Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Podsumowanie

Immunocytochemia jest potężną metodą pozwalającą określić obecność, lokalizację subkomórkową oraz względną obfitość interesującego antygenu w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, które umożliwią oszczędność przeciwciał i zoptymalizują proces barwienia.

Streszczenie

Immunocytochemia jest bardzo potężną i stosunkowo prostą metodą określania obecności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz względnej liczebności badanego antygenu, najczęściej białka, w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, która pozwoli badaczom ograniczyć zużycie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, zapewniając jednocześnie wysoką jakość oraz powtarzalność uzyskanych danych jakościowych i ilościowych z barwienia. Protokół ten zawiera dwa aspekty pomagające zminimalizować objętość przeciwciał niezbędną do barwienia. Po pierwsze, komórki są hodowane na małych, okrągłych szkiełkach nakrywek umieszczonych w dołkach płytki do hodowli tkanek. Po fiksacji komórki na szkiełkach nakrywek mogą zostać usunięte z dołków płytki. W celu barwienia przeciwciałami, szkiełko nakrywka z komórkami jest odwrócone na małą kroplę roztworu przeciwciał na parafilmie i przykryte drugim kawałkiem parafilmu, aby zapobiec wysychaniu. Stosując tę metodę, do każdego szkiełka nakrywki (lub próbki) przeznaczonego do barwienia potrzeba jedynie ~25 μl roztworu przeciwciał. Protokół ten opisuje immunobarwienie ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych układu nerwowego (hNSPCs), jednak może być stosowany w przypadku wielu innych typów komórek.

Protokół

Dzień 1: Przygotowanie niemieckich szkiełek nakrywkowych i wysiewanie komórek

Uwaga: Do hodowli pierwotnych komórek macierzystych neuronów i neuronów często preferowane są szkiełka nakrywkowe z niemieckiego szkła. W celu poprawy adhezji i rozprzestrzeniania się komórek stosujemy następujący protokół czyszczenia. Umieść szkiełka nakrywkowe w niewielkim statywie, który zapewni dostęp cieczy do obu stron szkiełka. Najpierw inkubuj szkiełka nakrywkowe w 1% Liquinox przez 10 minut, a następnie wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Upewnij się, że nie pozostały pęcherzyki mydła. Następnie inkubuj szkiełka w 1M HCl przez 30 minut, po czym wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Susz szkiełka nakrywkowe w temperaturze 65°C przez noc. Przenieś szkiełka nakrywkowe do szklanego naczynia i wysterylizuj w autoklawie.

1. W komorze do hodowli tkankowej umieścić sterylne szkiełka podstawowe w odpowiednio dobranej wielkością płytce wielodołkowej  .
   
   
2. Pokryć szkiełka podstawowe lamininą w celu zapewnienia adhezji komórek. Inkubować szkiełka w roztworze 10 µg/ml poli-D-lizyny (PDL) w sterylnej wodzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PDL i inkubować szkiełka w roztworze 20 µg/ml lamininy w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C.
   
   
   
   1. Uwaga: W celu zapoznania się ze sposobem resuspensji i zliczania hNSPCs należy odwołać się do artykułu Passaging Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263) oraz artykułu Counting Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262).
      
      
3. Przepłukać pokryte lamininą szkiełka podstawowe PBS i zasiać komórki do każdego dołka zawierającego szkiełko z określoną gęstością (w przypadku komórek przeznaczonych do immunobarwienia często stosujemy początkową gęstość wysiewu 100,000-300,000 komórek/ml).
   
   
4. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C i pozwolić komórkom przytwierdzić się do szkiełek podstawowych (zazwyczaj wymagane jest minimum 4 godziny).

Dzień 2: Fixacja, permeabilizacja, blokowanie i dodawanie przeciwciała pierwszorzędowego do komórek

Uwaga: W celu zachowania morfologii komórek stosujemy następujący utrwalacz z 4% paraformaldehydu. Receptura obejmuje zmianę pH, która umożliwia przejście paraformaldehydu do roztworu. Preferujemy tę metodę zamiast ogrzewania w celu rozpuszczenia paraformaldehydu, ponieważ wyższe temperatury mogą prowadzić do powstania kwasu mrówkowego, co może zwiększyć tło podczas barwienia fluorescencyjnego. Niektóre składniki utrwalacza pomagają zachować strukturę cytoszkieletu (MgCl₂ i EGTA), podczas gdy inne pomagają utrzymać ogólną morfologię (sukroza).

