Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Podsumowanie

Ogólny protokół badania inwazji komórek gospodarza przez patogen bakteryjny, skupiający się na Staphylococcus aureus oraz ludzkich komórkach śródbłonka.

Streszczenie

W niniejszej procedurze opisano sposób badania inwazji ludzkich komórek śródbłonka przez patogen bakteryjny Staphylococcus aureus. Ogólny protokół można zastosować do badania inwazji komórkowej przez praktycznie każdą bakterię zdolną do hodowli. Omówione zostaną etapy, na których można badać konkretne aspekty inwazji, takie jak rola reorganizacji aktyny lub kaweoli. Komórki gospodarza hoduje się w kolbach, a po osiągnięciu odpowiedniego stanu wysiewa do płytek 24-dołkowych zawierających szkiełka Thermanox. Zastosowanie szkiełek umożliwia późniejsze usunięcie komórek z dołków w celu zminimalizowania zakłóceń wywołanych przez białka surowicy osadzone na ściankach dołków (do których S. aureus mógłby przylegać). Bakterie hoduje się do wymaganej gęstości, a następnie płucze w celu usunięcia wydzielanych białek (np. toksyn). Szkiełka z konfluencyjnymi warstwami komórek śródbłonka przenosi się do nowych płytek 24-dołkowych zawierających świeżą pożywkę hodowlaną przed dodaniem bakterii. Następnie bakterie i komórki inkubuje się razem przez wymagany czas w 5% CO₂ w temperaturze 37°C. W przypadku S. aureus czas ten wynosi zazwyczaj od 15 do 90 minut. Szkiełka Thermanox wyjmuje się z każdego dołka i płucze w PBS, aby usunąć nieprzyległe bakterie. Jeśli celem jest ilościowe oznaczenie wszystkich powiązanych bakterii (przylegających i zinternalizowanych), szkiełka umieszcza się w nowym dołku zawierającym 0,5% Triton X-100 w PBS. Delikatne pipetowanie prowadzi do całkowitej lizy komórek, a bakterie są enumerowane poprzez rozcieńczenia seryjne i wysiew na agar. Jeśli wymagana jest liczba bakterii, które wniknęły do wnętrza komórek, szkiełka dodaje się do dołków zawierających 500 μl pożywki tkankowej uzupełnionej o gentamycynę i kontynuuje inkubację przez 1 h, co spowoduje śmierć wszystkich bakterii zewnętrznych. Następnie szkiełka można wypłukać, poddać lizie komórek i enumerować bakterie poprzez wysiew na agar, jak opisano powyżej. Jeśli eksperyment wymaga bezpośredniej wizualizacji, szkiełka można utrwalić i barwić do mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej lub konfokalnej albo przygotować do mikroskopii elektronowej.

Protokół

Poniższy protokół opisuje badanie inwazji komórek śródbłonka przez S. aureus, jednak teoretycznie może zostać wykorzystany do badania inwazji komórkowej przez każdą bakterię nadającą się do hodowli. Etapy specyficzne dla S. aureus oraz komórek śródbłonka zostały wskazane.

1. Przygotowanie bakterii

1. Hodować szczepy S. aureus przez 4-16 h (w zależności od wymaganej fazy wzrostu) w 10 ml bulionu Brain-Heart Infusion (BHI) w temperaturze 37°C w powietrzu, przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm. Warunki wzrostu te są specyficzne dla S. aureus i mogą wymagać dostosowania w przypadku innych bakterii.
2. Przemyć bakterie trzykrotnie w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM; Invitrogen) poprzez naprzemienne cykle wirowania w temperaturze pokojowej (5,000 x g, 10 min), usuwania nadsączu hodowli i resuspensji osadu bakteryjnego w równoważnej objętości DMEM. Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanej zawiesiny bakterii, którą można następnie dostosować zgodnie z potrzebami. Dla S. aureus przygotowujemy zawiesinę o OD₆₀₀ = 1, co odpowiada ~10⁹ cfu ml^-1.

