Elastomeryczne rusztowania PGS w inżynierii tkanki tętniczej

Podsumowanie

Elastomeryczne rusztowania PGS z hodowanymi komórkami mięśni gładkich naczyń w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym mogą prowadzić do uzyskania obiecujących konstruktów tętniczych o małej średnicy z produkcją natywnej ECM w stosunkowo krótkim okresie hodowli.

Streszczenie

Choroby układu sercowo-naczyniowego są jedną z głównych przyczyn śmiertelności w USA, a w szczególności choroba wieńcowa nasila się wraz ze starzeniem się populacji i rosnącym wskaźnikiem otyłości¹. Obecnie w powszechnym użyciu jako zamienniki tętnic znajdują się operacje pomostowania z wykorzystaniem naczyń autologicznych, allograftów oraz graftów syntetycznych². Jednakże zastosowanie tych graftów jest ograniczone w przypadku tętnic o średnicy wewnętrznej mniejszej niż 6 mm ze względu na niską dostępność, powikłania zakrzepowe, niedopasowanie podatności oraz późną hiperplazję intimy^3,4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, inżynieria tkankowa została z powodzeniem zastosowana jako obiecująca alternatywa w opracowywaniu małymi średnicą konstruktów tętniczych, które są nietrombogenne, wytrzymałe i podatne. W kilku poprzednich badaniach opracowano małymi średnicą konstrukty tętnicze o strukturze trójwarstwowej, doskonałych właściwościach mechanicznych i ciśnieniu rozrywania porównywalnym z tętnicami natywnymi^5,6. Mimo uzyskania wysokiej wytrzymałości na rozciąganie i wysokiego ciśnienia rozrywania poprzez zwiększenie produkcji kolagenu z sztywnego materiału lub rusztowania z arkuszy komórkowych, konstrukty te wciąż charakteryzowały się niską produkcją elastyny i niską podatnością, co stanowi główny problem prowadzący do niepowodzenia graftu po implantacji. Biorąc pod uwagę te kwestie, postawiliśmy hipotezę, że biomateriał elastomeryczny w połączeniu z kondycjonowaniem mechanicznym zapewni elastyczność i będzie efektywniej przekazywać sygnały mechaniczne do komórek naczyniowych, co zwiększy produkcję macierzy pozakomórkowej i wesprze orientację komórkową.

Celem niniejszego raportu jest przedstawienie techniki wytwarzania porowatych rusztowań rurkowatych oraz dynamicznego warunkowania mechanicznego w celu ich zastosowania w inżynierii tkankowej tętnic. Do wytworzenia porowatych rusztowań rurkowatych metodą fuzji soli wykorzystaliśmy biodegradowalny elastomer, poli(sebacjan glicerolu) (PGS)⁷. Pierwotne komórki mięśni gładkich (SMCs) pobrane od dorosłych pawianów zasiano w świetle rusztowań, które następnie inkubowano w zaprojektowanym przez nas bioreaktorze z przepływem pulsującym przez 3 tygodnie. Rusztowania z PGS charakteryzowały się jednorodną grubością oraz losowo rozmieszczonymi makro- i mikroporami. Warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze z przepływem pulsującym wspierało orientację SMC i zwiększało produkcję ECM w rusztowaniach. Wyniki te sugerują, że rusztowania elastomerowe oraz warunkowanie mechaniczne w hodowli bioreaktorowej mogą stanowić obiecującą metodę w inżynierii tkankowej tętnic.