4% utrwalacz paraformaldehydowy do komórek

Odczynniki i etapy:	Ilość na 100 ml utrwalacza:
Woda MilliQ	75 ml
Paraformaldehyd (odważyć w dygestorium)	4 g
10N NaOH, mieszać i dodawać kroplowo do momentu przejrzystości roztworu	według potrzeb
10X PBS	10 ml
1M MgCl2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sacharoza	4 g
6N HCl, miareczkować do pH 7,4	według potrzeb
Woda MilliQ	dopełnić do 100 ml
Przechowywać w 4°C do 1 tygodnia. Przed użyciem ogrzać do 37°C

1. Na blacie roboczym usunąć medium i dodać uprzednio ogrzany utrwalacz. Inkubować przez 5-15 minut (zależnie od wykrywanego antygenu, zazwyczaj stosujemy 10 minut). Ten oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
   
   
2. Utrwalacz należy wylać do odpowiedniego pojemnika, ponieważ  w wielu instytucjach paraformaldehyd jest traktowany jako odpad niebezpieczny. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. Podczas usuwania roztworów z komórek należy uważać, aby odsysanie nie doprowadziło do wyschnięcia komórek. Należy również zawsze mieć przygotowany kolejny roztwór do dodania do komórek przed usunięciem roztworu z nich, aby komórki nie wyschły.
   
   
3. Jeśli interesujący antygen znajduje się wewnątrz komórki, błona komórkowa musi zostać przepuszczczona, aby umożliwić wniknięcie przeciwciała. W celu permeabilizacji komórek należy użyć świeżego 0,3% roztworu Triton X-100 w PBS. Pipetować powoli, ponieważ Triton jest lepki, i upewnić się, że detergent jest całkowicie rozpuszczony w PBS przed dodaniem do komórek. Permeabilizować komórki przez 5 minut, a następnie przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem.
   
   
4. Komórki muszą zostać poddane działaniu czynnika blokującego, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Jako czynnika blokującego stosujemy albuminę surowiczą bydlęcą (BSA). Roztwór blokujący przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 5% BSA w PBS (na wytrząsacie lub rotatorze, ponieważ rozpuszczanie trwa) a następnie przefiltrowanie roztworu za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm. Blokować komórki w 5% roztworze BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (które powinno być specyficzne dla białka docelowego) do wcześniej określonego stężenia w 1% BSA/PBS (przygotowanym przez rozcieńczenie 5% BSA/PBS). Nanieść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (30 µl na szkiełko podstawowe 25 mm, 20 µl na szkiełko podstawowe 18 mm, 15 µl na szkiełko podstawowe 12 mm) na płytkę szklaną pokrytą parafilmem. Podnieść szkiełko podstawne z unieruchomionymi komórkami, odwrócić je tak, aby komórki znajdowały się na dole, i położyć na roztworze przeciwciał, tak aby komórki miały kontakt z przeciwciałami. Przykryć całą konstrukcję drugim paskiem parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C.

Dzień 3: Płukanie, inkubacja z przeciwciałem wtórnym, barwienie jąder i montaż preparatu

1. Ostrożnie usuń górny pasek parafilmu, podnieś szkiełko nakrywkowe, odwróć je i umieść z powrotem w płytce z PBS w każdym dołku do przemywania, tak aby komórki były skierowane do góry.
   
   
2. Przemyj komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem.
   
   
3. Wybierz przeciwciało wtórne, które wykryje przeciwciało pierwotne; na przykład, jeśli przeciwciało pierwotne zostało wytworzone u królika, przeciwciało wtórne powinno rozpoznawać królicze IgG. Należy zadbać o dopasowanie izotypu przeciwciała (IgG, IgM itp.). W przypadku stosowania wielu przeciwciał pierwotnych upewnij się, że pochodzą one od różnych gatunków lub mają różne izotypy, i zaplanuj detekcję za pomocą różnych markerów dołączonych do przeciwciał wtórnych. Na przykład można użyć przeciwciała wtórnego przeciwkróliczego sprzężonego z czerwonym fluorophorem oraz przeciwciała wtórnego przeciwmysiego sprzężonego z zielonym fluorophorem. Inkubuj komórki w roztworze przeciwciała wtórnego rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1% BSA przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej, stosując tę samą technikę co w przypadku przeciwciał pierwotnych (kroki niewykazane na filmie). Objętość przeciwciała wtórnego potrzebna do inkubacji może być nieco większa niż w przypadku przeciwciała pierwotnego, jeśli przeciwciało wtórne jest przechowywane jako roztwór glicerolu (40 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 30 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 25 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm).
   
