Testy programowanej śmierci komórek powszechnie stosowane w systemach ssaków, takie jak analiza drabinowania DNA lub testy TUNEL, są często trudne do odtworzenia u roślin. W połączeniu z systemem raportującym GUS proponujemy szybki, transientny test oparty na roślinach do analizy potencjalnych właściwości indukowania śmierci komórek przez specyficzne geny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test śmierci komórek oparty na β-glukuronidazie (GUS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy nowy system przejściowej ekspresji roślinnej, który jednocześnie wykazuje ekspresję genu reporterowego, β-glukuronidazy (GUS), oraz domniemanych pozytywnych lub negatywnych regulatorów śmierci komórkowej. W systemie tym liście N. benthamiana są współinfiltrowane z kasetą ekspresyjną sterowaną promotorem 35S, zawierającą analizowany gen, oraz wektorem GUS pCAMBIA 2301 z wykorzystaniem szczepu Agrobacterium LBA4404 jako nośnika. Ponieważ do ekspresji GUS niezbędne są żywe komórki, spodziewany jest zanik aktywności GUS, gdy ten gen markerowy jest współwyrażany z pozytywnymi regulatorami śmierci komórkowej. Równie tak zwiększoną aktywność GUS obserwuje się przy zastosowaniu genów antyapoptotycznych w porównaniu z kontrolą wektorową. Jak pokazano poniżej, z sukcesem wykorzystaliśmy ten system w naszym laboratorium do analizy czynników pro- oraz anty-śmierciowych. Należą do nich roślinna antyapoptotyczna rodzina genów BAG (Bcl-2 Associated athanoGene), a także znane ssacze induktory śmierci komórkowej, takie jak BAX. Dodatkowo wykorzystaliśmy ten system do analizy funkcji śmierci specyficznych trunkacji w obrębie białek, co może dostarczyć wskazówek na temat możliwej potranslacyjnej modyfikacji lub aktywacji tych białek. Przedstawiamy tutaj szybką i czułą metodę opartą na roślinach, stanowiącą wstępny etap badania funkcji śmierci specyficznych genów.
Protokół
Nicotiana benthamiana są hodowane w komorze wzrostowej z kontrolowaną temperaturą 25°C. Do badań wykorzystuje się w pełni rozwinięte, zdrowe liście roślin w wieku od 3 do 6 tygodni.
Wskazówka: Lepsze wyniki uzyskuje się, wykorzystując nowo powstające liście
1. Protokół przejściowej infiltracji Agrobacterium:
Dzień 1
- Na płytkach agarowych LB/Rifampicyna (25 μg/ml)/Kanamycyna (100 μg/ml) wysiej z mrożonek w glicerolu szczepy Agrobacterium tumefaciens (szczep LBA4404) zawierające odpowiednie wektory z genem (genami) badanymi pod kątem śmierci komórek oraz wektor zawierający kasetę GUS pod promotorem konstytutywnym. Zawsze należy uwzględnić kontrolę z pustym wektorem jako kontrolę negatywną.
- Inkubować w temperaturze 28°C przez 2 dni.
Dzień 3
- Zaszczepić 2 ml pożywki LB zawierającej ryfampicynę (25 μg/ml) i kanamycynę (100 μg/ml) pojedynczą kolonią z każdej wcześniej wysianej płytki LB/ryfampicyna/kanamycyna.
- Inkubować każdą kulturę w wytrząsaniu w temperaturze 28°C przez 24 godziny przy 200 rpm, aż do osiągnięcia maksymalnej gęstości wzrostu.
Wskazówka: Czasami obserwuje się tworzenie grudek; w takim przypadku przed kontynuacją należy dokładnie resuspender kultury (np. poprzez pipetowanie w górę i w dół).
Dzień 4
- Po inkubacji zwiększyć objętość całkowitą do 10 mL, dodając świeże pożywkę LB (zawierającą odpowiednie antybiotyki) oraz acetosyringon (stężenie końcowe 25 μM).
- Inkubować każdą kulturę w wytrząsaniu w temperaturze 28 °C przez kolejne 16 h.
Dzień 5
- Następnego dnia przemyj każdą hodowlę dwukrotnie, dodając 10 ml podłoża do infiltracji (10 mM MgSO4.7H2O, 9 mM MES, pH 5,6; nie dodawać acetosyringony) i odwiruj przy 4000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Po ostatnim etapie wirowania resuspenderuj każdą hodowlę w 5 ml podłoża do infiltracji zawierającego acetosyringonę (100 μM).
