Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Homeostatyczne utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych komórek bez zaburzania funkcji bariery. Nasze badania wykazały, że obumierające komórki wysyłają sygnały do żyjących sąsiadów, aby utworzyli i skurczyli pierścień z aktyny i miozyny, który wyrzuca komórkę z płata nabłonka, jednocześnie zamykając wszelkie luki, które mogły powstać w wyniku jej usunięcia; proces ten nazywa się ekstruzją komórkową1. Przezroczystość optyczna rozwijających się danio pręgowanych stanowi doskonały system do wizualizacji ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę indukowania i obrazowania ekstruzji w naskórku larw danio pręgowanych. Aby zwizualizować ekstruzję, wstrzykujemy sondę znakowaną czerwonym białkiem fluorescencyjnym przeciwko F-aktynie do transgenicznych embrionów danio pręgowanych w stadium jednej komórki, które wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w naskórku, a następnie indukujemy apoptozę poprzez dodanie G418 do larw. Następnie wykorzystujemy obrazowanie poklatkowe (time-lapse) na konfokalnym mikroskopie z dyskiem obrotowym, aby obserwować dynamikę aktyny i zachowanie komórek nabłonkowych podczas procesu ekstruzji komórek apoptotycznych. Podejście to pozwala nam badać proces ekstruzji w żywych nabłonkach i otworzy drogę do badania stanów chorobowych spowodowanych niezdolnością do eliminacji komórek apoptotycznych.
Protokół
Podstawowy schemat postępowania w wizualizacji dynamiki aktyny podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego
Epidermis rozwijającego się danio pręgowanego składa się z dwóch odrębnych warstw: warstwy powierzchniowej (perydermy) oraz warstwy podstawnej komórek, które kontaktują się z błoną podstawną2. Komórki zewnętrznej warstwy powierzchniowej ulegają apoptozie i są usuwane z tkanki poprzez ekstruzję3 (Ryc. 1). Aby zwizualizować ten proces w czasie rzeczywistym, wstrzykujemy do zarodków transgenicznych danio pręgowanego na etapie jednej komórki, wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod promotorem cytokeratyny 8 dla nabłonka wielowarstwowego6, RNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z domeną homologii kalponiny utrofiny, białka wiążącego aktynę (RFP-UtrCH) 4,5 (Ryc. 2A). Chociaż po wstrzyknięciu RNA białko RFP-UtrCH jest wyrażane powszechnie w całym organizmie, skupiamy się na powierzchniowych komórkach epidermy wykazujących ekspresję zarówno RFP, jak i GFP, aby śledzić dynamikę aktyny specyficznie w naskórku (Ryc. 2B). Następnie traktujemy larwy G418, aby wywołać apoptotyczną ekstruzję komórek, a następnie obrazujemy epidermis i filamenty aktynowe przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym i pozyskujemy zbiory danych 4D.
Przed rozpoczęciem eksperymentu
- Przeprowadź transkrypcję RNA in vitro z linearyzowanego matrycowego DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine SP6 (Ambion), a następnie oczyść RNA z czapeczką za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Rozcieńcz RNA do stężenia ˜60ng/ul w sterylnej wodzie, przygotuj aliquoty po 3-5μl i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu wstrzyknięcia. Uwaga: Unikaj wielokrotnego zamrażania i odmrażania, aby zapobiec degradacji RNA.
- Przygotuj formę do unieruchamiania embrionów podczas wstrzykiwania, wlewając 40mL 2% agarozy w podłożu E3 dla embrionów (E3) do płytki hodowlanej 10 x 15mm i umieszczając w niej formę do mikroiniekcji (Adaptive Science Tools, # I-34). Po zestaleniu się agarozy wyjmij formę, aby odsłonić wgłębienia w agarozie. Przechowuj płytkę w temperaturze 4°C do momentu użycia.
- Wytraw igły kapilarne do wstrzykiwania z borokrztalowego szkła z włóknami (OD 1.0mm, ID 0.78, długość 10cm) za pomocą wyciągacza pipet Sutter P-97 przy następujących ustawieniach (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay/Time 90, Pressure 20). Uwaga: Różne rodzaje szkła będą wymagały optymalizacji wymienionych parametrów.
- Przygotuj 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (Low Melt, LM) w podłożu E3 i przechowuj aliquoty po 1mL w temperaturze 42°C. Należy zachować ostrożność, ponieważ odparowanie E3 z zapasów może zwiększyć stężenie agarozy.
- Utrzymuj dorosłe rybki danio w standardowych warunkach laboratoryjnych, z regularnym cyklem światła i ciemności: 14 godzin światła i 10 godzin ciemności7. Wieczorem, dzień przed eksperymentem, przygotuj ryby do rozrodu, umieszczając 3 samice i 2 samce w zbiorniku przedzielonym przegrodą. Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku i usuń przegrodę w momencie zapalenia świateł.
