Test śmierci komórki na bazie β-glukuronidazy (GUS)

Summary

Testy programowanej śmierci komórki, powszechnie stosowane w systemach ssaków, takie jak drabinki DNA lub testy TUNEL, są często trudne do odtworzenia u roślin. W połączeniu z systemem reporterowym GUS proponujemy szybki, roślinny test stanów nieustalonych w celu analizy potencjalnych właściwości śmierci określonych genów.

Abstract

Opracowaliśmy nowy przejściowy system ekspresji roślin, który jednocześnie wyraża gen reporterowy, β-glukuronidazę (GUS), z przypuszczalnymi pozytywnymi lub negatywnymi regulatorami śmierci komórki. W tym systemie liście N. benthamiana są infiltrowane za pomocą kasety ekspresyjnej sterowanej 35S zawierającej gen, który ma być analizowany, oraz wektora GUS pCAMBIA 2301 przy użyciu szczepu Agrobacterium LBA4404 jako nośnika. Ponieważ żywe komórki są niezbędne do wystąpienia ekspresji GUS, utrata aktywności GUS jest oczekiwana, gdy ten gen markerowy ulega koekspresji z dodatnimi regulatorami śmierci komórki. Podobnie zwiększoną aktywność GUS obserwuje się, gdy stosuje się geny antyapoptotyczne w porównaniu z kontrolą wektorową. Jak pokazano poniżej, z powodzeniem wykorzystaliśmy ten system w naszym laboratorium do analizy graczy zarówno pro-, jak i przeciw śmierci. Należą do nich roślinna rodzina antyapoptotycznych Bcl-2 Associated athanoGene (BAG), a także znane ssacze indukujące śmierć komórki, takie jak BAX. Dodatkowo wykorzystaliśmy ten system do analizy funkcji śmierci określonych obcięć w białkach, co może dostarczyć wskazówek na temat możliwej modyfikacji/aktywacji tych białek po translacji. W tym artykule przedstawiamy szybką i czułą metodę opartą na roślinach, jako pierwszy krok w badaniu funkcji śmierci określonych genów.

Protocol

Rośliny Nicotiana benthamiana są uprawiane w komorze wzrostu o kontrolowanej temperaturze 25°C. Stosuje się w pełni rozwinięte zdrowe liście 3-6 tygodniowych roślin.

Porada: Lepsze wyniki uzyskuje się, używając nowo wschodzących liści

1. Protokół przejściowej infiltracji Agrobacterium:

Dzień 1

1. Płytki agarowe Streak LB/ryfampicyna (25 μg/ml)/kanamycyna (100 μg/ml) z zapasami glicerolu Agrobacterium tumefaciens (szczep LBA4404) zawierającymi odpowiednie wektory z genem (genami), który ma być oznaczony pod kątem śmierci komórki i wektorem zawierającym kasetę GUS pod kons....

Discussion

Często trudno jest zastosować techniki wykrywania śmierci komórkowej u roślin, które są powszechne w systemach ssaków. W połączeniu z systemem reporterowym GUS prezentujemy roślinną, czułą metodę wykrywania i analizy podmiotów śmierci komórek. Metoda ta wykorzystuje prosty fakt, że do wystąpienia ekspresji GUS potrzebne są żywe komórki. Aby zapewnić miarodajne wyniki i powtarzalność, bardzo ważne jest, aby hodowle, w których znajduje się kaseta GUS i gen, który ma być badany, były infiltrowane w równych proporcjach. Pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ryfampicyna	VWR international	IC19549001	25 mg/ml w DMSO
4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringon)	VWR international	TCD2666	0,981 g/ml w DMSO (1M zapasówka)
Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy jednowodny (MES)VWR	international	EM-6110	1,92 g/L w wodzie do produkcji 1 l pożywki infiltracyjnej
Baktootrypton	Fisher Scientific	BP1421-2	10g/L w wodzie do przygotowania 1 L podłoża LB
Ekstrakt drożdżowy z bakto-drożdży	VWR international	EM1.03753.0500	5g/L w wodzie do produkcji 1 l podłoża LB
Chlorek sodu	VWR international	EM-7710	10g/L w wodzie do produkcji 1 l podłoża LB
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny	VWR international	MK-7868-12	2,5 g/l w wodzie do wytworzenia 50 mM buforu NaPi
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny	VWR international	EMD-SX0715-1	5g/L w wodzie do wytworzenia 50mM buforu NaPi
Siarczan magnezu siedmiowodny	VWR international	EM-MX0070-1	2,5 g/L w wodzie do przygotowania 1 l podłoża infiltracyjnego
N-lauroilsarkozyna	VWR international	TCL0151-500G	0,1% v/v w buforze GUS
5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-D-glukuronidowa sól cykloheksyloamoniowa (X-gluc)	Gold Biotechnology	G1281C	1mg/100uL w metanolu 100%
4-metylolumbelliferyl-μ-D-glukuronid hydrat (MUG)	Sigma-Aldrich	M5664	2 mM w 100 uL buforu ekstrakcyjnego GUS
Żelazocyjanek potasu trójwodny	VWR international	EM-PX1460-1	100mM zapas do roztworu substratu X-gluc
β-Methylumbelliferone(MU)	Sigma-Aldrich	M1381	Do standardowej krzywej MU użyj buforu ekstrakcyjnego GUS
Węglan sodu	VWR international	EM-SX0395-11	0,2 M w wodzie do wytwarzania bufora zatrzymującego GUS