Protokół

1. Wytwarzanie rusztowania rurkowatego

1. Przygotować rurkę szklaną (długość = 70 mm, średnica zewnętrzna = 9,0 mm, grubość ścianki = 1,0 mm; Small Parts, Miramar, FL) jako formę do rusztowania.
2. Przygotować 1,0% (mas/obj) roztwór kwasu hialuronowego (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rozpuszczając 10 mg HA w 10 ml wody dejonizowanej. Mieszać za pomocą rotatora przez noc, aż w roztworze nie będzie pęcherzyków powietrza.
3. Wlać 1,0% roztwór HA do górnej części rurki szklanej. Pozostawić go, aby powoli spłynął po wewnętrznej ściance formy. Obrócić rurkę za pomocą rotatora, gdy roztwór dotrze do dna formy, i powtarzać ten krok, aż wewnętrzna ścianka formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.
4. Po pokryciu wysuszyć wszystkie rurki szklane w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 h.
5. Zmielić i przesiać cząsteczki soli (rozmiar = 25-32 μm) używane jako porogeny.
6. Złożyć rurkę szklaną (pokrytą wewnątrz 1,0% roztworem HA), trzpień (stal nierdzewna osłonięta rurką PTFE), tulejkę termokurczliwą (HS) oraz pierścień PTFE zgodnie z wcześniejszym opisem⁸.
7. Dodać cząsteczki soli o pożądanej wielkości do formy szklanej za pomocą szpatułki przez lejek z gumy silikonowej. Delikatnie postukać w formę, aby zapewnić równomierny rozkład cząsteczek soli. Zebrać nadmiar cząsteczek soli z górnej części formy, używając boku szpatułki.
8. Włączyć inkubator do hybrydyzacji na 30 min przed przeniesieniem formy wypełnionej solą. Wyłączyć inkubator do hybrydyzacji i umieścić formę wypełnioną solą w inkubatorze w celu stopienia soli.
9. Wyjąć formy z inkubatora do hybrydyzacji i wysuszyć je w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 h.
10. Wyjąć formy wypełnione solą z pieca próżniowego i pozwolić im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Usunąć trzpień ze stali nierdzewnej, pchając go w dół, trzymając pierścień PTFE. Jeśli trzpień przylega zbyt ciasno do formy, użyć pęsety igłowej, aby go wyciągnąć. Usunąć pierścień PTFE z dna formy.
11. Umieścić formy w piecu w temperaturze 120 °C na 5 min, aby obkurczyć tulejkę HS. Sprawdzić, czy tulejka HS została obkurczona. Usunąć tulejkę HS z form wypełnionych solą i pozwolić im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Przechowywać formy w eksykatore aż do momentu użycia.
12. Przygotować roztwór PGS, rozpuszczając 3 g PGS w 15 ml tetrahydrofuranu (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), aby uzyskać 20% (mas/obj) roztwór.
13. Dodać roztwór PGS do światła form wypełnionych solą, wkraplając go za pomocą pipety w komorze dyfuzyjnej. Przechylić szklaną formę pod kątem około 45° i wkraplać roztwór PGS do wewnętrznego światła, powoli obracając formę. Sprawdzić, czy roztwór PGS spływa po ściance formy. Jeśli zauważone zostaną suche miejsca, dodać więcej roztworu.
14. Po dodaniu roztworu PGS umieścić formy w komorze dyfuzyjnej na co najmniej 30 min w celu odparowania THF.
15. Umieścić formy w piecu próżniowym na określony czas utwardzania (np. 24/ 36/ 48 h) przy ciśnieniu 10 mTorr i temperaturze 150°C w celu utwardzenia PGS.
16. Po utwardzeniu wyjąć formy i pozostawić w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Powoli zanurzyć każdą formę w pozycji pionowej w wodzie dejonizowanej. Nie zanurzać ich w wodzie gwałtownie, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować przerwanie rusztowania.
17. Ostrożnie przenieść formy do łaźni wodnej i ustawić pod kątem na 1 h, używając rurki silikonowej, aby ułatwić rozpuszczenie HA. Sprawdzić, czy HA rozpuściło się z formy. Jeśli z formy nie uwalnia się HA, powoli pchnąć jeden koniec rusztowania szpatułką, aby uwolnić je z formy. Powtórzyć ten krok na drugim końcu rusztowania i powoli potrząsać formą w przód i w tył w łaźni wodnej. Sprawdzić, czy rusztowanie przesuwa się wewnątrz formy.
18. Ostrożnie przenieść rusztowanie do innej łaźni wodnej z mieszadłem. Nie chwytać rusztowania zbyt mocno, co mogłoby doprowadzić do jego pęknięcia. Umieścić rusztowanie w łaźni wodnej na co najmniej 3 dni, zmieniając wodę w celu wymycia cząsteczek soli.
19. Po wymyciu cząsteczek soli przenieść każde rusztowanie do probówki wirówki o pojemności 15 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i umieścić w pojemniku z suchym lodem na 1 h w celu zamrożenia. Umieścić probówki w liofilizatorze (wszystkie zakrętki probówek muszą być otwarte) i liofilizować przez 2 dni.
20. Umieścić wszystkie rusztowania w eksykatore aż do momentu ich użycia.

