Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Summary

Umierające komórki są wydobywane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowane kurczenie się sąsiednich komórek bez zakłócania funkcji bariery. Przejrzystość optyczna rozwijającego się danio pręgowanego stanowi doskonały system do wizualizacji ekstruzji w żywym nabłonku. W tym miejscu opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larwy danio pręgowanego w rozdzielczości komórkowej.

Abstract

Homeostatyczne utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych komórek bez zakłócania funkcji bariery. Nasze badania wykazały, że umierające komórki wysyłają sygnały do swoich żywych sąsiadów, aby utworzyły i skurczyły pierścień aktyny i miozyny, który wyrzuca go z arkusza nabłonka, jednocześnie zamykając wszelkie luki, które mogły powstać w wyniku jego wyjścia, proces określany jako ekstruzja komórki¹. Przejrzystość optyczna rozwijającego się danio pręgowanego stanowi doskonały system do wizualizacji ekstruzji w żywym nabłonku. W tym miejscu opisujemy metodę indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larwy danio pręgowanego. Aby uwidocznić ekstruzję, wstrzykujemy znakowaną na czerwono fluorescencyjną sondę białkową dla F-aktyny do transgenicznych zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym eksprymujących zielone białko fluorescencyjne w naskórku i indukujemy apoptozę przez dodanie G418 do larw. Następnie używamy obrazowania poklatkowego na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem, aby obserwować dynamikę aktyny i zachowania komórek nabłonkowych podczas procesu apoptotycznego wytłaczania komórek. Takie podejście pozwala nam zbadać proces ekstruzji w żywym nabłonku i zapewni możliwość badania stanów chorobowych spowodowanych niepowodzeniem w eliminacji komórek apoptotycznych.

Protocol

Podstawowy przepływ pracy do wizualizacji dynamiki aktyny podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego

Naskórek rozwijającego się danio pręgowanego składa się z dwóch odrębnych warstw, warstwy powierzchniowej (lub perydermy) i podstawowej warstwy komórek które stykają się z błoną podstawną². Komórki zewnętrznej warstwy powierzchniowej ulegają apoptozie i są eliminowane z tkanki przez wytłaczanie³ (rysunek 1). Aby zobrazować ten proces w czasie rzeczywistym, wstrzykujemy RNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z domena homologii kalponiny utrofiny, białka wiążącego aktynę (RFP-UtrCH) ^4,5, do transgenicznego danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym eksprymującego białko zielonej fluorescencji (GFP) pod warstwowym promotorem nabłonka cytokeratyny 8⁶ (Figura 2A). Chociaż RFP-UtrCH ulega wszechobecnej ekspresji u zwierzęcia po wstrzyknięciu RNA, skupiamy się na powierzchownych komórkach naskórka, które wyrażają zarówno RFP, jak i GFP, aby śledzić dynamikę aktyny specyficznie w naskórku (ryc. 2B). Następnie traktujemy larwy G418 w celu wywołania apoptotycznej ekstruzji komórek i obrazujemy naskórek i włókna aktynowe za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i uzyskujemy zestawy danych 4D.

Przed rozpoczęciem eksperymentu

1. In vitro transkrybuj RNA ze zlinearyzowanej matrycy DNA za pomocą zestawu mMessage mMachine SP6 (Ambion) i oczyszczaj zakryte RNA za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Rozcieńczyć RNA do ̃60 ng / ul za pomocą sterylnej wody, przygotować 3-5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 ° C, aż będzie gotowy do wstrzyknięcia. Uwaga: Unikaj powtarzającego się zamrażania/rozmrażania, aby zapobiec degradacji RNA.
2. Wykonać formę do trzymania zarodków podczas wstrzykiwania, wlewając 40 ml 2% agarozy w pożywce dla zarodków E3 (E3) do płytki hodowlanej o wymiarach 100 x 15 mm i umieszczając formę do mikroiniekcji (Adaptive Science Tools, # I-34) w tej tacy. Gdy agaroza zastygnie, usuń pleśń, aby odsłonić koryta w Agarozy. Przechowuj płytkę w temperaturze 4°C do momentu, gdy będzie gotowa do użycia.
3. Wyciągnij igły kapilarne do wstrzykiwań za pomocą szkła borokrzemianowego z włóknami (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,78, długość 10 cm) i ściągacza do pipet Sutter P-97 przy następujących ustawieniach (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay/Time 90, Pressure 200). Uwaga: Różne rodzaje szkła będą wymagały optymalizacji wymienionych warunków.
4. Uzupełnić 1% niskotopliwą (LM) agarozę w E3 i przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze 42°C. Należy zachować ostrożność, ponieważ odparowanie E3 z zapasów może zwiększyć stężenie agarozy.
5. Dorosłe rybo pręgowany należy utrzymywać w standardowych warunkach laboratoryjnych, z regularnym cyklem światła/ciemności trwającym 14 godzin światła i 10 godzin ciemności⁷. W noc poprzedzającą eksperyment ustawiono ryby do krycia, umieszczając 3 samice i 2 samce w zbiorniku oddzielonym przegrodą. Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku i pociągnij przegrodę, gdy zapalą się światła.