1. Iniekcja RNA kodującego białko wiążące aktynę z fluorescencyjnym znacznikiem
- Rozmrozić RNA na lodzie. Dodać czerwień fenolową 0,5% do RNA w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie RNA ok. 30ng/μl, a następnie napełnić 1μl roztworu do wyciągniętej igły kapilarnej metodą wstecznego napełniania.
- Zebrać ok. 75 embrionów CK:GFP w stadium jednego komórki8 w medium E3. Przenieść zebrane embriony do formy do mikrowstrzykiwania za pomocą pipety Pasteura 5 ¾ i delikatnie ustawić embriony w rynience pęsetą FST Dumont #5. Uwaga: Należy pracować szybko, aby uniknąć wstrzyknięcia w embrion w stadium wielokomórkowym, co może prowadzić do mozaikowej ekspresji wstrzykniętego RNA.
- Pod standardowym laboratoryjnym stereomikroskopem sekcyjnym wstrzyknąć RNA do żółtka embrionów, używając mikrowstrzykiwacza z kontrolą ciśnienia (Harvard Apparatus PLI-10 Pico-Injector). Po wstrzyknięciu w embrionie powinna być widoczna czerwona kropka (czerwień fenolowa). Wstrzyknąć RNA do co najmniej 50 embrionów dla każdego eksperymentu. (Szczegółowy protokół wstrzykiwania RNA do embrionów danio przełamanego znajduje się w poprzednim protokole JoVE9).
Uwaga:
- Do wstrzykiwania RNA do embrionów w stadium jednej komórki należy użyć objętości ok. 2nl. Aby określić ilość wstrzykniętego RNA, należy wydać bolus RNA do kropli oleju mineralnego na skalibrowanym szkiełku z mikrometrem lub pod mikroskopem z wbudowaną skalą w okularach. Kropla RNA powinna mieć kształt idealnej sfery. Ilość dostarczonego materiału obliczyć za pomocą wzoru: Objętość (w nl) = 4/3πr3. Dostarczoną objętość można regulować, zmieniając ciśnienie wstrzykiwania lub czas trwania procesu w urządzeniu.
- Należy również dbać o to, aby wstrzyknąć najmniejszą ilość RNA umożliwiającą wizualizację fluoroforu, ponieważ wysokie stężenia RNA mogą być toksyczne dla rozwijającego się embrionu. W celu ustalenia odpowiedniego poziomu ekspresji przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu należy przeprowadzić badanie krzywej dawka-odpowiedź.
- Posegregować embriony, usuwając niezapłodnione lub uszkodzone jaja, a pozostałe embriony umieścić w temperaturze 28,5°C.
- Po 24 godzinach, za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego, wybrać embriony danio przełamanego wykazujące wysoki poziom fluorescencji GFP (naskórek) i RFP (aktyna). Wybrane embriony przechowywać w temperaturze 28,5°C aż do rozpoczęcia podawania leku indukującego apoptozę.
2. Indukcja ekstruzji komórek w larwach danio pręgowanego przy użyciu G418
Stwierdziliśmy, że ekspozycja na antybiotyk aminoglikozydowy G418, znany również jako Geneticin, wywołuje apoptozę i ekstruzję komórek epidermalnych w rozwijających się larwach zebrafish3 poprzez nieznany mechanizm. Co istotne, zabieg ten działa jedynie w przypadku larw w 4. dniu po zapłodnieniu i starszych. Zaobserwowaliśmy, że w dowolnym momencie w nabłonku płetwy larw zebrafish traktowanych G418 można znaleźć ˜ 5-25 ekstrudujących komórek. Ponieważ liczba apoptotycznych komórek ulegających ekstruzji może się różnić między osobnikami, zalecamy montowanie kilku ryb do obrazowania.
- Zebraikowe larwy w 4. dniu po zapłodnieniu (dpf), wykazujące fluorescencję GFP i RFP, zebrać i umieścić w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 x 10mm zawierającym 3 mililitry (mLs) medium E3. W naczyniu tej wielkości można poddać procesowi do 25 larw.
- Ostrożnie wymienić medium na 3mLs medium E3 zawierającego 1mg/mL G418 i inkubować larwy w obecności leku przez 4 godziny w temperaturze 28.5°C. Należy pamiętać, że G418 jest światłoczuły, dlatego należy zadbać o to, aby naczynie hodowlane było przykryte lub znajdowało się w ciemności.
- Usunąć medium i zastąpić je podgrzanym do 28.5°C medium E3 zawierającym 0.02% Tricaine, a następnie przystąpić do montowania larw.
3. Montowanie larw zebrafish do obrazowania
- Przenieś 3 larwy do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i usuń większość medium E3 po opadnięciu ryb na dno probówki. Ustalono, że przed zestaleniem się agarozy można poprawnie zamontować do 3 osobników.