2. Przygotowanie rusztowania do wysiewu komórek

1. Wyjąć rusztowania z desykatora i przyciąć je do długości 25-30 mm.
2. Przygotować dwa silikonowe korki (średnica = 20 mm, grubość ścianki = 6,35 mm, średnica otworu środkowego = 3 mm) i połączyć dwie rurki PTFE (średnica zewnętrzna = 3,97 mm, średnica wewnętrzna = 2,38 mm, grubość ścianki = 0,79 mm, długość = 60 mm i 40 mm) przez otwory środkowe każdego korka.
3. Odciąć pierścień z HS o długości 1,5 mm i umieścić go na jednym końcu rusztowania. Wsunąć jedną rurkę PTFE (połączoną z silikonowym korkiem) w jeden koniec rusztowania, zachowując jak najmniejszą część nakładki.
4. Umieścić rusztowanie i rurkę PTFE w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 10 min, aby skurczyć pierścień HS. Sprawdzić, czy pierścień HS się skurczył i czy rusztowania są mocno połączone z rurką PTFE.
5. Wyjąć rusztowanie i rurkę PTFE i pozostawić je w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Umieścić zespół rusztowanie-rurka PTFE w rurce z poliwęglanu (średnica zewnętrzna = 15,5 mm, średnica wewnętrzna = 9 mm, długość = 50 mm), która będzie służyć jako komora bioreaktora.
6. Połączyć drugi koniec rurki PTFE z rusztowaniem zgodnie z krokami 2.3) i 2.4).
7. Dopasować dwa silikonowe korki tak, aby ich powierzchnie wewnętrzne przylegały do obu końców rurki z poliwęglanu. Przymocować obie powierzchnie zewnętrzne silikonowych korków do dwóch płyt ze stopu aluminium (górnej i dolnej; szerokość = 20 mm, długość = 70 mm, grubość = 6,35 mm). Włożyć dwa pręty gwintowane w otwory boczne płyt i przymocować rurkę z poliwęglanu (zawierającą wewnątrz rusztowanie) do płyt poprzez dokręcenie nakrętek motylkowych na płytach.
8. Zmierzyć długość możliwą do zasiewu każdego rusztowania (odległość między dwoma pierścieniami HS) i obliczyć powierzchnię wewnętrzną (π x średnica wewnętrzna x długość możliwa do zasiewu) każdego rusztowania w celu zasiewania komórek.
9. Owinąć jedną jednostkę komory bioreaktora folią aluminiową i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 30 min. Sterylizować każdą część bioreaktora (zbiornik na pożywkę, rurki pompy, wymiennik gazowy, kolektory i zawór iglicowy) w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 30 min i złożyć je wewnątrz komory do hodowli komórkowej.
10. Przetraktować wstępnie i przepłukać rusztowania serią perfuzji (etanol 70, 50 i 25 % przez 1 h, bufor fosforanowy (PBS; Mediatech, Herndon, VA) przez 2 h oraz pożywka hodowlana SMC przez 24 h), używając pompy perystaltycznej z przepływem 1,0 ml/min w obiegu.