1. Wstrzyknięcie RNA kodującego fluorescencyjnie oznaczone białko wiążące aktynę

1. Rozmrozić RNA na lodzie. Dodaj 0,5% czerwieni fenolowej do RNA w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie RNA ̃30ng/μl i załaduj 1 μl roztworu do ciągniętej igły kapilarnej przez napełnianie wsteczne.
2. Zebrać ̃75 1-komórkowe zarodki stadium⁸ CK:GFP w E3. Odpipetuj pobrane zarodki do formy do mikroiniekcji za pomocą pipety Pasteura 5 3/4 i delikatnie ustaw zarodki w korycie za pomocą kleszczy FST Dumont #5. Uwaga: Należy uważać, aby pracować szybko, aby uniknąć wstrzyknięcia do zarodka w stadium wielokomórkowym, co może spowodować mozaikową ekspresję wstrzykniętego RNA.
3. Pod standardowym laboratoryjnym mikroskopem stereoskopowym wstrzyknąć RNA do żółtka zarodków za pomocą mikroiniektora sterowanego ciśnieniem (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector). Po wstrzyknięciu na zarodku powinna być widoczna czerwona plamka (czerwień fenolowa). Wstrzyknij co najmniej 50 zarodków do każdego eksperymentu. (Zobacz poprzedni protokół JoVE, aby uzyskać szczegółowy protokół dotyczący wstrzykiwania RNA do zarodków danio pręgowanego⁹). Nuta:
   1. Objętość ̃2nl powinna być wykorzystana do wstrzyknięcia RNA do zarodków w stadium jednokomórkowym. Aby określić ilość wstrzykniętego RNA, należy dozować bolus RNA do kropli oleju mineralnego na skalibrowanym szkiełku mikrometrycznym lub pod mikroskopem ze skalą wbudowaną w okulary. Kropla RNA powinna być idealną kulą. Oblicz dostarczoną ilość za pomocą równania: Objętość (w nl) = 4/3πr³. Dostosuj dostarczaną objętość, zmieniając ciśnienie wtrysku lub czas na instrumencie.
   2. Należy również zachować ostrożność, aby wstrzyknąć jak najmniejszą ilość RNA, która umożliwia wizualizację fluoroforu, ponieważ wysokie stężenia RNA mogą być toksyczne dla rozwijającego się zarodka. Aby określić odpowiedni poziom ekspresji, przed rozpoczęciem eksperymentu należy przeprowadzić eksperyment z krzywą dawki.
4. Posortuj zarodki, aby usunąć wszelkie niezapłodnione lub uszkodzone komórki jajowe i umieść wszystkie pozostałe zarodki w temperaturze 28,5°C.
5. Po 24 godzinach użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby wybrać zarodki danio pręgowanego, które mają wysoki poziom fluorescencji GFP (naskórek) i RFP (aktyna). Umieść wybrane zarodki w temperaturze 28,5°C do momentu, gdy będą gotowe do rozpoczęcia leczenia farmakologicznego w celu wywołania apoptozy.

2. Indukcja ekstruzji komórek u larw danio pręgowanego za pomocą G418

Odkryliśmy, że ekspozycja na antybiotyk aminoglikozydowy G418, czyli Geneticin, powoduje apoptozę i ekstruzję komórek naskórka u rozwijających się larw danio pręgowanego³ za pomocą nieznanego mechanizmu. Co ważne, zabieg ten działa tylko na larwy, które są 4 dni po zapłodnieniu i starsze. Odkryliśmy, że ̃ 5-25 komórek można znaleźć wytłaczających się w dowolnym momencie z nabłonka płetw larwy danio pręgowanego traktowanego G418. Ponieważ ilość komórek wytłaczających apoptozę może się różnić w zależności od ryby, zalecamy zamontowanie wielu ryb do obrazowania.

1. Zbierz i umieść larwy danio pręgowanego wykazujące zarówno fluorescencję GFP, jak i RFP 4 dni po zapłodnieniu (dpf) w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 x 10 mm zawierającym 3 mililitry (ml) E3. W tej wielkości naczyniu hodowlanym można leczyć do 25 larw.
2. Ostrożnie zastąp pożywkę 3 ml E3 zawierającymi 1 mg/ml G418 i inkubuj larwy w leku przez 4 godziny w temperaturze 28,5°C. Należy pamiętać, że G418 jest wrażliwy na światło, więc należy uważać, aby naczynie hodowlane było przykryte lub w ciemności.
3. Usuń pożywkę i zastąp ją wstępnie podgrzaną pożywką E3 o temperaturze 28,5°C zawierającą 0,02% trikainy i przystąp do montowania larw.