2. Hodowla komórek śródbłonka

1. Hodować linię komórek śródbłonka EA.hy926 ¹ w pożywce DMEM uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS; 10%) i L-glutaminę (2 mM) w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂. Alternatywnie można zakupić pulę pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs) od firmy Lonza (Bazylea, Szwajcaria) i hodować je w podstawowej pożywce dla komórek śródbłonka uzupełnionej o 2% FBS, ekstrakt z mózgu bydlęcego (zawierający heparynę), ludzki czynnik wzrostu śródbłonka oraz hydrokortyzon w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ zgodnie z instrukcjami producenta (Lonza). Warunki wzrostu te są specyficzne dla tych komórek i mogą wymagać dostosowania dla innych typów komórek gospodarza.
2. Hodować komórki śródbłonka w kolbach T75 do uzyskania pełnej konfluencji, potwierdzonej wizualnie.
3. Przygotować płytki 24-dołkowe do umieszczenia szkiełek nakrywkowych. Do przenoszenia szkiełek nakrywkowych, które mają jedną powierzchnię matową i jedną błyszczącą, niezbędna jest precyzyjna pęseta (sterylizowana płomieniem). Umieścić szkiełka nakrywkowe w dołkach płytki 24-dołkowej powierzchnią matową skierowaną do góry, aby umożliwić przyleganie komórek.
4. Odseparować komórki z kolby T75 za pomocą 3 ml trypsyny-EDTA (0.25%) i dodać do 10 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej.
5. Dodać 500 μl resuspensji komórek do płytek 24-dołkowych zawierających szklane szkiełka nakrywkowe Thermanox. Jedna konfluentna kolba T75 zapewniła wystarczającą liczbę komórek dla dwóch płytek 24-dołkowych, co dało około 5 × 10⁵ komórek na dołek (w 500 μl pożywki).
6. Inkubować płytki przez 48 h zgodnie z powyższym opisem i potwierdzić 100% konfluencję komórek za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.
7. Przepłukać szkiełka nakrywkowe w PBS i przenieść je do nowych płytek 24-dołkowych zawierających po 490 μl DMEM z 10% FBS w każdym dołku.
8. Aby zbadać rolę konkretnych procesów metabolicznych w inwazji komórkowej, do hodowanych komórek można dodać inhibitory na 1 h przed dodaniem bakterii i utrzymywać ich stężenia podczas analizy. Na przykład, aby określić rolę reorganizacji aktyny w inwazji S. aureus do komórek śródbłonka, można dodać 50 μM cytochalazyny D; natomiast w celu zbadania roli kaweoli można dodać 5 mM metylo-β-cyklodekstryny.