- Zmierz OD600nm; akceptowalne są wartości pomiarów między 0,1 a 0,9.
Wskazówka: Wartości OD600nm tak niskie jak 0,1 były stosowane bez problemu, jednak wyższe wartości OD mogą przynieść bardziej powtarzalne wyniki. - Inkubuj hodowle przez kolejne 3 h, aby przygotować hodowle Agrobacterium do infekcji.
- Wymieszaj hodowle zawierające analizowany gen (geny) oraz kontrolę negatywną (Agrobacterium zawierające pusty wektor) w stosunku 1:1 z hodowlą zawierającą kasetę GUS.
- Przeprowadź infiltrację strony abaksjalnej (dolnej) nowo powstających liści, używając strzykawki 1 ml bez igły (Rys. 1).
Wskazówka: Infiltruj zarówno mieszaninę kontrolną negatywną (pusty wektor + kaseta GUS), jak i mieszaninę zawierającą badany gen (gen x + kaseta GUS) na przeciwległych liściach tej samej rośliny. Dla każdej serii zabiegów użyj trzech roślin. - 3 dni po infiltracji wycięte infiltrowane liście poddaj analizie w celu oznaczenia ekspresji białka GUS.
2. Histochemiczna analiza GUS
Dzień 8
- Przenieś podciśnieniowo podłoże z substratem X-gluc do wyciętych liści.
- Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu pojawienia się wyraźnego niebieskiego zabarwienia.
Dzień 9
- Przepłukać wodą destylowaną.
- Inkubować w 70% etanolu aż do usunięcia chlorofilu, a następnie ponownie przenieść do wody destylowanej. Wizualnie ocenić poziom ekspresji GUS.
3. Fluorometryczny test MUG:
Dzień 8
- Wyizolować białko całkowite poprzez rozcieranie zainfiltrowanych krążków liściowych w moździerzu z wykorzystaniem ciekłego azotu. Dodać 100 uL buforu do ekstrakcji GUS (50 mM NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% sól sodowa N-lauroylosarkozyny, β-merkaptoetanol (0,7 μl/ml)), utrzymując próbkę na lodzie.
- Odwirować zawiesinę przy 14 000 g przez 5 min w temperaturze 4 °C i pobrać supernatant jako białko całkowite rozpuszczalne.
- Zmierzyć stężenie za pomocą nanodropu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dostosować stężenie białka do 100 μg białka całkowitego rozpuszczalnego dla każdej próbki, używając buforu do ekstrakcji GUS.
- Dodać substrat MUG (trihydrat 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronidu) przygotowany w buforze do ekstrakcji GUS do stężenia końcowego 2 mM. Całkowita objętość 100 μL na próbkę (białko + substrat MUG) powinna być wystarczająca.
- Inkubować reakcje przez 1 h w temperaturze 37 °C.
- Zatrzymać reakcje poprzez dodanie 800 μl buforu zatrzymującego GUS (0,2 M Na2CO3).
- Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 455 nm, a następnie porównać wartości z krzywą standardową MU. Wyniki aktywności GUS podać jako nmol MU / μg białka całkowitego rozpuszczalnego / min.
4. Roztwory treściwe i robocze:
- Roztwór stokowy acetosyringonu (1 M) (FW = 196.2 g) – 0,981 g w 5 mL DMSO
- Roztwór stokowy kanamycyny (100 mg/ml) – przygotować w dH20 – wysterylizować przez filtrację
- Roztwór stokowy ryfampicyny (25 mg/ml) – przygotować w DMSO
- Płynna pożywka wzrostowa Luria-Bertani (LB): (1L)
1 % (w/v) tryptony bakteryjnej, 10 g
0,5 % (w/v) ekstraktu z drożdży bakteryjnych, 5 g
170 mM chlorku sodu, 10 g
pH - 7 - Acetosyringon (25 μM) = 25 μl roztworu stokowego 1 M w końcowej objętości 1 ml
- Pożywka do infiltracji: (1L)
10 mM MgSO4.7dH20(FW = 246.48 g), 2,4648 g
9 mM MES(FW = 213.25 g), 1,91925 g
pH – 5,6 - Acetosyringon (100 μM) = 100 μl roztworu stokowego 1M w końcowej objętości 1 ml
- Bufor do ekstrakcji GUS
50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % soli sodowej N-lauroylosarkozyny, β-merkaptoetanol (0,7 μl/ml) - 2x bufor fosforanowy
0,2M NaH2PO4 i 0,2 M Na2HPO4 pH 7 - Roztwór substratu X-Gluc
Rozpuścić 1 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolylu b-D-glukuronidu (X-Gluc) w 0,1 ml metanolu. Dodać 1 ml 2x buforu fosforanowego, 20 μl 0,1M ferrycyjanku potasu, 10μl 10% Triton X-100 oraz 850 μl wody destylowanej.