3. Montaż larw danio pręgowanego do obrazowania

1. Przenieś 3 larwy do probówki eppendorf o pojemności 1,5 ml i usuń większość E3 po tym, jak ryba opadnie na dno probówki. Odkryliśmy, że nawet 3 zwierzęta mogą być prawidłowo zamontowane, zanim agaroza zastygnie.
2. Za pomocą przeciętej końcówki pipety odpipetuj 120 ul 1% LM-agarozy (42°C) do probówki, wymieszaj, a następnie delikatnie odpipetuj mieszaninę larw i agarozy na szkło nakrywkowe na dnie naczynia hodowlanego MatTek.
3. Za pomocą uchwytu na szpilkę FST z dołączonym kołkiem lub igłą wolframową, szybko ustaw larwy tak, aby były prosto i płasko przylegające do szkła nakrywkowego szalki MatTek.
   Uwaga: Zazwyczaj używamy prostej szpilki, aby najpierw zorientować larwy, a następnie szpilki w kształcie litery L, aby upewnić się, że przylegają płasko do szkła nakrywkowego, jednocześnie zapobiegając uszkodzeniu próbek.
4. Gdy agaroza stężeje, delikatnie napełnij naczynie E3 zawierającym 0,02% trikainy. Uwaga: Alternatywnie, G418 można dodać do E3 w naczyniu do obrazowania, aby kontynuować indukowanie ekstruzji, chociaż długotrwała ekspozycja na 1 mg / ml G418 zabije larwy.

4. Obrazowanie na żywo dynamiki aktyny i indywidualnych zachowań komórek nabłonkowych podczas ekstruzji komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem

Odkryliśmy, że cały proces ekstrakcji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw danio pręgowanego trwa około 20 minut³. Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować eksperyment z obrazowaniem poklatkowym, aby zebrać serię płaszczyzn z przez pojedynczą warstwę naskórka danio pręgowanego, aby zobrazować proces wytłaczania. Odkryliśmy, że typowe szerokokątne mikroskopy fluorescencyjne powodują znaczne fotowybielanie włókien aktynowych i nie pozwalają na obrazowanie poklatkowe. Dlatego, aby zmaksymalizować naszą rozdzielczość i zapobiec fotowybielaniu, używamy mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Poniżej opisujemy, jak skonfigurować eksperyment za pomocą oprogramowania Andor IQ z mikroskopem firmy Nikon, chociaż omówione zasady można zastosować do podobnych konfiguracji mikroskopów.

1. Najpierw włącz lasery Argon (do wzbudzenia GFP przy 488 nm) i HeNe (do wzbudzenia RFP przy 561 nm), mikroskop, kamerę i lampę epifluorescencyjną.
2. W oprogramowaniu Andor IQ (wersja 1.10.1) utwórz protokół szeregów czasowych zawierający długości fal, które chcesz zobrazować, częstotliwość interwałów między przechwytywaniem obrazu oraz liczbę powtórzeń przechwytywania.
3. Delikatnie umieść naczynie MatTek zawierające próbkę na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20x ze światłem przechodzącym, aby skupić się na larwach.
4. Przesuń obiektyw 40X zanurzony w wodzie (brak 0.8) we właściwej pozycji. Korzystając z tego celu, możemy sfilmować około 20-25 komórek na pole, co pozwala nam śledzić zachowania komórek podczas ekstruzji, jednocześnie rozwiązując subkomórkową dynamikę aktyny. Uwaga: Te same strategie montażu i obrazowania można zastosować do mikroskopów pionowych, chociaż należy użyć obiektywu 40-krotnego zanurzenia w wodzie z dużą odległością roboczą.
5. Ostrożnie umieść kroplę wody na górze obiektywu 40x i szybko umieść na nim miskę MatTek. Uwaga: Roztwór zanurzeniowy Zeiss Immersol może być również stosowany, jeśli problemem jest parowanie wody.
6. Zidentyfikuj próbkę za pomocą oświetlenia fazowego lub DIC, a następnie użyj epifluorescencji 488 nm, aby skupić się konkretnie na naskórku GFP dodatnim.
7. Przełącz na tryb skanowania konfokalnego. Dostosuj odpowiednio intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów (488 nm i 561 nm). Zadbaj o zrównoważenie mocy lasera i czasu naświetlania, aby optymalnie wykryć sygnał i zapobiec fotowybielaniu lub toksyczności.
8. Aby zidentyfikować komórki wytłaczające, użyj epifluorescencji do wizualizacji naskórka znakowanego GFP i zidentyfikuj grupę komórek w klasycznym wzorze rozety, Składa się ze zbioru komórek otaczających małą okrągłą komórkę pośrodku. Korzystając z trybu skanowania konfokalnego, powinna również nastąpić akumulacja aktyny oznaczonej znakiem RFP widocznej jako pierścień wokół małej okrągłej komórki pośrodku, co jest cechą charakterystyczną wytłaczania komórek. Po zidentyfikowaniu wyciągnięcia komórka, szybko skonfiguruj mikroskop, aby uzyskać zestawy danych konfokalnych 4D (X-Y-Z-Time).
9. Ustaw górny i dolny punkt w płaszczyźnie z, aby uwidocznić pojedynczą warstwę naskórka, w tym komórkę wytłaczającą, i wybierz rozmiar kroku. W przypadku obrazowania poklatkowego ustaw interwały przechwytywania obrazu i liczbę powtórzeń. Na przykład zazwyczaj uzyskujemy serię Z obejmującą 5-10 μm, z krokiem 1 μm, co 1-2 minuty przez 30 minut.
10. Aby wyświetlić dane, zazwyczaj wykonujemy projekcje 3D serii Z i zapisujemy zestaw danych jako plik filmowy, który jest zgodny z Quick Time (Apple). W ten sposób możemy zwizualizować skurcz pierścienia aktynowego i zachowania nabłonkowe, które zachodzą wokół umierającej komórki w czasie.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Schemat ekstruzji komórek apoptotycznych. Filamenty aktynowe są pokazane na czerwono, komórki naskórka GFP są zielone.