3. Test inwazji

1. Do każdego dołka zawierającego wypłukaną szkiełko podstawowe z konfluencyjną warstwą komórek śródbłonka w 490 μl DMEM z dodatkiem 10% FBS, dodać 10 μl wypłukanych bakterii (co daje około 2 × 10⁷ cfu ml^-1 S. aureus).
2. Inkubować przez 15-90 minut w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂.
3. Aby zmierzyć całkowitą liczbę bakterii związanych z komórkami (adherentnych i zinternalizowanych), wypłukać szkiełka podstawowe poprzez trzykrotne zanurzenie w PBS, a następnie przenieść do nowych dołków zawierających 500 μl 0,5% Triton X-100 w PBS. Aby zapewnić pełną lizę komórek i uwolnienie wszystkich zinternalizowanych bakterii, pipetować zawartość kilka razy, kierując końcówkę pipety bezpośrednio na powierzchnię szkiełka podstawowego.
4. Oszacować liczbę bakterii poprzez wysianie zawiesiny (lub jej rozcieńczeń, jeśli jest to konieczne) na powierzchnię płytek z agar TSA. Ponieważ TX-100 lizuje wiele bakterii Gram-ujemnych, można zamiast niego użyć saponiny ².
5. Aby zmierzyć liczbę zinternalizowanych bakterii, usunąć znad każdego dołka nadsącz hodowlany zawierający niezwiązane bakterie i zastąpić go 500 μl DMEM/10% FBS uzupełnionego o 200 μg ml⁻¹ gentamycyny. W tym miejscu rutynowo stosujemy gentamycynę zamiast lizostafiny, ponieważ jest ona tańsza i pozwala na zmianę eksperymentów z użyciem różnych typów bakterii (np. gronkowców i laktokoków) bez konieczności zmiany protokołu doświadczalnego.
6. Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 60 min, aby zabić wszystkie bakterie pozakomórkowe.
7. Wypłukać szkiełka podstawowe 3 razy w PBS, poddać lizie i oszacować liczbę bakterii poprzez wysianie na TSA, zgodnie z opisem dla powyższego testu adhezji.
8. W niektórych przypadkach korzystniejsze może być wizualne policzenie liczby bakterii za pomocą mikroskopii świetlnej. W takim przypadku, specyficznie dla inwazji komórkowej S. aureus, należy użyć lizostafiny (10 μg ml⁻¹) zamiast gentamycyny, aby fizycznie zniszczyć bakterie pozakomórkowe.
9. Inkubować szkiełka podstawowe przez 20 min w temperaturze 37°C w CO₂ w roztworze lizostafiny, a następnie opłukać i utrwalić preparatem Cytopath (Cellpath).
10. Zalać szkiełka podstawowe fioletem krystalicznym (0,5%, w/v) na 5 min.
11. Opłukać w wodzie, wysuszyć na powietrzu i zamontować na szkiełkach przedmiotowych. Liczbę bakterii na mm² konfluencyjnych komórek śródbłonka można określić za pomocą mikroskopii świetlnej.

4. Reprezentatywne wyniki:

Ekspresja białek wiążących fibronektynę (FnBPA i FnBPB) na powierzchni S. aureus nadaje zdolność do wnikania do komórek śródbłonka. Niedawne prace zdefiniowały na nowo domenę wiążącą fibronektynę białka FnBPA ³. Dzikiego typu (WT) S. aureus 8325.4 wnika do komórek śródbłonka z wysoką wydajnością, podczas gdy szczep pozbawiony zarówno FnBPA, jak i B (Δfnb) wykazał znacząco obniżony poziom internalizacji (Rycina 1A). Komplementacja mutanta plazmidem kodującym fnb A bez domeny wiążącej fibronektynę (pFnR0) nie promowała wnikania (Rycina 1A). Z kolei komplementacja mutanta plazmidem kodującym cały gen fnb A (pFnBA4) przywróciła wnikanie do poziomu WT (Rycina 1A).

Rolę FnBPA w inwazji komórek śródbłonka można również zademonstrować, wykorzystując heterologiczny gospodarz ekspresyjny Lactococcus lactis. Ekspresja kodowanego w plazmidzie FnBPA w L. lactis (pRM9 ⁹) nie zwiększyła znacząco adhezji do komórek śródbłonka w porównaniu z bakteriami niewykazującymi ekspresji FnBPA (CTL) (słupki puste, Rysunek 1B). Z kolei L. lactis wykazujący ekspresję FnBPA naciekał komórki śródbłonka na znacznie wyższym poziomie niż szczep nieekspresujący (słupki wypełnione, Rysunek 1B).

Doświadczenia przeprowadzono czterokrotnie w dubletach, a wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Symbol * oznacza dane, które są statystycznie istotnie różne (p = <0.05) od wartości WT lub CTL.

Rysunek 1. Inwazja komórek śródbłonka EA. Hy926 przez S. aureus (A) lub L. lactis (B).