- Używając przyciętego końcówki pipety, nanieś 120 µl 1% LM-agarozy (42°C) do probówki, wymieszaj, a następnie delikatnie nanieś mieszaninę larw i agarozy na szkiełko nakrywkowe znajdujące się na dnie naczynia hodowlanego MatTek.
- Używając uchwytu do szpilek FST z włożoną szpilką lub przymocowaną igłą wolframową, szybko ustaw larwy tak, aby leżały prosto i płasko przy szkiełku nakrywkowym naczynia MatTek.
Uwaga: Zazwyczaj najpierw używamy prostej szpilki do orientacji larw, a następnie szpilki w kształcie litery L, aby upewnić się, że przylegają one płasko do szkiełka nakrywkowego, zapobiegając jednocześnie uszkodzeniu preparatów. - Po zestaleniu się agarozy delikatnie wypełnij naczynie medium E3 zawierającym 0,02% Tricaine. Uwaga: Alternatywnie do medium E3 w naczyniu do obrazowania można dodać G418, aby kontynuować indukcję ekstruzji, choć długotrwała ekspozycja na 1 mg/mL G418 spowoduje śmierć larw.
4. Obrazowanie na żywo dynamiki aktyny i zachowań poszczególnych komórek nabłonkowych podczas ekstruzji komórkowej przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym
Stwierdziliśmy, że cały proces ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw rybek zebrafish trwa około 20 minut3. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować eksperyment obrazowania poklatkowego w celu zebrania serii płaszczyzn z w pojedynczej warstwie naskórka rybek zebrafish, aby zwizualizować proces ekstruzji. Zaobserwowaliśmy, że typowe fluorescencyjne mikroskopy szerokopolowe powodują znaczny fotobleaching filamentów aktynowych i nie pozwalają na obrazowanie poklatkowe. Dlatego, aby zmaksymalizować rozdzielczość i zapobiec fotobleachingowi, stosujemy konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem. Poniżej opisujemy, jak przygotować eksperyment przy użyciu oprogramowania Andor IQ z mikroskopem Nikon, choć omówione zasady można zastosować w podobnych konfiguracjach mikroskopowych.
- W pierwszej kolejności włącz lasery argonowy (do wzbudzenia GFP przy 488nm) i HeNe (do wzbudzenia RFP przy 561nm), mikroskop, kamerę oraz lampę epifluorescencyjną.
- W oprogramowaniu Andor IQ (wersja 1.10.1) utwórz protokół serii czasowej zawierający wybrane długości fal do obrazowania, częstotliwość odstępów między kolejnymi ujęciami oraz liczbę powtórzeń procesu akwizycji.
- Delikatnie umieść naczynie MatTek z preparatem na stole mikroskopu i używając obiektywu 20x z oświetleniem przeświecającym, ustaw ostrość na larwy.
- Przesuń obiektyw immersyjny 40X w wodzie (N.A. 0,8) do odpowiedniej pozycji. Używając tego obiektywu, możemy filmować około 20-25 komórek w jednym polu widzenia, co pozwala na śledzenie zachowań komórkowych podczas ekstruzji przy jednoczesnej rozdzielczości dynamiki aktyny wewnątrzkomórkowej. Uwaga: Te same strategie montażu i obrazowania można zastosować w mikroskopach odwróconych, przy czym należy użyć obiektywu immersyjnego 40X w wodzie z długą odległością roboczą.
- Ostrożnie nałóż kroplę wody na górną część obiektywu 40x i szybko umieść na niej naczynie MatTek. Uwaga: Jeśli problemem jest odparowywanie wody, można zastosować roztwór immersyjny Zeiss Immersol.
- Zidentyfikuj preparat, korzystając z oświetlenia fazowego lub DIC, a następnie użyj epifluorescencji 48nm, aby precyzyjnie ustawić ostrość na skórę (epidermis) wykazującą pozytywną fluorescencję GFP.
- Przełącz urządzenie w tryb skanowania konfokalnego. Odpowiednio dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów (48nm i 561nm). Należy zachować równowagę między mocą lasera a czasem ekspozycji, aby uzyskać optymalną detekcję sygnału i zapobiec fotobleachingowi lub toksyczności.
- Aby zidentyfikować komórki podlegające ekstruzji, użyj epifluorescencji do wizualizacji skóry znakowanej GFP i znajdź grupę komórek ułożonych w klasyczny wzór rozety, składający się z zespołu komórek otaczających małą, okrągłą komórkę w centrum. W trybie skanowania konfokalnego widoczne powinno być również nagromadzenie aktyny znakowanej RFP w formie pierścienia wokół małej, okrągłej komórki w środku, co jest cechą charakterystyczną ekstruzji komórkowej. Po zidentyfikowaniu komórki podlegającej ekstruzji, szybko skonfiguruj mikroskop do akwizycji konfokalnych zbiorów danych 4D (X-Y-Z-Czas).
