Elastomerowe rusztowania PGS w inżynierii tkanek tętniczych

Podsumowanie

Elastomerowe rusztowania PGS z komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych hodowanymi w pulsacyjnym bioreaktorze przepływowym mogą prowadzić do powstania obiecujących konstruktów tętniczych o małej średnicy z natywną produkcją ECM w stosunkowo krótkim okresie hodowli.

Streszczenie

Choroby układu krążenia są jedną z głównych przyczyn śmiertelności w USA, a zwłaszcza choroba wieńcowa wzrasta wraz ze starzeniem się populacji i wzrostem otyłości¹. Obecnie operacja pomostowania z wykorzystaniem naczyń autologicznych, przeszczepów allologicznych i przeszczepów syntetycznych jest powszechnie stosowana w substytutach tętnic². Jednak przeszczepy te mają ograniczone zastosowanie, gdy wewnętrzna średnica tętnic jest mniejsza niż 6 mm ze względu na niską dostępność, powikłania zakrzepowe, niedopasowanie zgodności i późny przerost błony wewnętrznej^3,4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, inżynieria tkankowa została z powodzeniem zastosowana jako obiecująca alternatywa dla opracowania konstruktów tętnic o małej średnicy, które są nietrombogenne, wytrzymałe i zgodne z przepisami. W kilku wcześniejszych badaniach opracowano konstrukcje tętnicze o małej średnicy o strukturze trójpłytkowej, doskonałych właściwościach mechanicznych i ciśnieniu rozrywającym porównywalnym z tętnicami natywnymi^5,6. Podczas gdy wysoka wytrzymałość na rozciąganie i ciśnienie rozrywające poprzez zwiększenie produkcji kolagenu ze sztywnego materiału lub rusztowania arkusza komórkowego, konstrukcje te nadal miały niską produkcję elastyny i podatność, co jest poważnym problemem powodującym niepowodzenie przeszczepu po implantacji. Biorąc pod uwagę te kwestie, postawiliśmy hipotezę, że biomateriał elastometryczny w połączeniu z kondycjonowaniem mechanicznym zapewni elastyczność i skuteczniej przewodzi sygnały mechaniczne do komórek naczyniowych, co zwiększa produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej i wspiera orientację komórkową.

Celem tego raportu jest wprowadzenie techniki wytwarzania porowatych rusztowań rurowych oraz dynamicznego mechanicznego warunkowania do zastosowania ich w inżynierii tkanek tętniczych. Użyliśmy biodegradowalnego elastomeru, poli(sebakanu glicerolu) (PGS)⁷ do wytwarzania porowatych rusztowań rurowych metodą fuzji soli. Dorosłe pierwotne komórki mięśni gładkich pawiana (SMC) wysiewano na światło rusztowań, które hodowano w zaprojektowanym przez nas bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym przez 3 tygodnie. Rusztowania PGS miały stałą grubość i losowo rozmieszczone makro- i mikropory. Kondycjonowanie mechaniczne z bioreaktora o przepływie pulsacyjnym wspomagało orientację SMC i zwiększało produkcję ECM na rusztowaniach. Wyniki te sugerują, że rusztowania elastomerowe i mechaniczne kondycjonowanie hodowli w bioreaktorach mogą być obiecującą metodą inżynierii tkanek tętniczych.