Dyskusja

Opisany przez nas test opiera się na metodzie ochrony gentamycyną, która jest szeroko stosowana do badania inwazji komórek gospodarza przez bakterie. Obserwacje dotyczące niezdolności gentamycyny i innych antybiotyków do zabijania bakterii wewnątrzkomórkowych zostały wykorzystane w wczesnych badaniach nad inwazją komórek gospodarza przez bakterie ^4-8. Zastosowanie płytek 24-, 48- lub nawet 96-dołkowych pozwala na wygenerowanie dużych ilości ilościowych, powtarzalnych danych w krótkim czasie i przy stosunkowo niskich kosztach. Test ten jest również atrakcyjny, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu, można go dostosować do pracy z różnymi bakteriami i komórkami oraz można go wykorzystać do badania roli procesów zarówno bakteryjnych, jak i komórek gospodarza w procesie inwazji ⁹. W rzeczywistości, od pierwszych eksperymentów, metoda ochrony gentamycyną była szeroko stosowana do pomiaru inwazji komórek gospodarza przez szereg różnych bakterii, a nawet kombinacje bakterii ^10,11. Choć podstawowe zasady pozostają takie same, zgłoszono wiele subtelnych wariacji tej metody. W niniejszym artykule opisaliśmy naszą wersję i wskazaliśmy, gdzie modyfikacje mogą być konieczne w przypadku innych bakterii lub komórek gospodarza. Podczas projektowania eksperymentu w celu pomiaru inwazji komórek gospodarza przy użyciu tego podejścia należy wziąć pod uwagę szereg istotnych kwestii:

Wrażliwość bakterii na gentamycynę. Może się to wydawać oczywiste, ale ważne jest upewnienie się, że badana bakteria jest wrażliwa na gentamycynę przy zastosowaniu odpowiedniego stężenia, temperatury oraz czasu trwania inkubacji. W przypadku braku wrażliwości można rozważyć zastosowanie innych antybiotyków ⁵. Alternatywnym podejściem może być użycie enzymów litycznych (lyzostafiny, mutanolizyny, lizozymu) ¹².

Inkubacja i inokulum. Podczas pierwszego przeprowadzania tego testu ważne jest ustalenie optymalnego czasu inkubacji oraz ilości użytego inokulum bakteryjnego. Dlatego w wstępnych eksperymentach należy zbadać zarówno adhezję, jak i inwazję w czasie (od 5 min do maksymalnie 6 h). Ważne jest również ocenić, w jaki sposób na inwazję wpływa wielokrotność infekcji (MOI; liczba bakterii na komórkę). Zazwyczaj najlepiej użyć jak najmniejszej liczby bakterii, co pozwoli zminimalizować uszkodzenia hodowanych komórek. Zastosowanie przedłużonych okresów inkubacji lub dużych inokulum może doprowadzić do przeoczenia istotnych różnic między szczepami ^9,13.

Uszkodzenia komórkowe. Ważne jest przemycie bakterii przed użyciem. Należy jednak pamiętać, że uszkodzenia komórkowe nie ograniczają się jedynie do produkcji toksyn. Inwazja bakteryjna, indukcja apoptozy oraz zaburzenie prawidłowych funkcji komórkowych mogą również powodować uszkodzenia komórek. Może to prowadzić do przenikania gentamycyny do wnętrza komórki, co skutkuje zabiciem zinternalizowanych bakterii i sprawia wrażenie, że inwazja nie miała miejsca ¹⁴.

Warunki inkubacji. Temperatura i skład pożywki hodowlanej mogą mieć istotny wpływ na inwazję. Na przykład inwazja komórek HeLa przez Streptococcus pyogenes jest zależna od obecności rozpuszczalnej fibronektyny, która zazwyczaj występuje w surowicy ¹⁵. Kolejną kwestią jest wzrost bakterii w pożywce hodowlanej w trakcie trwania eksperymentu.

