Niniejszy komunikat przedstawia dane dotyczące dokładności i powtarzalności spektrofotometru UV-VIS BioSpec-nano w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Nawet przy ultra małych objętościach (1 do 2 µL) powtarzalność jest doskonała, natomiast zautomatyzowana funkcja przecierania zwiększa wydajność i minimalizuje zjawisko przeniesienia próbki, co pozwala na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Procedury oznaczania ilości kwasów nukleinowych poczyniły znaczne postępy w ciągu ostatnich trzech dekad. Biolodzy molekularni coraz częściej wymagają spójnej analizy próbek kwasów nukleinowych w małych objętościach na potrzeby swoich eksperymentów. Urządzenie BioSpec-nano stanowi potencjalne rozwiązanie problemów związanych z niedokładnymi i niepowtarzalnymi wynikami, które są nieodłączne w obecnych metodach oznaczania ilości DNA, dzięki zastosowaniu specjalistycznej optyki i czułego detektora PDA. BioSpec-nano posiada również zautomatyzowane funkcje, dzięki którym montaż, pomiar i czyszczenie są wykonywane przez instrument, co eliminuje żmudne, powtarzalne i niespójne rozmieszczanie elementu światłowodowego oraz ręczne czyszczenie.
W niniejszym badaniu przedstawiono dane dotyczące kwantyfikacji DNA i białek, a także powtarzalności i dokładności pomiarów. Zautomatyzowany kontakt z próbką oraz szybkie skanowanie umożliwiają wykonanie pomiaru w ciągu trzech sekund, co zapewnia doskonałą przepustowość. Analiza danych jest przeprowadzana przy użyciu wbudowanych funkcji oprogramowania. Formuła wykorzystywana do obliczania stężenia DNA to:
Stężenie próbki = DF · (OD260-OD320)· NACF (1)
Gdzie DF = współczynnik rozcieńczenia próbki, a NACF = współczynnik stężenia kwasów nukleinowych.
Współczynnik koncentracji kwasów nukleinowych jest ustawiany zgodnie z wybranym analitytem1.
Wyniki stężenia białka mogą być wyrażone w μg/mL lub w molach/L poprzez odpowiednie wprowadzenie wartości e280 oraz masy cząsteczkowej. Po wprowadzeniu liczby reszt Tyr, Trp oraz cysteiny (wiązanie S-S) w zakładce e280Calc, wartości współczynnika ekstynkcji są obliczane według wzoru e280 = 5500 x (reszty Trp) + 1490 x (reszty Tyr) + 125 x (wiązania S-S cysteiny). Wartość e280 jest wykorzystywana przez oprogramowanie do obliczenia stężenia.
Oprócz oznaczania stężenia kwasów nukleinowych i białek, BioSpec-nano może być wykorzystywany jako spektrofotometr ultramikroobjętościowy dla wielu innych analitów lub jako standardowy spektrofotometr przy użyciu kuwet o drodze optycznej 5 mm.
Protokół
1. Procedura oznaczania ilości DNA
- Włącz urządzenie.
- Uruchom oprogramowanie BioSpec-nano z pulpitu komputera PC.
- Kliknij zakładkę Simple Nucleic Acid -dsDNA (Rysunek 1).
- Oprogramowanie nawiąże komunikację z urządzeniem i uruchomi sekwencję inicjalizacyjną. Pozwala to zweryfikować, czy urządzenie działa zgodnie ze specyfikacją.
- Na suwaku długości drogi optycznej wybierz 0,7 lub 0,2 mm. Wybór ten określa długość drogi optycznej, na której opierane są wszystkie obliczenia.
- Następnie w oprogramowaniu BioSpec-nano kliknij Setup-Autowiping setup. Wybierz opcję 1 lub 2.
- Nanieś pipetą 2 μL (dla 0,7 mm) H2O lub buforu na postument.
- Kliknij blank lub F6, aby wykonać pomiar próbki ślepej. Przy każdym wyborze nowej długości drogi optycznej konieczne jest zarejestrowanie próbki ślepej.
- Nanieś pipetą 2 μL próbki na postument.
- Kliknij Start w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na urządzeniu. Górne okno przesuwa się, aby nawiązać kontakt z kroplą próbki. Można zaobserwować błyski lampy ksenonowej.
- Powtórz pomiar tej samej próbki 3 razy, aby określić powtarzalność.
- Wszystkie zarejestrowane dane są zapisywane jako plik .bud.
- Aby zapisać dane jako plik .pdf lub .csv, kliknij save pdf/csv lub F9. Wyniki można również zapisać jako plik .csv, korzystając z odpowiedniego wyboru w zakładce zapisu.
2. Protokół oznaczania ilości białka
- Wybierz zakładkę Protein Quantitation (Rysunek 2).
