Method Article

Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano

DOI:

10.3791/2699

⸱

February 17th, 2011

1Shimadzu, Scientific Instruments

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta wiadomość przedstawia dane na temat dokładności i odtwarzalności spektrofotometru BioSpec-nano UV-VIS do oznaczania ilościowego dsDNA i białek. Nawet w przypadku bardzo małych objętości (od 1 do 2 l) powtarzalność jest doskonała, a automatyczna funkcja wycierania poprawia przepustowość i skutkuje minimalnym przenoszeniem w celu uzyskania bardziej precyzyjnych wyników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych znacznie się rozwinęły w ciągu ostatnich trzech dekad. Coraz częściej biolodzy molekularni wymagają konsekwentnej analizy małych objętości próbek kwasów nukleinowych do swoich eksperymentów. BioSpec-nano zapewnia potencjalne rozwiązanie problemów niedokładnych, nieodtwarzalnych wyników, nieodłącznie związanych z obecnymi metodami kwantyfikacji DNA, za pomocą specjalistycznej optyki i czułego detektora PDA. BioSpec-nano ma również zautomatyzowaną funkcjonalność, dzięki której montaż, pomiar i czyszczenie są wykonywane przez urządzenie, eliminując w ten sposób żmudne, powtarzalne i niespójne umieszczanie elementu światłowodowego oraz ręczne czyszczenie.

W tym badaniu prezentowane są dane dotyczące kwantyfikacji DNA i białka, a także odtwarzalności i dokładności pomiarów. Zautomatyzowany kontakt z próbką i szybkie skanowanie umożliwiają pomiar w ciągu trzech sekund, co skutkuje doskonałą wydajnością. Analiza danych odbywa się za pomocą wbudowanych funkcji oprogramowania. Wzór stosowany do obliczania stężenia DNA jest następujący:

Stężenie próbki = DF · (OD260-OD320)· NACF (1)

Gdzie DF = współczynnik rozcieńczenia próbki, a NACF = współczynnik stężenia kwasu nukleinowego.

Współczynnik stężenia kwasu nukleinowego jest ustalany zgodnie z wybranym analitem1.

Wyniki stężenia białka mogą być wyrażone jako μg/ml lub jako mole/L, wprowadzając odpowiednio wartości e280 i masy cząsteczkowej. Gdy wartości pozostałości dla Tyr, Trp i cysteiny (wiązanie S-S) są wprowadzane w zakładce e280Calc, wartości współczynnika ekstynkcji są obliczane jako e280 = 5500 x (reszty Trp) + 1490 x (reszty Tyru) + 125 x (wiązanie S-S cysteiny). Wartość e280 jest używana przez oprogramowanie do obliczania stężenia.

Oprócz określania stężenia kwasów nukleinowych i białek, BioSpec-nano może być używany jako ultra mikroobjętościowy spektrofotometr dla wielu innych analitów lub jako standardowy spektrofotometr wykorzystujący komórki o długości ścieżki 5 mm.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Procedura oceny ilościowej DNA

  1. Włącz instrument.
  2. Otwórz oprogramowanie BioSpec-nano z pulpitu komputera.
  3. Kliknij zakładkę Prosty kwas nukleinowy -dsDNA (Rysunek 1).
  4. Oprogramowanie nawiąże komunikację z urządzeniem i uruchomi sekwencję inicjalizacji. Sprawdza to, czy instrument działa zgodnie ze specyfikacją.
  5. Wybierz 0,7 lub 0,2 mm na suwaku długości ścieżki. Spowoduje to wybranie długości ścieżki, a wszystkie obliczenia są oparte na wybranej długości ścieżki.
  6. Następnie w oprogramowaniu BioSpec-nano kliknij Konfiguracja-Konfiguracja automatycznego wycierania. Wybierz 1 lub 2.
  7. Odpipetować 2 μL (dla 0,7 mm)H2Olub bufor na cokole.
  8. Kliknij puste lub F6, aby wykonać pusty pomiar. Za każdym razem, gdy wybierana jest nowa długość ścieżki, konieczne jest nagranie pustego miejsca.
  9. Odpipetować 2 μl próbki na cokole.
  10. Kliknij Start w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na instrumencie. Górne okienko przesuwa się, aby zetknąć się z kroplą próbki. Można zaobserwować błyski ksenonowe.
  11. Powtórz tę samą próbkę 3 razy, aby określić odtwarzalność.
  12. Wszystkie zarejestrowane dane są zapisywane jako plik .bud.
  13. Aby zapisać jako plik .pdf lub .csv, kliknij przycisk Zapisz PDF/CSV lub F9. Wyniki można również zapisać jako plik .csv, korzystając z odpowiedniego wyboru w zakładce zapisywania.