   
   • Uwaga: Jeśli do wizualizacji przeciwciała wtórnego używasz cząsteczek fluorescencyjnych, próbka musi być chroniona przed światłem po dodaniu przeciwciała wtórnego. Inkubuj w ciemności lub w płytce owiniętej folią.
     
     
4. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z parafilmu, zgodnie z opisem dla przeciwciała pierwotnego. Przemyj komórki 2 razy PBS, po 5 minut za każdym razem, a następnie inkubuj przez 1 minutę w barwniku jądrowym Hoechst w stężeniu 2 µg/ml rozcieńczonym w PBS (jeśli preferowane jest przeciwbarwienie jąder). Jeśli barwnik Hoechst jest stary i sygnał jest zbyt słaby, można zwiększyć czas inkubacji i/lub stężenie. Po inkubacji z Hoechst przemyj 1 raz PBS przez 5 minut.
   
   
5. Szkiełka nakrywkowe należy zamontować na szkiełku przedmiotowym za pomocą medium montażowego w celu wizualizacji pod mikroskopem. W przypadkach, gdy do wizualizacji przeciwciała wtórnego użyto cząsteczki fluorescencyjnej, medium montażowe powinno zawierać substancje minimalizujące fotoblaknięcie. Jako medium montażowe do fluorescencji stosujemy Vectashield. Nanieś kroplę Vectashield o odpowiedniej wielkości na szkiełko przedmiotowe (12 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 6 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 3 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm).
   
   
6. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i opłucz jego tył wodą dejonizowaną, aby usunąć sole (z PBS). Odchłoń nadmiar wody za pomocą chusteczki typu kimwipe lub ręcznika papierowego i połóż szkiełko na kropli Vectashield komórkami skierowanymi w dół. Połóż szkiełko nakrywkowe pod kątem i pozwól mu powoli opaść, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Opisz szkiełko przedmiotowe, podając datę i wszelkie informacje o próbce.
   
   
7. Pozostaw szkiełka z nakrywkami do wyschnięcia (w ciemności), a następnie odessać nadmiar Vectashield z krawędzi szkiełka nakrywkiego. Krawędzie szkiełka nakrywkiego można teraz uszczelnić lakierem do paznokci, jeśli jest to pożądane (szczególnie przydatne, jeśli szkiełka nakrywkowe będą obserwowane pod mikroskopem odwróconym). Zazwyczaj przechowujemy nasze szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20°C.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje procedurę immunobarwienia dla hNSPCs, która minimalizuje objętość niezbędnych przeciwciał i zapewnia wiarygodne barwienie komórek. Opisana procedura jest optymalna dla antygenów wewnątrzkomórkowych, ale może zostać zmodyfikowana w celu barwienia cząsteczek powierzchniowych komórek lub wzmocnienia barwienia cytoszkieletu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kryszalki z niemieckiego szkła (Deutsche Spiegelglas)	Narzędzie	Carolina Biological	WW-63-3029	dostępne kryszalki o średnicach 12, 15, 18, 22, 25 mm
Detergent bezfosforowy Liquinox	Odczynnik	Sigma-Aldrich	Z273279	bardzo lepki
Hydrobromek poli-D-lizyny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P7280
Laminina, naturalna mysia	Odczynnik	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Odczynnik	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym
Płytka 24-dołkowa	Narzędzie	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Odczynnik	Fisher Scientific	BP151-500	bardzo lepki
Paraformaldehyd	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P6148	potencjalny kancerogen, zachować ostrożność podczas stosowania w formie proszku i roztworu
Seryjna albumina wołowa, wolna od IgG	Odczynnik	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Odczynnik	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Odczynnik	Vector Laboratories	H-1000	lepki