Protokół

1. Produkcja rusztowań rurowych

1. Przygotuj rurki szklane (długość = 70 mm, średnica zewnętrzna = 9,0 mm, grubość ścianki = 1,0 mm; Small Parts, Miramar, FL) jako forma do rusztowania.
2. Przygotować kwas hialuronowy (HA) o stężeniu 1,0 % wag. (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) rozpuszczając 100 mg kwasu hialuronowego w 10 ml wody dejonizowanej. Mieszać za pomocą rotatora przez noc, aż w roztworze nie będzie pęcherzyków powietrza.
3. Wlać 1,0% roztwór kwasu hialuronowego do górnej części szklanej rurki. Pozwól mu powoli spływać wzdłuż wewnętrznej ścianki formy. Odwróć rurkę, gdy roztwór dotrze do dna formy za pomocą rotatora i powtarzaj ten krok, aż wewnętrzna ścianka formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.
4. Po pokryciu powłoką wysuszyć wszystkie szklane rurki w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
5. Zmielić i przesiać cząstki soli (wielkość = 25-32 μm) używane jako porogeny.
6. Zamontuj szklaną rurkę (pokrytą wewnątrz 1,0% roztworem HA), trzpień (stal nierdzewna otoczona rurką PTFE), tuleję termokurczliwą (HS) i pierścień PTFE, jak opisano wcześniej⁸.
7. Dodaj cząsteczki soli o pożądanej wielkości do szklanej formy za pomocą szpatułki przez lejek z gumy silikonowej. Delikatnie postukaj w formę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie cząstek soli. Zeskrob nadmiar cząstek soli z górnej części formy za pomocą boku szpatułki.
8. Włącz inkubator do hybrydyzacji na 30 minut przed przeniesieniem formy wypełnionej solą. Wyłącz inkubator hybrydyzacji i włóż wypełnioną solą formę do inkubatora hybrydyzacji w celu stopienia soli.
9. Wyjmij formy z inkubatora do hybrydyzacji i wysusz je w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
10. Wyjmij wypełnione solą foremki z piekarnika próżniowego i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Zdejmij trzpień ze stali nierdzewnej, dociskając go w dół, przytrzymując pierścień PTFE. Jeśli trzpień jest zbyt mocno przylegający do formy, użyj szczypiec do igieł, aby go wyciągnąć. Zdejmij pierścień PTFE z dolnej części formy.
11. Wstaw foremki do piekarnika w temperaturze 120 °C na 5 minut, aby obkurczyć rękaw HS. Sprawdź, czy tuleja HS jest skurczona. Wyjmij tuleję HS z foremek wypełnionych solą i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Przechowuj formy w eksykatorze, dopóki nie zostaną użyte.
12. Przygotować roztwór PGS, rozpuszczając 3 g PGS w 15 ml tetrahydrofuranu (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) do uzyskania roztworu o stężeniu 20 % wag./obj.
13. Dodaj roztwór PGS do światła form wypełnionych solą, upuszczając go za pomocą spoidu w okapie hume. Odchyl szklaną formę o około 45° i upuść roztwór PGS do wewnętrznego światła, powoli obracając formę. Sprawdź, czy roztwór PGS spływa wzdłuż ściany pleśni. Jeśli zaobserwuje się suche miejsce, dodaj więcej roztworu.
14. Po dodaniu roztworu PGS umieść foremki w okapie hume na co najmniej 30 minut w celu odparowania THF.
15. Umieść formy w piecu próżniowym na określony czas utwardzania (np. 24/ 36/ 48 h) w temperaturze 100 mTorr i 150°C do utwardzania PGS.
16. Po utwardzeniu wyjmij foremki i umieść je w temperaturze pokojowej, aby ostygły. Zanurz każdą formę w dejonizowanej wodzie powoli w pozycji pionowej. Nie zanurzaj ich szybko w wodzie, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować rozerwanie rusztowania.
17. Ostrożnie przenieś formy do łaźni wodnej i umieść je pod kątem na 1 godzinę za pomocą silikonowej rurki, aby łatwo rozpuścić HA. Sprawdź, czy kwas hialuronowy rozpuścił się w formie. Jeśli z formy nie zostanie uwolniony kwas hialuronowy, powoli popchnij jeden koniec rusztowania za pomocą szpatułki, aby uwolnić go z formy. Powtórz ten krok na drugim końcu rusztowania i powoli potrząsaj formą w przód iw tył w łaźni wodnej. Sprawdź, czy rusztowanie jest przesunięte wewnątrz formy.
18. Ostrożnie przenieść rusztowanie do innej łaźni wodnej za pomocą mieszadła. Nie chwytaj się mocno rusztowania, ponieważ może to spowodować pęknięcie rusztowania. Umieść rusztowanie w łaźni wodnej na co najmniej 3 dni z wymianą wody, aby wypłukać cząsteczki soli.
19. Po wypłukaniu cząstek soli przenieś każde rusztowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i umieść je w pojemniku na suchy lód na 1 godzinę do zamrożenia. Włóż probówki wirówkowe do liofilizatora (wszystkie kabiny probówek muszą być otwarte) i liofilizuj je przez 2 dni.
20. Umieść wszystkie rusztowania w eksykatorze wcześniej, aż do momentu, gdy zostaną użyte.

