Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Podsumowanie

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Streszczenie

Opisujemy urządzenie mikrofluidyczne z mikrożłobionymi wzorami do badania zachowania komórek. Platforma mikrofluidyczna ta składa się z górnego kanału fluidycznego i dolnej mikrożłobionej podłoża. W celu wykonania mikrożłobionych kanałów, górna forma z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierająca odciśnięte kanały mikrofluidyczne została wyrównana i połączona z mikrożłobionym podłożem. Przy użyciu tego urządzenia unieruchomiono i ukształtowano w mikrożłobionych podłożach (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) fibroblasty mysie. Aby zbadać apoptozę w urządzeniu mikrofluidycznym, do kanału fluidycznego przez 2 godziny perfundowano medium zawierające nadtlenek wodoru, Aneksynę V oraz jodek propidyny. Stwierdzono, że komórki narażone na stres oksydacyjny uległy apoptozie. Obecność tych apoptotycznych komórek potwierdzono za pomocą Aneksyny V, która wiąże się z fosfatydyloseryną w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej podczas procesu apoptozy. Przy użyciu tego urządzenia mikrofluidycznego z mikrożłobionymi wzorami proces apoptozy obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę inkubacyjną (37°C, 5% CO₂). W związku z tym urządzenie mikrofluidyczne zintegrowane z mikrożłobionymi podłożami może być użyteczne w badaniu zachowania komórek oraz w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego przesiewania leków.

Protokół

A. Mikrowytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego

1. 4-calowy wafelek krzemowy (Si) poddaje się działaniu reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).
2. Negatywny fotorezyst (SU-8 2015, Microchem, MA) nanosi się metodą spin-coatingu na wafelek Si przy 900 rpm przez 1 min.
3. Wafelek poddaje się wstępnemu wypalaniu (soft bake) w temperaturze 95°C przez 6 min na płycie grzewczej, a następnie naświetla światłem UV (200W) przez 4 min przez maskę z naniesionym wzorem mikrokanałów.
4. Wafelek poddaje się wypalaniu końcowemu (post bake) w temperaturze 95°C przez 6 min, a następnie wywołuje przy użyciu wywoływacza do fotorezystu SU-8.
5. Wzorowany fotorezystem wafelek zawierający mikrokanały umieszcza się w płytce Petriego.
6. Formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) (Sylgard 184) przygotowuje się poprzez zmieszanie elastomeru silikonowego z utwardzaczem (w stosunku 10:1).
7. Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę krzemową, a następnie umieszcza w desykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
8. PDMS utwardza się w temperaturze 70°C przez 1~2 godziny.
9. Formy PDMS odlepia się następnie od matrycy krzemowej.

B. Montaż urządzenia

1. Górne kanały fluido-dydynamiczne o grubości 40 µm oraz dolne kanały z mikrowgłębieniami o grubości 40 µm (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) zostają otrzymane z dwóch różnych form macierzystych z Si.
2. W urządzeniu fluidycznym wycinane są otwory wlotowe i wylotowe kanałów.
3. Kanały fluidyczne i kanały z mikrowgłębieniami są nieodwracalnie łączone za pomocą reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).
4. Wnętrze urządzenia mikrofluidycznego jest powlekane macierzą pozakomórkową (ECM) (tj. fibronektyną) przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).

C. Wysiew komórek i przygotowanie eksperymentu

1. Fibroblasty mysie NIH-3T3 są hodowane w kolbie do hodowli tkanek w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Komórki są trypsynizowane i dysocjowane.
3. Dysocjowane komórki są wprowadzane do kanałów z mikrorowkami przy gęstości komórek 3×10⁶ cells/ml (Rysunek 1).
   
    
      Rysunek 1
   
   
4. Do kanału za pomocą pompy strzykawkowej (1 µl/min) wprowadzane jest 2 mL pożywki, 100 mM H₂O₂ oraz zestaw do badania apoptozy (20 µL Annexin V i 40 µL jodku propidyny, Invitrogen, CA).
5. Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskobu odwróconego (Nikon TE 2000).

Dyskusja

Komórki unieruchomiono i ułożono w wzory wewnątrz mikrorowkowanych podłoży w urządzeniu mikroprzepływowym. Proces apoptozy komórek eksponowanych na nadtlenek wodoru obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano przy użyciu Annexin V oraz jodku propidyny. Zatem to urządzenie mikroprzepływowe zawierające kanały z mikrorowkami może być użyteczne w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS	Odczynnik	K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
DMEM	pożywka	Invitrogen	11965	Pożywka Dulbecco’s Modified Eagle’s
FBS	surowica	Invitrogen	10082-147	Płodowa surowica bydlęca
Nadtlenek wodoru	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H1009
Test apoptozy		Invitrogen	V13242	Aneksyna A, jodek propidyny
Negatywny fotorezyst		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Wafer krzemowy	Narzędzie			4-calowy wafer krzemowy
Reaktywna plazma tlenowa	Odczynnik	Harrick Scientific Products, Inc.		obróbka wafera przez 5 min przy 30W
mikroskop odwrócony	Narzędzie	Nikon Instruments	TE 2000