Artykuł metodologiczny

Test śmierci komórki na bazie β-glukuronidazy (GUS)

DOI:

10.3791/2680

⸱

6 maja 2011

 ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Institute for Plant Genomics and Biotechnology, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy programowanej śmierci komórki, powszechnie stosowane w systemach ssaków, takie jak drabinki DNA lub testy TUNEL, są często trudne do odtworzenia u roślin. W połączeniu z systemem reporterowym GUS proponujemy szybki, roślinny test stanów nieustalonych w celu analizy potencjalnych właściwości śmierci określonych genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nowy przejściowy system ekspresji roślin, który jednocześnie wyraża gen reporterowy, β-glukuronidazę (GUS), z przypuszczalnymi pozytywnymi lub negatywnymi regulatorami śmierci komórki. W tym systemie liście N. benthamiana są infiltrowane za pomocą kasety ekspresyjnej sterowanej 35S zawierającej gen, który ma być analizowany, oraz wektora GUS pCAMBIA 2301 przy użyciu szczepu Agrobacterium LBA4404 jako nośnika. Ponieważ żywe komórki są niezbędne do wystąpienia ekspresji GUS, utrata aktywności GUS jest oczekiwana, gdy ten gen markerowy ulega koekspresji z dodatnimi regulatorami śmierci komórki. Podobnie zwiększoną aktywność GUS obserwuje się, gdy stosuje się geny antyapoptotyczne w porównaniu z kontrolą wektorową. Jak pokazano poniżej, z powodzeniem wykorzystaliśmy ten system w naszym laboratorium do analizy graczy zarówno pro-, jak i przeciw śmierci. Należą do nich roślinna rodzina antyapoptotycznych Bcl-2 Associated athanoGene (BAG), a także znane ssacze indukujące śmierć komórki, takie jak BAX. Dodatkowo wykorzystaliśmy ten system do analizy funkcji śmierci określonych obcięć w białkach, co może dostarczyć wskazówek na temat możliwej modyfikacji/aktywacji tych białek po translacji. W tym artykule przedstawiamy szybką i czułą metodę opartą na roślinach, jako pierwszy krok w badaniu funkcji śmierci określonych genów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny Nicotiana benthamiana są uprawiane w komorze wzrostu o kontrolowanej temperaturze 25°C. Stosuje się w pełni rozwinięte zdrowe liście 3-6 tygodniowych roślin.

Porada: Lepsze wyniki uzyskuje się, używając nowo wschodzących liści

1. Protokół przejściowej infiltracji Agrobacterium:

Dzień 1

  1. Płytki agarowe Streak LB/ryfampicyna (25 μg/ml)/kanamycyna (100 μg/ml) z zapasami glicerolu Agrobacterium tumefaciens (szczep LBA4404) zawierającymi odpowiednie wektory z genem (genami), który ma być oznaczony pod kątem śmierci komórki i wektorem zawierającym kasetę GUS pod kons....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Często trudno jest zastosować techniki wykrywania śmierci komórkowej u roślin, które są powszechne w systemach ssaków. W połączeniu z systemem reporterowym GUS prezentujemy roślinną, czułą metodę wykrywania i analizy podmiotów śmierci komórek. Metoda ta wykorzystuje prosty fakt, że do wystąpienia ekspresji GUS potrzebne są żywe komórki. Aby zapewnić miarodajne wyniki i powtarzalność, bardzo ważne jest, aby hodowle, w których znajduje się kaseta GUS i gen, który ma być badany, były infiltrowane w równych proporcjach. Pro.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RyfampicynaVWR internationalIC1954900125 mg/ml w DMSO
4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringon)VWR internationalTCD26660,981 g/ml w DMSO (1M zapasówka)
Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy jednowodny (MES)VWRinternationalEM-61101,92 g/L w wodzie do produkcji 1 l pożywki infiltracyjnej
BaktootryptonFisher ScientificBP1421-210g/L w wodzie do przygotowania 1 L podłoża LB
Ekstrakt drożdżowy z bakto-drożdżyVWR internationalEM1.03753.05005g/L w wodzie do produkcji 1 l podłoża LB
Chlorek soduVWR internationalEM-771010g/L w wodzie do produkcji 1 l podłoża LB
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodnyVWR internationalMK-7868-122,5 g/l w wodzie do wytworzenia 50 mM buforu NaPi
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnyVWR internationalEMD-SX0715-15g/L w wodzie do wytworzenia 50mM buforu NaPi
Siarczan magnezu siedmiowodnyVWR internationalEM-MX0070-12,5 g/L w wodzie do przygotowania 1 l podłoża infiltracyjnego
N-lauroilsarkozynaVWR internationalTCL0151-500G0,1% v/v w buforze GUS
5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-D-glukuronidowa sól cykloheksyloamoniowa (X-gluc)Gold BiotechnologyG1281C1mg/100uL w metanolu 100%
4-metylolumbelliferyl-μ-D-glukuronid hydrat (MUG)Sigma-AldrichM56642 mM w 100 uL buforu ekstrakcyjnego GUS
Żelazocyjanek potasu trójwodnyVWR internationalEM-PX1460-1100mM zapas do roztworu substratu X-gluc
β-Methylumbelliferone(MU)Sigma-AldrichM1381Do standardowej krzywej MU użyj buforu ekstrakcyjnego GUS
Węglan soduVWR internationalEM-SX0395-110,2 M w wodzie do wytwarzania bufora zatrzymującego GUS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
  2. Nishihara, M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System raportuj cy GUSinfiltracja Agrobacteriumbarwienie histochemiczneanalizy fluorometryczneNicotiana benthamianapromotor 35Spomiar aktywno ci GUSanaliza trunkacji bia ekprzej ciowa ekspresja w ro linach

Powiązane artykuły