2. Przygotowanie rusztowania do wysiewu komórek

1. Wyjmij rusztowania z eksykatora i przytnij je na 25-30 mm długości.
2. Przygotuj dwa korki z gumy silikonowej (średnica = 20 mm, grubość ścianki = 6,35 mm, średnica środkowego otworu = 3 mm) i podłącz dwie rurki z PTFE (średnica zewnętrzna = 3,97 mm, średnica wewnętrzna = 2,38 mm, grubość ścianki = 0,79 mm, długość = 60 mm i 40 mm) przez środkowe otwory każdego korka.
3. Wytnij pierścień HS o długości 1,5 mm i umieść go na jednym końcu rusztowania. Wsuń jedną rurkę PTFE (podłączony korek z gumy silikonowej) do jednego końca rusztowania tak małej, jak to możliwe.
4. Włożyć rusztowanie i rurkę PTFE do pieca w temperaturze 120 °C na 10 minut, aby skurczyć pierścień HS. Sprawdź, czy pierścień HS jest skurczony, a rusztowania są mocno połączone z rurkami PTFE.
5. Wyjmij rusztowanie i rurki PTFE i umieść je w temperaturze pokojowej, aby ostygły. Umieść zespół rurki rusztowanie-PTFE w rurce poliwęglanowej (średnica zewnętrzna = 15,5 mm, średnica wewnętrzna = 9 mm, długość = 50 mm) jako komorę bioreaktora.
6. Podłącz drugi koniec rurki PTFE do rusztowania, wykonując kroki 2.3) i 2.4).
7. Wyreguluj dwa korki z gumy silikonowej, aby przymocować ich wewnętrzne powierzchnie do obu końców rurki poliwęglanowej. Przymocuj obie zewnętrzne powierzchnie korków z gumy silikonowej do dwóch płyt ze stopu aluminium (górna i dolna; szerokość = 20 mm, długość = 70 mm, grubość = 6.35 mm). Włóż dwa pręty gwintowane do bocznego otworu płyty i przymocuj rurkę poliwęglanową (w tym rusztowanie wewnątrz) do płyt, dokręcając nakrętki skrzydełkowej na płycie.
8. Zmierz długość każdego rusztowania (długość między dwoma pierścieniami HS) i oblicz wewnętrzną powierzchnię (π x średnica wewnętrzna x długość wysiewu) każdego rusztowania do wysiewu komórek.
9. Owinąć jedną komorę bioreaktora folią aluminiową i sterylizować ją w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 30 minut. Wysterylizować każdą część (zbiornik medium, rurkę pompy, wymiennik gazowy, kolektory i zawór iglicowy) bioreaktora przez autoklawowanie w temperaturze 120 °C przez 30 minut i zmontować je w kapturze do hodowli komórkowej.
10. Wstępna obróbka i płukanie rusztowań za pomocą serii perfuzji (70, 50 i 25 % etanolu przez 1 godzinę, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; Mediatech, Herndon, VA) przez 2 godziny i pożywkę hodowlaną SMC przez 24 godziny przy użyciu pompy perystaltycznej o sile 1,0 ml/min w obiegu przepływowym.