3. Wysiewanie i hodowla komórek

1. Wyizolować pierwotne komórki mięśni gładkich tętnic (SMCs) z tętnic szyjnych młodych samców pawianów (Papio Anubis) i scharakteryzować je w hodowli dwuwymiarowej (2D) przed pasażowaniem i wysiewaniem zgodnie z wcześniejszym opisem⁹.
2. Namnażać SMCs, używając pożywki MCDB 131 (Mediatech, Herndon, VA) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-glutaminy (Mediatech), 50 μg/ml kwasu askorbinowego (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) oraz roztworu antybiotykowo-antymykotycznego (10 0 IU/ml penicyliny, 10 0 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B; Mediatech).
3. Odłączyć każdą komorę bioreaktora od obwodu przepływowego w bioreaktorze. Wysiać SMCs (pasaż 4-6) na rusztowanie z gęstością 2x10⁶ komórek/cm², wstrzykując zawiesinę strzykawką o pojemności 5 ml do światła rusztowań po odcięciu przepływów abluminalnego (wlotowego) i luminalnego (wylotowego).
4. Umieścić wszystkie komory bioreaktora w inkubatorze do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C i obracać je z prędkością 2 rpm przez 4 h, aby umożliwić komórkom równomierne rozprzestrzenienie się w rusztowaniu.
5. Wyjąć komory bioreaktora z inkubatora do hybrydyzacji i ponownie podłączyć je do obwodu przepływowego bioreaktora w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przenieść cały system bioreaktora do inkubatora do hodowli komórkowych.
6. Podłączyć przewody pompy (średnica wewnętrzna = 1,6 mm) do głowicy pompy perystaltycznej i napełnić zbiornik świeżą pożywką hodowlaną. Rozpocząć perfuzję przezścienną (z luminalnej na abluminalną) z prędkością 1,0 ml/min przez 15 min, a następnie kontynuować wyłącznie przepływ luminalny.
7. Stopniowo zwiększać natężenie przepływu i ciśnienie z 1,0 ml/min (naprężenie ścinające w świetle: 1,1 dynes/cm²) i 20 mmHg w dniu 1. do 14,2 ml/min (15,3 dynes/cm²) i 120 mmHg w dniu 21. Wymienić przewody pompy (średnica wewnętrzna = 3,2 mm) w 4. dniu oraz wymieniać pożywkę raz w tygodniu.

4. Pobieranie tkanek i przygotowanie próbek do analizy

1. Po 21-dniowej hodowli zatrzymać pompę i zacisnąć przewody (wlotowy i wylotowy) zbiornika z pożywką. Odłączyć przewody pompy od głowicy pompy perystaltycznej i przenieść system bioreaktora do komory z laminarnym przepływem powietrza.
2. Zacisnąć przewody wlotowe i wylotowe każdej komory bioreaktora i odłączyć je od obiegu przepływu. Otworzyć przewód wlotowy i przygotować szalkę Petriego przy przewodzie wylotowym w celu zebrania pożywki hodowlanej z wnętrza rurki poliwęglanowej. Powoli otworzyć przewód wylotowy i usunąć pożywkę z komory.
3. Odłączyć igłę cewnikową abluminalną oraz silikonowy przewód luminalny z komory, a następnie zdjąć płyty aluminiowe po poluzowaniu śrub motylkowych. Wyjąć rurkę poliwęglanową i odłączyć jeden koniec konstruktu tkankowego od przewodu PTFE.
4. Przygotować szalkę Petriego wypełnioną 10 ml PBS i odłączyć drugi koniec konstruktu od przewodu PTFE. Umieścić konstrukt w PBS i wypłukać trzykrotnie.
5. Odciąć fragment konstruktu o długości 5 mm za pomocą żyletki. Zamrozić go w zamrażarce do -80 °C w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej, przenieść do probówki wirówkowej 15 ml wypełnionej 5 ml świeżej pożywki do testów mechanicznych lub zamrozić gwałtownie w Tissue-Tek optimal cutting temperature compound (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA) do barwienia histologicznego/immunofluorescencyjnego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rurkowate rusztowania PGS zostały wykonane z biodegradowalnego elastomeru metodą fuzji soli (Rys. 1A). Każda komora bioreaktora zapewniała przepływy zarówno luminalne, jak i abluminalne, a także mogła być odłączana jako oddzielna jednostka od głównego obiegu przepływu (Rys. 1B). System bioreaktora został zaprojektowany do hodowli czterech rusztowań jednocześnie poprzez kontrolowanie i monitorowanie przepływu oraz ciśnienia (Rys. 1C i D).

Schemat hodowli w bioreaktorze przedstawiono na Rys. 2. Po zasiewie komórek SMC każda komora bioreaktora była obracana w temperaturze 37 °C przez 4 h, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki w świetle rusztowania. Następnie do rusztowań stosowano przepływ pulsacyjny do 14. dnia, stopniowo zwiększając szybkość przepływu (Rys. 2A) oraz ciśnienie (Rys. 2B). Po 14. dniu przepływ i ciśnienie utrzymywano na stałym poziomie do końca hodowli (dzień 21).

