Wypłucz szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą z PBS i komórkami nasiennymi do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe o określonej gęstości (często używamy początkowej gęstości posiewu 100 000-300 000 komórek/ml dla komórek, które posiewamy do barwienia immunologicznego).
   
   
4. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C i pozostawić komórkom przyleganie do szkiełek nakrywkowych (zwykle wymagane są co najmniej 4 godziny).

Dzień 2: Utrwalanie, utrwalanie, blokowanie i dodawanie pierwotnego przeciwciała do komórek

Uwaga: Używamy następującego 4% utrwalacza paraformaldehydu, aby zachować morfologię komórek. Receptura obejmuje zmianę pH, aby umożliwić paraformaldehydowi przejście do roztworu. Wolimy tę metodę niż użycie ciepła do rozpuszczenia paraformaldehydu, ponieważ wyższe temperatury mogą prowadzić do wytwarzania kwasu mrówkowego, który może zwiększyć barwienie tła podczas stosowania fluorescencji. Niektóre składniki utrwalacza pomagają zachować strukturę cytoszkieletu (MgCl₂ i EGTA), podczas gdy inne pomagają w utrzymaniu ogólnej morfologii (sacharoza).

4% utrwalacz paraformaldehydu dla komórek

Odczynniki i kroki:	Ilość na 100 ml utrwalacza:
Woda MilliQ	Pojemność 75 ml
Paraformaldehyd (odważony w dygestorium)	4 gramów
10N NaOH, mieszać i dodawać kroplami, aż roztwór się klaruje	w razie potrzeby
10 razy więcej kanałów na sekundę	Pojemność 10 ml
1M MgCl2	Pojemność 0,5 ml
0,5 m EGTA	Pojemność 2 ml
sacharoza	4 gramów
6N HCl, miareczkować do pH 7,4	w razie potrzeby
Woda MilliQ	Doprowadzić do 100 ml
Przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do 1 tygodnia. Podgrzać do 37°C przed użyciem

1. Na ławce usuń podłoże i dodaj podgrzany utrwalacz. Inkubować przez 5-15 minut (w zależności od wykrytego antygenu zwykle używamy 10 minut). Wykonaj tę i następujące czynności w temperaturze pokojowej.
   
   
2. Wyrzuć utrwalacz do odpowiedniego pojemnika, ponieważ wiele instytucji traktuje paraformaldehyd jako odpad niebezpieczny. Umyj komórki 3 razy PBS, za każdym razem 5 minut. Podczas usuwania roztworów z komórek należy uważać, aby ssanie nie wysuszyło komórek. Ponadto zawsze miej pod ręką następny roztwór, który można dodać do komórek przed usunięciem roztworu, który je pokrywa, aby komórki nie pozostały do wyschnięcia.
   
   
3. Jeśli badany antygen znajduje się wewnątrz komórki, błona komórkowa musi być przepuszczalna, aby umożliwić wniknięcie przeciwciała. Aby przeniknąć do komórek, należy użyć świeżego 0,3% roztworu Triton X-100 w PBS. Pipetuj powoli, ponieważ Triton jest lepki, i upewnij się, że detergent jest całkowicie rozpuszczony w PBS przed dodaniem do komórek. Udrażniaj komórki przez 5 minut, a następnie myj komórki 3 razy PBS, za każdym razem 5 minut.
   
   
4. Komórki muszą być traktowane środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała. Jako środek blokujący stosujemy albuminę surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór blokujący jest wytwarzany przez rozpuszczenie 5% BSA w PBS (na wahaczu lub rotatorze, ponieważ rozpuszczenie zajmuje trochę czasu), a następnie przefiltrowanie roztworu za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. Blokuj komórki w 5% roztworze BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (które, miejmy nadzieję, jest specyficzne dla interesującego nas białka) do wcześniej określonego stężenia w 1% BSA/PBS (przygotowanym przez rozcieńczenie od 5% BSA/PBS). Rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (30 μl na szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm, 20 μl na szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm, 15 μl na szkiełko nakrywkowe) umieścić na płytce szklanej pokrytej parafilmem. Podnieś szkiełko nakrywkowe z utrwalonymi komórkami, odwróć tak, aby komórki były skierowane w dół, i połóż je na roztworze przeciwciała tak, aby komórki stykały się z przeciwciałem. Umieść drugi pasek parafilmu na całej konstrukcji. Inkubować w temperaturze 4°C przez noc.

Dzień 3: Mycie, Wtórna Inkubacja Przeciwciał, Barwienie Jądrowe i Montaż

1. Ostrożnie usuń górny pasek parafilmu i podnieś szkiełko nakrywkowe, odwróć je i umieść z powrotem na płytce z PBS w każdej studzience do płukania tak, aby komórki były skierowane do góry.
   