3. Sadzenie komórek i hodowla

1. Wyizoluj pierwotne komórki mięśni gładkich tętnic (SMC) z tętnic szyjnych młodych samców pawianów (Papio Anubis) i scharakteryzuj je w dwuwymiarowej (2D) hodowli przed pasażowaniem i wysiewem, jak opisano wcześniej⁹.
2. Rozszerz SMC za pomocą pożywki MCDB 131 (Mediatech, Herndon, VA) z 10% płodową surowicą bydlęcą (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-glutaminą (Mediatech), 50 μg/ml kwasu askorbinowego (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) i roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (10 000 IU / ml penicyliny, 10 000 μg / ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B; Technologie medialne).
3. Odłącz każdą komorę bioreaktora od obwodu przepływu w bioreaktorze. Wysiewać SMC (przejście 4-6) do rusztowania o gęstości 2x10⁶ komórek/^cm2 poprzez wstrzyknięcie zawiesiny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml do światła rusztowań po odcięciu przepływu zarówno abluminalnego (wlotowego), jak i luminalnego (wylotowego).
4. Umieścić wszystkie komory bioreaktora w inkubatorze hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 °C i obracać je z prędkością 2 obr./min przez 4 godziny, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek na rusztowaniu.
5. Wyjmij komory bioreaktora z inkubatora hybrydyzacji, ponownie podłącz je do obwodu przepływu bioreaktora w kapturze. Przenieś cały system bioreaktora do inkubatora do hodowli komórkowych.
6. Podłączyć rurkę pompy (średnica wewnętrzna = 1,6 mm) do chrząstki pompy perystaltycznej i załadować świeżą pożywkę hodowlaną do zbiornika. Rozpocznij perfuzję przez ścianę (luminal do abluminal) przy 1,0 ml/min przez 15 minut, a następnie tylko przepływ światła.
7. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu i ciśnienie od 1,0 ml/min (naprężenie ścinające luminalne: 1,1 dyn/cm²) i 20 mmHg w dniu 1 do 14,2 ml/min (15,3 dyn/cm²) i 120 mmHg w dniu 21. Wymieniaj rurkę pompy (średnica wewnętrzna = 3,2 mm) w 4 dniu, a pożywkę raz w tygodniu.

4. Pobieranie tkanek i przygotowanie próbek do analizy

1. Po 21-dniowej hodowli zatrzymać pompę i clamp rurki (wlot i wylot) zbiornika pożywki. Odłącz rurkę pompy od chrząstki pompy perystaltycznej i przenieś system bioreaktora do okapu.
2. Zacisnąć rurki dolotowe i wylotowe każdej komory bioreaktora i odłączyć ją od pętli przepływu. Otwórz rurkę wlotową i przygotuj szalkę Petriego na rurce wylotowej, aby zebrać pożywkę hodowlaną wewnątrz rurki z poliwęglanu. Powoli otwórz rurkę wylotową i usuń medium z komory.
3. Odłącz igłę miernika abluminalnego i rurkę silikonową luminal od komory i odłącz aluminiowe płytki, odkręcając skrzydełkowe. Wyjmij rurkę z poliwęglanu i odłącz jeden koniec konstrukcji tkanki od rurki PTFE.
4. Przygotować szalkę Petriego wypełnioną 10 ml PBS i odłączyć drugi koniec konstrukcji od rurki PTFE. Włóż konstrukt do PBS i spłucz trzy razy.
5. Przytnij konstrukcję żyletką o długości 5 mm. Zamrozić go w temperaturze -80 °C w zamrażarce do testu biochemicznego lub przenieść do 15 ml probówki wirówkowej wypełnionej 5 ml świeżej pożywki do testów mechanicznych lub zamrozić błyskawicznie w związku o optymalnej temperaturze cięcia Tissue-Tek (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA) w celu barwienia histologicznego/immunofluorescencyjnego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rusztowania rurowe PGS zostały wykonane przy użyciu biodegradowalnego elastomeru metodą fuzji soli (Rys. 1A). Każda komora bioreaktora zapewniała rusztowania zarówno z przepływem światła, jak i abluminu i mogła być odłączona jako oddzielna jednostka od głównej pętli przepływu (rys. 1B). System bioreaktora został zaprojektowany do hodowli czterech rusztowań jednocześnie poprzez kontrolowanie i monitorowanie przepływu oraz ciśnienia (rys. 1C i D).

Schemat hodowli w bioreaktorze został pokazany na rys. 2. Po wysianiu SMC każda komora bioreaktora była obracana w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, aby równomiernie rozprowadzić komórki w świetle rusztowania. A następnie do 14 dnia zastosowano przepływ pulsacyjny na rusztowaniach ze stopniowo rosnącym natężeniem przepływu (rys. 2A) i ciśnieniem (rys. 2B). Po 14 dniu przepływ i ciśnienie utrzymywały się na stałym poziomie do końca hodowli (dzień 21).