Morfologię powierzchni rusztowania PGS zbadano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Mikrografie elektronowe wykazały, że rusztowanie posiadało jednorodną grubość ścianek (539 ± 18 μm) (Rys. 3A) oraz losowo rozmieszczone makro- i mikropory na powierzchni luminalnej (Rys. 3B). Parametry morfometryczne rusztowania zmierzono za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) oraz analizy obrazu. Średnia wielkość porów wynosi 23,3 ± 3,9 μm, a ich wzajemna łączność to 9,4 ± 0,62 %, co oznacza, że wszystkie pory w rusztowaniu są w pełni połączone. Porowatość zmierzona metodą wypierania etanolu wynosi 75,6 ± 2,7 %.

Morfologię komórkową konstruktu PGS badano za pomocą SEM (Rys. 4). Wielowarstwowe SMC całkowicie pokrywały powierzchnię luminalną i były zorientowane prostopadle do kierunku przepływu. Wyniki te pokazują, że warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym sprzyja orientacji SMC w rusztowaniu.

Obecność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz włókien elastycznych zbadano za pomocą barwienia H&E oraz autofluorescencji elastyny (Rys. 5). Barwienie H&E wykazało, że komórki i białka ECM całkowicie pokrywały światło konstrukcji z PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obecność obwodowo zorganizowanych włókien elastycznych na powierzchni luminalnej konstrukcji. Produkcja białek ECM w konstrukcjach z PGS została zmierzona za pomocą analiz biochemicznych. Zawartość nierozpuszczalnej elastyny i kolagenu wynosiła odpowiednio 20,2 ± 9,1 μg/mg tkanki oraz 6,3 ± 1,9 μg/mg tkanki.

Rysunek 1. Wytwarzanie rusztowania i system bioreaktora. (A) Schemat wytwarzania rusztowania rurkowego. (B) Komora bioreaktora. Rusztowania podłączono do rurek PTFE, umieszczono w rurce z poliwęglanu i zamocowano za pomocą silikonowych korków oraz płyt ze stopu aluminium. Każda komora posiada dwie ścieżki przepływu: przepływ luminalny (poprzez rurkę silikonową) i abluminalny (poprzez igłę). (C) System bioreaktora umieszczony wewnątrz inkubatora. Obejmuje on zbiornik na medium, moduł pompy perystaltycznej, wymiennik gazowy, przetworniki ciśnienia, dwa rozdzielacze (górny i dolny) oraz zawór iglicowy. (D) System bioreaktora umieszczony na zewnątrz inkubatora. Obejmuje on monitor ciśnienia, jednostkę kontroli przepływu, system akwizycji danych oraz komputer.

Rysunek 2. Schemat hodowli w bioreaktorze. (A) Protokół hodowli. (B) Profile przyłożonego ciśnienia w poszczególnych punktach czasowych (dzień 1, 4, 7 i 14).

Rysunek 3. Morfologia powierzchni rusztowania PGS. (A) Przekrój poprzeczny. (B) Prześwit.

Rysunek 4. Morfologia komórkowa konstrukcji PGS. (A) Lumen. (B) Przekrój poprzeczny 45° przekrój. Strzałki na obu rycinach reprezentują kierunek przepływu.

Rycina 5. Histo- i autofluorescencja elastyny w konstrukcie PGS. (A) H&Barwienie E. (B) Odpowiadająca autofluorescencja elastyny. L: światło naczynia. Powiększenie: 40X. Pasek skali: 50 μm.