   
2. Umyj komórki 3 razy PBS, za każdym razem 5 minut.
   
   
3. Wybierz przeciwciało drugorzędowe, które wykryje przeciwciało pierwszorzędowe, na przykład, jeśli przeciwciało pierwszorzędowe zostało wytworzone u królika, przeciwciało drugorzędowe powinno rozpoznawać IgG królika. Zadbaj również o dopasowanie izotypu przeciwciała (IgG, IgM itp.). Jeśli używasz wielu przeciwciał pierwszorzędowych, upewnij się, że pochodzą one z różnych gatunków lub izotypów i zaplanuj wykrywanie za pomocą różnych markerów przyłączonych do przeciwciał drugorzędowych. Na przykład możesz użyć wtórnego anty-królika sprzężonego z czerwonym fluoroforem z wtórnym anty-myszem sprzężonym z zielonym fluoroforem. Inkubować komórki w roztworze przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego do odpowiedniego stężenia w 1% BSA przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej, stosując tę samą technikę, co w przypadku pierwotnego (kroki nie pokazane na filmie). Objętość przeciwciała drugorzędowego potrzebnego do inkubacji może być nieco większa niż objętość przeciwciała pierwszorzędowego, jeżeli przeciwciało drugorzędowe jest przechowywane w postaci roztworu glicerolu (40 μl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 30 μl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 25 μl na szkiełko nakrywkowe 12 mm).
   
   
   • Uwaga: Jeśli używasz cząsteczek fluorescencyjnych do wizualizacji przeciwciała drugorzędowego, próbka musi być chroniona przed światłem po dodaniu przeciwciała drugorzędowego. Inkubować w ciemności lub na płytce pokrytej folią.
     
     
4. Ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z parafilmu zgodnie z opisem dla przeciwciała pierwotnego. Przemyć komórki 2 razy PBS, za każdym razem 5 minut, a następnie 1 minutę inkubacji w 2 μg/ml barwnika jądrowego Hoechsta rozcieńczonego w PBS (jeśli preferowane jest barwienie przeciwjądrowe). Jeśli barwnik Hoechsta jest stary, a sygnał jest zbyt słaby, można wydłużyć czas inkubacji i/lub stężenie. Po inkubacji z Hoechst przemyć 1 raz PBS przez 5 minut.
   
   
5. Szkiełka nakrywkowe należy zamontować na szkiełku podstawowym z nośnikiem montażowym do wizualizacji pod mikroskopem. W przypadkach, w których cząsteczka fluorescencyjna jest używana do wizualizacji przeciwciała drugorzędowego, podłoże montażowe powinno zawierać środki minimalizujące fotowybielanie. Używamy Vectashield jako nośnika montażowego do fluorescencji. Umieść kroplę Vectashield odpowiedniej wielkości na szkiełku mikroskopowym (12 μl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 6 μl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 3 μl na szkiełko nakrywkowe 12 mm).
   
   
6. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i spłucz tył wodą dejonizowaną, aby usunąć sole (z PBS). Zetrzyj nadmiar wody na chusteczkę kimwipe lub ręcznik papierowy i połóż się na kropli Vectashield komórkami skierowanymi w dół. Umieść szkiełko nakrywkowe pod kątem i pozwól mu powoli opadać, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Oznacz slajd datą i wszelkimi informacjami o próbce.
   
   
7. Pozostaw szkiełka podstawowe z szkiełkami nakrywkowymi do wyschnięcia (w ciemności), a następnie odessać nadmiar Vectashield z okolic krawędzi szkiełka nakrywkowego. W razie potrzeby krawędzie szkiełek nakrywkowych można teraz uszczelnić lakierem do paznokci (szczególnie przydatne, jeśli szkiełka nakrywkowe będą oglądane pod odwróconym mikroskopem). Zazwyczaj przechowujemy nasze szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20°C.

Dyskusja

Protokół ten opisuje procedurę barwienia immunologicznego dla hNSPC, która minimalizuje niezbędną objętość przeciwciał i zapewnia wiarygodne barwienie komórek. Opisana procedura jest najlepsza dla antygenów wewnątrzkomórkowych, ale może być zmodyfikowana w celu barwienia cząsteczek na powierzchni komórki lub zwiększenia barwienia cytoszkieletu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe do szkła niemieckiego (Deutsche Spiegelglas)	Narzędzie	Carolina Biological	WW-63-3029	Dostępne szkiełka nakrywkowe 12,15,18, 22, 25 mm
Detergent bez fosforanów Liquinox	Odczynnik	Sigma-Aldrich	Z273279	bardzo lepki
Odczynnik bromowodorku poli-D-lizyny		Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, naturalna mysz	Odczynnik	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Dystrybuowany przez firmę Fisher we wskazanym katalogu #
24 płytka dołkowa	Narzędzie Fisher	Scientific	08-772-1
Odczynnik Triton X-100		Fisher Scientific	BP151-500	bardzo lepki
odczynnik	paraformaldehydowy	Sigma-Aldrich	P6148	potencjalny czynnik rakotwórczy, należy zachować ostrożność podczas używania go w postaci
proszku i roztworuAlbumina surowicy bydlęcej, odczynnik wolny od IgG		Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H– chst 33342	Odczynnik	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Odczynnik	Vector Laboratories	H-1000	lepki