- Wyznacz górny i dolny punkt w płaszczyźnie z, aby zwizualizować pojedynczą warstwę skóry, w tym komórkę podlegającą ekstruzji, i wybierz wielkość kroku. Dla obrazowania time-lapse ustaw odstępy czasowe między ujęciami oraz liczbę powtórzeń. Przykładowo, zazwyczaj wykonujemy serię z w zakresie 5-10μm, z krokiem 1 μm, co 1-2 minuty przez okres 30 minut.
- Aby przejrzeć dane, zazwyczaj tworzymy projekcje 3D serii z i zapisujemy zbiór danych jako plik wideo zgodny z Quick Time (Apple). W ten sposób możemy wizualizować skurcz pierścienia aktynowego oraz zachowania nabłonka występujące wokół obumierającej komórki w czasie.
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Schemat ekstruzji apoptotycznej komórki. Filamenty aktynowe zaznaczono kolorem czerwonym, komórki naskórka GFP-dodatnie kolorem zielonym.
Rysunek 2. Schemat eksperymentalny. A. Schemat przebiegu eksperymentu. BEkspresja RFP-UtrCH w naskórku 4-dniowych zarodków ryb zebrafish CK:GFP.
Rysunek 3. Klatki (projekcje osi z) z filmu time-lapse przedstawiającego dynamikę aktyny na żywo podczas procesu ekstruzji komórek nabłonkowych. Strzałki wskazują pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu 2 minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół demonstruje prostą i przejrzystą metodę wizualizacji procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. Ten rodzaj eksperymentu pozwala na zbadanie subtelności dynamiki aktyny, których nie doceniano wcześniej w analizach tkanek utrwalonych, i w związku z tym uzupełnia powszechne metody immunofluorescencyjne. Protokół ten możemy zastosować w połączeniu z inhibitorami chemicznymi lub mutantami genetycznymi, aby lepiej przeanalizować proces ekstruzji oraz badać stany chorobowe związane z niezdolnością do u...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Zapewnienie dobrostanu zwierząt
Wszystkie procedury przeprowadzone w ramach niniejszego protokołu z użyciem danio pręgowanego, Danio rerio, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Utah (Zapewnienie Dobrostanu Zwierząt nr 10-07017).
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Rosenblatta za dyskusje naukowe, sugestie i uwagi. Chcielibyśmy również podziękować Mary Halloran za uprzejme udostępnienie plazmidu kodującego RFP-UtrCH oraz Davidowi Grunwaldowi za dostarczenie transgenicznych danio pręgowanych CK:GFP. Dziękujemy również Gretchen King oraz personelowi Centralized Zebrafish Resource na University of Utah za doskonałą opiekę i utrzymanie danio pręgowanych. Praca ta była finansowana z grantu NIH-NIGMS NIH Director’s New Innovator Award 1 DP2 OD002056-01 przyznanego JR. GTE otrzymała wsparcie z grantu NIH Multidisciplinary Cancer Training Program Grant 5T32 CA03247-8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Odczynnik | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Odczynnik | Ambion | AM1340 | |
| Zbiorniki do przenoszenia | Narzędzie | Thoren Aquatic Systems | ||
| Pompa do pipet | Narzędzie | Bel Art Products | F3789 | |
| Pipeta Pasteura 5 ¾ | Narzędzie | VWR international | 14672-608 | |
| Forma do mikroiniekcji | Narzędzie | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Płytka hodowlana 100x15mm | Narzędzie | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Wytoparka mikropipet Flamming/Brown | Narzędzie | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Kapilary borokrzemowe z włóknem | Narzędzie | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, długość 10cm |
| Słoik do przechowywania elektrod | Narzędzie | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Czerwień fenolowa | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% w DPBS |
| Mikroinjektor i mikromanipulator z kontrolą ciśnienia | Narzędzie | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Szalka hodowlana 35x10mm | Narzędzie | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticyna) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL w dH2O |
| Pinceta Dumont #5 | Narzędzie | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Uchwyt do pinów 12cm | Narzędzie | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Piny wkładkowe | Narzędzie | Fine Science Tools | 26007-02 i -03 | |
| Szalka hodowlana z dnem szklanym i szkiełkiem nakrywkowym 1.5 | Narzędzie | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Agaroza niskotopliwa | Odczynnik | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Trikaina | Odczynnik | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Mikroskop | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Mikroskop | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy | Mikroskop | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem | Mikroskop | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Wyposażony w głowicę z wirującym dyskiem Yokagawa |
| Kamera CCD | Kamera | Andor | DV-885-VP | Kwadratowe piksele 1002x1004x8 mikronów |
Bibliografia
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