Morfologia powierzchni rusztowania PGS została zbadana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Skaningowe mikrofotografie elektronowe wykazały, że rusztowanie miało stałą grubość ścianek (539 ± 18 μm) (rys. 3A) oraz losowo rozmieszczone makro- i mikropory na powierzchni światła (rys. 3B). Parametry morfometryczne rusztowania mierzono za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) i analizy obrazowej. Średnia wielkość porów wynosi 23,3 ± 3,9 μm, a wzajemne połączenia porów wynoszą 99,4 ± 0,62%, co oznacza, że wszystkie pory są w pełni połączone w rusztowaniu. Porowatość mierzona wypornością etanolu wynosi 75,6 ± 2,7 %.

Morfologia komórkowa konstruktu PGS została zbadana przez SEM (Ryc. 4). Wielowarstwowe SMC całkowicie pokrywały powierzchnię światła i były zorientowane prostopadle do kierunku przepływu. Wyniki te pokazują, że kondycjonowanie mechaniczne z bioreaktora o przepływie pulsacyjnym wspomaga orientację SMC w rusztowaniu.

Obecność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i włókien elastycznych badano za pomocą barwienia H&E i autofluorescencji elastyny (ryc. 5). Barwienie H&E wykazało, że komórki i białka ECM całkowicie pokrywały światło konstruktu PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obwodowo zorganizowane elastyczne włókna na powierzchni światła konstruktu. Produkcję białek ECM w konstruktach PGS mierzono na podstawie testów biochemicznych. Zawartość nierozpuszczalnej elastyny i kolagenu wynosiła odpowiednio 20,2 ± 9,1 μg/mg tkanki i 6,3 ± 1,9 μg/mg tkanki.

Rysunek 1. Produkcja rusztowań i system bioreaktorów. (A) Schemat wykonania rusztowań rurowych. (B) Komora bioreaktora. Rusztowania zostały połączone z rurkami PTFE, umieszczone w rurze poliwęglanowej i przymocowane za pomocą korków z gumy silikonowej i płyt ze stopu aluminium. Każda komora ma dwie ścieżki przepływu: luminalowy (za pomocą rurki silikonowej) i abluminalny (za pomocą igły manometru). (C) System bioreaktora umieszczony wewnątrz inkubatora. Zawiera zbiornik medium, moduł pompy perystaltycznej, wymiennik gazowy, przetworniki ciśnienia, dwa kolektory (górny i dolny) oraz zawór iglicowy. (D) System bioreaktora umieszczony na zewnątrz inkubatora. Zawiera monitor ciśnienia, jednostkę sterującą przepływem, system akwizycji danych i komputer.

Rysunek 2. Schemat hodowli w bioreaktorze. (A) Protokół hodowli. (B) Zastosowane profile nacisku w każdym punkcie czasowym (dzień 1, 4, 7 i 14).

Rysunek 3. Morfologia powierzchni rusztowania PGS. (A) Przekrój poprzeczny. (B) Lumen.

Rysunek 4. Morfologia komórkowa konstruktu PGS. (a) Lumen. (B) Przekrój poprzeczny cięcia pod kątem 45°. Strzałki na obu rysunkach reprezentują kierunek przepływu.

Rysunek 5. Histologia i autofluorescencja elastyny konstruktu PGS. (A) Barwienie H&E. (B) Odpowiednia autofluorescencja elastyny. L: światło. Powiększenie: 40X. Podziałka: 50 μm.