- Wprowadź współczynnik ekstynkcji e280, jeśli jest znany.
- Jeśli e280 nie jest znany, oblicz go za pomocą funkcji e280Calc.
- Wybierz 0,7 lub 0,2 mm na suwaku długości drogi optycznej.
- Kliknij Setup-Autowiping setup. Wybierz wartość 2 lub wyższą.
- Nanieś pipetą 3 μL (dla 0,2 mm) H2O lub buforu na piedestał.
- Kliknij blank lub F6, aby przeprowadzić pomiar tła.
- Nanieś pipetą 3 μL próbki białka na piedestał.
- Kliknij Start w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na urządzeniu.
- Powtórz pomiar tej samej próbki 3 razy, aby określić powtarzalność.
- Wszystkie zarejestrowane dane są zapisywane jako plik .bud.
- Aby zapisać dane jako plik .pdf lub .csv, kliknij save pdf/csv lub F9.
3. Reprezentatywne wyniki:
1. Wyniki oznaczania ilości DNA
Rysunek 3 przedstawia dane z pomiarów typowej próbki dwuniciowego DNA. Przedstawiono również obliczone stężenie oraz stosunek OD 260/280. Rysunek 4 zawiera wyniki testów powtarzalności oznaczania ilości DNA. Dane na rysunkach 3 i 4 wykazują, że wyniki są wysoce powtarzalne, co potwierdza niskie względne odchylenie standardowe wynoszące 0,26%.
Uwaga 1:
Błędy w ilościowym oznaczaniu DNA mogą wynikać z obecności składników buforu, które mogą absorbować promieniowanie w obszarze UV. Konieczne jest również stosowanie jednorodnego roztworu próbki. Ponieważ pipetowana objętość próbki wynosi zaledwie 1-2 μL, wymagane jest precyzyjne pipetowanie dokładnych objętości, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
2. Wyniki oznaczania ilości białka
Rysunek 5 przedstawia analizę stężenia białka dla BSA. Stężenie białka w μg/ mL oparto na wartości e280. Rysunek 6 przedstawia analizę powtarzalności. Względne odchylenie standardowe wynoszące 0,51% wskazuje, że BioSpec-nano precyzyjnie mierzy stężenie – nie tylko w przypadku DNA, ale również białek.
Uwaga 2: Czynniki wpływające na stężenie białka
Dokładne oznaczenie stężenia białka jest możliwe, gdy wpływ niestabilności wywołanej przez pH, bufory, temperaturę lub dodatki jest minimalny. Większość oczyszczonych białek przechodzi przez różne etapy przetwarzania; w związku z tym możliwe jest, że białko zawiera detergenty lub inne dodatki, które mogą zakłócać formowanie się kropli. W przypadku takich próbek wysoce zaleca się stosowanie kuwety kwarcowej o drodze optycznej 5 mm.
Rycina 1. Okno wyboru analitycznie mierzonego związku do oznaczania ilościowego dwuniciowego DNA
Rycina 2. Okno wyboru analitycznego dla ilościowego oznaczania nieznakowanych białek
Rysunek 3. Reprezentatywne dane dla oznaczania ilości DNA
Rycina 4. Dane dotyczące powtarzalności oznaczania ilości DNA
Rycina 5. Reprezentatywne dane dla oznaczania ilości białka
Rysunek 6. Dane dotyczące powtarzalności oznaczania ilości białka
Dyskusja
Urządzenie BioSpec-nano zostało zaprojektowane w celu rozwiązania aktualnych problemów właściwych dla metod oznaczania ilości DNA, takich jak niespójne wyniki i uciążliwa praca manualna. Każdy pomiar trwa zaledwie 3 sekundy, co pozwala doświadczonemu biologowi molekularnemu na analizę około 3-6 próbek w ciągu minuty. Unikalna funkcja wycieraczki nie tylko zwiększa przepustowość pomiarów, ale także eliminuje konieczność ręcznego czyszczenia podstawek, co skutkuje pomijalną kontaminacją krzyżową między pomiarami. Ponadto testy z wykorzystaniem zaledwie 2 przetarć dla próbek DNA zawierających 1000 ng/μL wykazały przeniesienie materiału na poziomie poniżej 2 ng/μL.
Dostępność kuwety o długości drogi optycznej 5 mm umożliwia analizę rozcieńczonych próbek kwasów nukleinowych i białek oraz rozszerza zastosowanie tego instrumentu o inne aplikacje.
Oświadczenia
Dr Suja Sukumaran jest pracownikiem firmy Shimadzu, która produkuje instrument przedstawiony w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| DNA z tymusu cielęcego | Sigma-Aldrich | ||
| Swojowa albumina surowicza | Sigma-Aldrich |
Bibliografia
- Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
Przedruki i uprawnienia