Dyskusja

Technika wytwarzania z wykorzystaniem biodegradowalnego elastomeru opisana w niniejszej pracy posiada kilka charakterystycznych cech. (1) Jako środek oddzielający od formy zastosowano kwas hialuronowy (HA). Ponieważ HA jest rozpuszczalny w wodzie, rusztowanie można było łatwo oddzielić od szklanej formy po namoczeniu w wodzie. W niniejszym raporcie użyto roztworu HA o stężeniu 1,0 wt/vol %, ponieważ roztwory o niskim stężeniu (< 0,5 wt/vol %) nie są lepkie i spływają zbyt szybko podczas wlewania ich na szklaną rurkę. Aby równomiernie pokryć rurkę roztworem HA, obracano szklaną rurkę, gdy roztwór spływał na jej dno, i powtarzano ten krok. Powłoka z HA jest krytycznym elementem procedury wytwarzania w kontekście uwalniania gotowych rusztowań. (2) Do utrzymania soli w szklanej rurce zastosowano termokurczliwą (HS) tulejkę. Ponieważ sole były gęsto upakowane w przestrzeni między wewnętrzną ścianką szklanej rurki a tulejką HS, tulejka ta utrzymywała sole po usunięciu trzpienia i pierścienia PTFE z dna rurki. Tulejkę HS można było łatwo usunąć, umieszczając formę w piecu w temperaturze 120 °C przez 5 min, otrzymując w ten sposób rurkowe matryce solne. (3) Zastosowano metodę fuzji soli. Jest dobrze znane, że metoda fuzji soli może poprawić łączność porów oraz właściwości mechaniczne poprzez zmianę czasu fuzji¹⁰. Ponadto, dzięki zastosowaniu PGS, makropory powstawały wskutek obecności cząstek soli podczas procesu ługowania, natomiast mikropory prawdopodobnie generowały się w wyniku parowania glicerolu podczas sieciowania PGS, co opisano wcześniej¹¹. Zatem metoda ta daje możliwość wytwarzania porowatych rurkowych rusztowań o różnych makro- i mikrostrukturach poprzez zmianę rodzaju cząstek soli oraz warunków sieciowania PGS.

Warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze zapewniło perfuzję z przepływem pulsującym (maksymalny średni przepływ = 14 ml/min, maksymalne naprężenie ścinające = 15,3 dyne/cm², częstotliwość = 0,5 - 1,7 Hz) oraz fizjologicznie istotne ciśnienie w rusztowaniu PGS, co doprowadziło do wzrostu i orientacji SMC (Rys. 4). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi, że cykliczne rozciąganie przy tej częstotliwości oraz naprężenie ścinające zwiększają proliferację SMC¹² oraz produkcję białek ECM^13,14. Oprócz wzrostu i orientacji SMC, konstrukcja z PGS wspierała produkcję białek ECM, w szczególności obwodowo zorganizowanych włókien elastycznych (Rys. 5) w ciągu 3-tygodniowej hodowli w bioreaktorze. Niektóre badania wykorzystujące elastomerowe rusztowanie jako konstrukcję tętnicy o małej średnicy wykazały wytrzymałość mechaniczną i ciśnienie rozrywania porównywalne z tętnicami natywnymi¹⁵ oraz szybką integrację SMC w elastycznych rusztowaniach z użyciem kolby z mieszadłem^16,17, przy czym w tych konstrukcjach nie stwierdzono obecności włókien elastycznych. Nasze wyniki sugerują, że cykliczne rozszerzanie radialne w bioreaktorze skuteczniej poprawiło transdukcję sygnałów mechanicznych do SMC w rusztowaniu PGS, co prawdopodobnie przyczyniło się do syntezy i organizacji elastyny.

Ponieważ w naszym podejściu naczyniowe SMC były jedynymi komórkami produkującymi białka ECM, spoczynkowe śródbłonie oraz poprawa wytrzymałości mechanicznej są niezbędne do opracowania klinicznie skutecznych konstruktów tętniczych o małej średnicy. Wykazaliśmy, że komórki śródbłonka współhodowane z SMC tworzyły konfluentną monowarstwę i wspierały ekspresję białek fenotypowych w naszych warunkach hodowli oraz kondycjonowania mechanicznego⁹. W związku z tym, w oparciu o opisane tutaj podejście, modyfikacja warunków eksperymentu współhodowli byłaby kolejnym krokiem w celu poprawy funkcji otrzymanych konstruktów oraz wytworzenia nietrombogenicznego, wytrzymałego i podatnego konstruktu tętniczego, podobnego do tętnic natywnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sód kwasu hialuronowego	Sigma-Aldrich	H7630
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
MCDB 131	Mediatech, Inc.	15-100-CV
Płodowa surowica bydlęca	Lonza Inc.	BW14-502F
L-glutamina	Mediatech, Inc.	25-005-CV
Kwas askorbinowy	Fisher Scientific	A62-500
Roztwór antybiotyk-antymykotyk	Mediatech, Inc.	30-004-CI
Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS)	Mediatech, Inc.	21-031-CV
Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583	Sakura Finetek	25608-930