Rysunek 2. Eksperymentalny przepływ pracy. ZA. Schemat przepływu pracy dla eksperymentu. B. Ekspresja RFP-UtrCH w naskórku zebry 4dpf CK:GFP.

Rysunek 3. Nieruchome klatki (projekcje z) z filmu poklatkowego, który śledzi dynamikę aktyny na żywo podczas procesu wytłaczania komórek nabłonka. Strzałki oznaczają pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu 2 minut.

Discussion

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i nieskomplikowaną metodę wizualizacji procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. Ten rodzaj eksperymentu pozwala nam zbadać subtelności dynamiki aktyny, które nie były wcześniej doceniane w analizach tkanek stałych, a tym samym uzupełnia popularne metody immunofluorescencyjne. Możemy użyć tego protokołu w połączeniu z inhibitorami chemicznymi lub mutantami genetycznymi, aby lepiej analizować proces ekstruzji i badać stany chorobowe związane z nieusunięciem i usunięciem komó...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik RNeasy Mini Kit		Qiagen	74104
mMessage Zestaw mMachine SP6		Odczynnik Ambion	AM1340
Narzędzie do przekraczania zbiorników		Thoren Aquatic Systems
Narzędzie do pompowania pipet		Bel Art Products	F3789
5 ¾ Narzędzie do pipetowania Pasteura		VWR international	14672-608
Narzędzie do mikroiniekcji		Adaptacyjne narzędzia naukowe	I-34
100x15mm Narzędzie do hodowli		Fisher Scientific	08-757-12
Flamming/brązowe narzędzie do ściągania mikropipet		Sutter Instrument Co.	Model P97
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z narzędziem do żarnika		Sutter Instrument Co.	B1400-78-10	OD 1,0 mm, ID 0,78 mm, długość 10 cm
Słoik do przechowywania elektrod	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	E210
Odczynnik czerwieni fenolowej		Sigma-Aldrich	P0290	0,5% w DPBS
Sterowany ciśnieniowo mikroiniektor i narzędzie do mikromanipulatora		Aparat Harvard	PLI-100
35x10mm Narzędzie do naczyń hodowlanych		Cellstar	627-160
G418 (Geneticin)	Odczynnik	GIBCO, firmy Life Technologies	10131-035	50 mg / ml w dH20
Dumont #5 Kleszcze		Narzędzie Narzędzia do nauki precyzyjnej	11253-20
12 cm Narzędzie do mocowania szpilek		Narzędzia do nauki o	26016-12
Narzędzie do wkładania szpilek		Narzędzia do nauki o nauce	26007-02 i-03
Naczynie do hodowli ze szklanym dnem i szklanym narzędziem do szkła nakrywkowego 1,5	MatTek	Corp.	P35G-1.5-10-C
Odczynnik agarozy o niskiej temperaturze topnienia		Fisher Scientific	BP1360-100
Odczynnik	trikainowy	Sigma-Aldrich	A-5040
Mikroskop preparacyjny	Mikroskop	Leica Microsystems	MZ6
Mikroskop preparacyjny		Nikon Instruments	SMZ645
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny		Olympus Corporation	S2X12
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem		Mikroskop Nikon Instruments	Eclipse Ti	Wyposażony w kamerę CCD z głowicą z wirującym dyskiem Yokagawa
		Andor	DV-885-VP	1002x1004x8 mikronów kwadratowych pikseli