Hodowla i kwantyfikacja bakterii wewnątrzkomórkowych. Chociaż TX-100 może nie zabijać bakterii wewnątrzkomórkowych, może hamować ich wzrost. W związku z tym ważne jest sprawdzenie replikacji bakterii na podłożach stałych w obecności detergentu. W przypadku wystąpienia takiego efektu, możliwe może być zastosowanie niższych stężeń detergentu lub użycie alternatywy, takiej jak saponina. Przewagą testu ochrony gentamycyną nad barwieniem fioletem krystalicznym i analizą mikroskopową jest mniejsza pracochłonność oraz możliwość wykrywania i rozróżniania subpopulacji bakterii zinternalizowanych. Na przykład S. aureus może wytwarzać zarówno typowy wariant kolonii (NCT), jak i wariant małych kolonii (SCV) ¹⁶, których nie udałoby się rozróżnić podczas mikroskopii pojedynczych komórek bakteryjnych. Przewagą barwienia fioletem krystalicznym i analizy mikroskopowej nad testem ochrony gentamycyną jest możliwość uwzględnienia agregacji komórek oraz wykrycia bakterii wewnątrzkomórkowych, które przeszły w stan „żyjących, lecz niehodowlanych” ¹⁷.

Badanie roli procesów komórek gospodarza w inwazji bakteryjnej. W wielu badaniach zastosowano inhibitory funkcji komórek gospodarza, takie jak cytochalasyna D, która zakłóca reorganizację aktyny. Badania te mogą również obejmować przeciwciała skierowane przeciwko receptorom powierzchniowym komórek oraz wyciszanie specyficznych genów za pomocą siRNA ¹⁸. Jest niezwykle ważne, aby upewnić się, że zabiegi te nie wpływają na żywotność lub przyleganie hodowlanych komórek i nie wywierają toksycznego działania na bakterie.

Kierunki przyszłych badań:

Ponieważ test ten jest zazwyczaj przeprowadzany w wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowej, teoretycznie możliwe jest jego dostosowanie do wysokoprzepustowego screeningu, co może obejmować badanie bibliotek potencjalnych inhibitorów funkcji komórkowych, środków przeciwinfekcyjnych lub antybiotyków zaprojektowanych do zwalczania bakterii wewnątrzkomórkowych. Alternatywnie takie podejście można wykorzystać do screeningu bibliotek mutantów w celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w adhezję, inwazję lub przeżycie wewnątrzkomórkowe. W niektórych przypadkach pożądanym może być uwzględnienie sił ścinających (przepływu) w systemie modelowym, na przykład podczas modelowania śródbłonka, aby dokładniej odwzorować środowisko in vivo. Obecne postępy w projektowaniu i produkcji komór przepływowych oraz mikrofluidycznych systemów hodowli komórkowej umożliwiają zastosowanie testu ochrony gentamycyną w modelach gospodarz-patogen uwzględniających siły ścinające.

Podsumowując, opisany tutaj protokół opiera się na podobnych podejściach stosowanych od wielu lat. Ma on szerokie zastosowanie w wielu typach hodowli komórkowych i gatunkach bakterii, a także pozwala na szybkie generowanie dużych ilości danych przy stosunkowo niskich kosztach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	31885-023
Wyciąg z mózgu i serca (BHI)	BioChemika	53286
F–talna surowica bydlęca	Invitrogen	10091-148
HUVECs	Lonza Inc.	CC-2519
Podstawowe medium dla komórek śródbłonkowych	Lonza Inc.	CC-3121
Ekstrakt z mózgu bydlęcego (zawierający heparynę)	Lonza Inc.	CC-4092
Ludzki czynnik wzrostu śródbłonka	Lonza Inc.	CC-4017C
Hydrokortyzon	Lonza Inc.	CC-4035C
GA-1000	Lonza Inc.	CC-4092C
Gentamycyna	Invitrogen	15710
Lizostafina	AMBI	LSPN-50
Kryształki Thermanox	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TKT-210-330P
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Cytopath	TCS Biosciences	HC8595
Fiolet krystaliczny	Sigma-Aldrich	C3886
Trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Kolby T75	Thermo Fisher Scientific, Inc.	430641
Cytochalasyna D	Sigma-Aldrich	C2618
Metylo-β-cyklodekstryna	Sigma-Aldrich	332615