2. Protokół oznaczania ilościowego białka

  1. Wybierz zakładkę Oznaczanie ilościowe białka (Rysunek 2).
  2. Wprowadź współczynnik ekstynkcji e280, jeśli jest znany.
  3. Jeśli e280 nie jest znane, oblicz je za pomocą e280Calc.
  4. Wybierz 0,7 lub 0,2 mm na suwaku długości ścieżki.
  5. Kliknij Konfiguracja-Ustawienia automatycznego wycierania. Wybierz wartość 2 lub wyższą.
  6. Odpipetować 3 μL (dla 0,2 mm)H2Olub bufor na cokole.
  7. Kliknij puste lub F6, aby wykonać pusty pomiar
    8. .
  8. Odpipetować 3 μl próbki białka na cokole.
  9. Kliknij Start w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na instrumencie.
  10. Powtórz tę samą próbkę 3 razy, aby określić odtwarzalność.
  11. Wszystkie zarejestrowane dane są zapisywane jako plik .bud
  12. Aby zapisać jako plik .pdf lub .csv, kliknij przycisk Zapisz PDF/CSV lub F9.

3. Reprezentatywne wyniki:

1. Wyniki dla oceny ilościowej DNA

Rysunek 3 pokazuje dane z pomiarów na typowej próbce dwuniciowego DNA. Pokazane jest również obliczone stężenie i stosunek OD 260/280. Rysunek 4 zawiera wyniki testów odtwarzalności dla oceny ilościowej DNA. Dane na rysunkach 3 i 4 pokazują, że wyniki są wysoce powtarzalne, co widać po niskim względnym odchyleniu standardowym wynoszącym 0,26%.

Uwaga 1:

Nieścisłość w ilościowym oznaczaniu DNA może wynikać z obecności składników buforowych, które mogą absorbować w obszarze UV. Konieczne jest również użycie jednorodnego roztworu próbki. Ponieważ ilość pipetowanej próbki wynosi tylko 1-2 μl, konieczne jest staranne pipetowanie dokładnych objętości bez wprowadzania jakichkolwiek pęcherzyków.

2. Wyniki dla oceny ilościowej białka

Rysunek 5 przedstawia analizę stężenia białka dla BSA. Stężenie białka μg/ml jest oparte na wartości e280. Rysunek 6 przedstawia analizę odtwarzalności. Ze względnego odchylenia standardowego wynoszącego 0,51% wynika, że BioSpec-nano precyzyjnie mierzy stężenie - nie tylko dla DNA, ale także dla białek.

Uwaga 2: Czynniki wpływające na stężenie białka

Dokładne określenie stężenia białka jest możliwe, gdy występują minimalne skutki niestabilności spowodowanej przez pH,, temperaturę lub dodatki. Większość oczyszczonych białek przechodzi przez różne etapy przetwarzania; W związku z tym możliwe jest, że białko może zawierać środki powierzchniowo czynne lub inne dodatki, które mogą zakłócać tworzenie się kropel. W przypadku takich próbek zdecydowanie zaleca się stosowanie ogniwa kwarcowego o długości 5 mm.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Okno wyboru analitu do ilościowego oznaczania dwuniciowego DNA

figure-protocol-2
Rysunek 2. Okno wyboru analitu do ilościowego oznaczania białek nieznakowanych

figure-protocol-3
Rysunek 3. Reprezentatywne dane do oznaczania ilościowego DNA

figure-protocol-4
Rysunek 4. Dane dotyczące odtwarzalności w celu ilościowego oznaczania DNA

figure-protocol-5
Rysunek 5. Reprezentatywne dane dotyczące oznaczania ilościowego białka

figure-protocol-6
Rysunek 6. Dane odtwarzalności w odniesieniu do oznaczania ilościowego białka

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioSpec-nano został zaprojektowany w celu rozwiązania obecnych problemów związanych z metodami kwantyfikacji DNA, takich jak niespójne wyniki i żmudna praca ręczna. Każdy pomiar trwa zaledwie 3 sekundy, co pozwala doświadczonemu biologowi molekularnemu przeanalizować około 3-6 wielokrotnych próbek w ciągu minuty. Unikalna funkcja wycieraczek nie tylko poprawia wydajność pomiaru, ale także eliminuje potrzebę ręcznego czyszczenia podstaw, co skutkuje znikomym przenoszeniem między pomiarami. Co więcej, testy z użyciem zaledwie 2 chusteczek do próbek DNA zawierających 1000 ng/μl wykazały przeniesienie mniejsze niż 2 ng/μl.

Dostępność celi o długości ścieżki 5 mm zapewnia możliwość analizy rozcieńczonych próbek kwasów nukleinowych i białek oraz rozszerza zastosowanie tego urządzenia do innych zastosowań.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Suja Sukumaran jest pracownikiem firmy Shimadzu, która wykonuje instrument opisany w tym artykule.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioSpec-nanoShimadzu Corporation
Grasica cielęca DNASigma-Aldrich
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-Aldrich

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleic Acid QuantitationProtein QuantitationMicro volume SpectrophotometerBioSpec nanoDNA ConcentrationPath Length SelectionBlank MeasurementAuto Wiping SetupReproducibility TestingConcentration Determination

Related Articles