Dyskusja

Opisana tutaj technika wytwarzania z wykorzystaniem biodegradowalnego elastomeru ma kilka cech. (1) Użyliśmy kwasu hialuronowego (HA) jako środka do usuwania pleśni. Ponieważ kwas hialuronowy jest rozpuszczalny w wodzie, rusztowanie można było łatwo uwolnić ze szklanej formy po zanurzeniu go w wodzie. W tym raporcie użyliśmy 1,0 % wag./vol roztworu HA, ponieważ niskie stężenie (< 0,5 wag./vol%) roztworu nie jest lepkie i spływa tak szybko, gdy wylewamy go na szklane rurki. Aby równomiernie pokryć roztwór HA, odwróciliśmy szklaną rurkę, gdy roztwór spływał po dnie rurki i powtórzyliśmy ten krok. Ta powłoka HA ma kluczowe znaczenie dla naszej procedury produkcyjnej w celu uwolnienia końcowych rusztowań. (2) Użyliśmy koszulki termokurczliwej (HS) do zatrzymywania soli w szklanych rurkach. Ponieważ sole były gęsto upakowane w przestrzeni między wewnętrzną ścianką szklanej rurki a tuleją HS, tuleja HS zatrzymywała sole po usunięciu trzpienia i pierścienia PTFE na dnie rurki. Tuleję HS możemy łatwo usunąć, wkładając formę do piekarnika w temperaturze 120 °C na 5 minut, a następnie uzyskać rurkowe szablony soli. (3) Zastosowaliśmy metodę fuzji soli. Powszechnie wiadomo, że metoda fuzji soli może poprawić wzajemne połączenia porów i właściwości mechaniczne poprzez zmianę czasu topnienia¹⁰. Ponadto, ponieważ użyliśmy PGS, makropory były wytwarzane przez cząsteczki soli podczas procesu ługowania, podczas gdy mikropory były prawdopodobnie generowane przez opary glicerolu powstałe podczas utwardzania PGS, jak opisaliśmy wcześniej¹¹. W związku z tym metoda ta ma potencjał do wytwarzania porowatych rusztowań rurowych o różnych makro- i mikrostrukturach poprzez zmianę cząstek soli, a także warunków utwardzania PGS.

Kondycjonowanie mechaniczne z bioreaktora zapewniło pulsacyjną perfuzję przepływu (maksymalny średni przepływ = 14 ml/min, maksymalne naprężenie ścinające = 15,3 dyn/^cm2, częstotliwość = 0,5 - 1,7 Hz) i fizjologicznie istotne ciśnienie z rusztowaniem PGS, co doprowadziło do wzrostu i orientacji SMC (rys. 4). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami donoszącymi, że cykliczne rozciąganie przy tej częstotliwości i naprężenie ścinające zwiększa proliferację SMC¹² i produkcję białka ECM^13,14. Oprócz wzrostu i orientacji SMC, konstrukt PGS wspierał produkcję białek ECM, zwłaszcza obwodowo zorganizowanych włókien elastycznych (ryc. 5) w ciągu 3-tygodniowej hodowli w bioreaktorze. Niektóre badania z użyciem rusztowania elastomerowego jako konstruktu tętniczego o małej średnicy wykazały wytrzymałość mechaniczną i ciśnienie rozrywające porównywalne z tętnicami natywnymi¹⁵ oraz szybką integrację SMC w zgodnych rusztowaniach przy użyciu kolby obrotowej^16,17, podczas gdy w tych konstrukcjach nie znaleziono włókien elastycznych. Nasze wyniki sugerują, że cykliczne promieniowe rozprężenie z bioreaktora poprawiło bardziej efektywną transdukcję sygnału mechanicznego do SMC w rusztowaniu PGS, co prawdopodobnie przyczyniło się do syntezy i organizacji elastyny.

Ponieważ naczyniowe SMC były jedynymi komórkami, które wytwarzały białka ECM w naszym podejściu, spoczynkowy śródbłonek i poprawa wytrzymałości mechanicznej są niezbędne do opracowania klinicznie udanych konstruktów tętniczych o małej średnicy. Odnotowaliśmy, że komórki śródbłonka hodowane wspólnie z SMC generowały zlewającą się monowarstwę i wspierały ekspresję białka fenotypowego w naszych warunkach hodowli i kondycjonowaniu mechanicznym⁹. Dlatego, w oparciu o nasze podejście opisane tutaj, modyfikacja warunków eksperymentu z kokulturą byłaby kolejnym krokiem w kierunku poprawy funkcji powstałych konstruktów i wygenerowania nietrombogennego, wytrzymałego i podatnego konstruktu tętniczego podobnego do tętnic natywnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa kwasu hialuronowego	Sigma-Aldrich	H7630
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich 401757
MCDB 131	Mediatech, Inc.	15-100-CV
Surowica bydlęca płodu	Lonza Inc.	BW14-502F
L-glutamina	Mediatech, Inc.	25-005-CV
Kwas askorbinowy	Fisher Scientific	A62-500
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Mediatech, Inc.	30-004-CI
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Mediatech, Inc.	21-031-CV
Tissue-Tek mieszanka do optymalnej temperatury cięcia, 4583	Sakura Finetek	25608-930