5. Reprezentatywne wyniki:
Stosując niniejszy protokół, w przypadku wystąpienia śmierci komórkowej oczekiwany jest zanik ekspresji GUS. Wykazaliśmy jednoczesną ekspresję genu reporterowego, β-glukuronidazy (GUS), wraz z członkiem rodziny białek cytoprotekcyjnych Arabidopsis Rodzina genów BAG (Bcl-2 Associated athanoGene). Przeprowadziliśmy ko-infiltrację N. benthamiana liście z kasetą ekspresyjną BAG sterowaną promotorem 35S oraz wektorem GUS pCAMBIA 2301 przy użyciu Agrobacterium szczep LBA4404. Jak pokazano na rysunku 2, po tej infiltracji zaobserwowano widoczny wzrost barwienia GUS. Z kolei w przypadku zastosowania BAX, znanego proapoptotycznego białka z rodziny Bcl-2, zaobserwowano wyraźny spadek barwienia GUS (Rys. 2). W obu tych przypadkach ekspresja GUS była widocznie inna w porównaniu z kontrolą. Jednak w sytuacjach, gdy różnica w ekspresji jest mniej oczywista, można przeprowadzić fluorometryczne testy MUG w celu ilościowego oznaczenia ekspresji GUS.
Rysunek 1. Przykład infiltracji strony abaksjalnej liści N. benthamiana mieszaniną Agrobacterium przy użyciu strzykawki 1 ml bez igły.
Rysunek 2. W liściach N. benthamiana koeksprymowano wektor GUS z genem przeciwśmiertnym oraz znanym induktorem śmierci komórek. Poziomy GUS porównano z kontrolą z pustym wektorem (kontrola GUS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Często trudno jest stosować w roślinach techniki wykrywania śmierci komórek, które są powszechne w systemach ssaków. W połączeniu z systemem reporterowym GUS przedstawiamy czułą, opartą na roślinach metodę wykrywania i analizy czynników odpowiedzialnych za śmierć komórek. Metoda ta wykorzystuje prosty fakt, że do wystąpienia ekspresji GUS niezbędne są żywe komórki. Aby zapewnić wiarygodne wyniki i powtarzalność, krytyczne jest, aby kultury zawierające kasetę GUS oraz badany gen były infiltrowane w równych proporcjach. P...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rifampicyna | VWR international | IC19549001 | stok 25mg/mL w DMSO |
| 4’-hydroksy-3’,5’-dimetoksyoacetofenon (Acetosyringona) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL w DMSO (stok 1M) |
| Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy monohydrat (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki do infiltracji |
| Bacto-tryptona | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB |
| Bacto-ekstrakt drożdżowy | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB |
| Chlorek sodu | VWR international | EM-7710 | 10g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB |
| Fosforan sodu jednopodstawny monohydrat | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L w wodzie do przygotowania 50mM buforu NaPi |
| Fosforan sodu dwupodstawny heptahydrat | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L w wodzie do przygotowania 50mM buforu NaPi |
| Siarczan magnezu heptahydrat | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki do infiltracji |
| N-lauroylosarkozyna | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v w buforze GUS |
| Sól cykloheksyloamoniowa 5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-D-glukuronidu (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL w metanolu 100% |
| Hydrat 4-metyloumbellyferylowego-μ-D-glukuronidu (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM w 100 uL buforu do ekstrakcji GUS |
| Ferrocyjanek potasu trihydrat | VWR international | EM-PX1460-1 | stok 100mM do roztworu substratu X-gluc |
| β-metyloumbellyferon (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | Do krzywej wzorcowej MU użyć buforu do ekstrakcji GUS |
| Węglan sodu | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M w wodzie do przygotowania buforu zatrzymującego GUS |
Bibliografia
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
