Urządzenie mikroprzepływowe z wzorami rowków do badania zachowania komórek

A. Mikrofabrykacja urządzenia mikroprzepływowego

1. 4-calowa płytka krzemowa jest traktowana reaktywną plazmą tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
2. Fotorezystor ujemny (SU-8 2015, Microchem, MA) jest powlekany wirowo z prędkością 900 obr./min przez 1 minutę na płytce Si.
3. Wafel jest miękko pieczony w temperaturze 95°C przez 6 minut na płycie grzejnej i jest wystawiony na działanie światła UV (200 W) przez 4 minuty przez folię maskującą zawierającą mikrokanaliki.
4. Wafel jest wypiekany w temperaturze 95°C przez 6 minut i wywoływany przy użyciu wywoływacza fotorezystu SU-8.
5. Wzorzysty wafel fotorezystu zawierający mikrokanaliki umieszcza się na szalce Petriego.
6. Formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) (Sylgard 184) są wytwarzane przez zmieszanie elastomeru silikonowego i utwardzacza (stosunek 10:1).
7. Mieszaninę PDMS wylewa się na formę główną Si i umieszcza na eksykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków.
8. PDMS utwardza się w temperaturze 70 °C przez 1 ~ 2 godziny.
9. Formy PDMS są następnie odklejane od formy głównej Si.

B. Montaż urządzenia

1. Górne kanały przepływowe o grubości 40 μm i dolne kanały mikrorowkowe o grubości 40 μm (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) uzyskuje się z dwóch różnych form głównych Si.
2. Kanał wlotowy i wylotowy urządzenia fluidycznego jest dziurkowany.
3. Kanały fluidyczne i kanały mikrorowkowe są nieodwracalnie połączone przez reaktywną plazmę tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
4. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) (tj. fibronektyna) jest powlekana wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).

C. Rozsiewanie komórek i konfiguracja eksperymentalna

1. Mysie fibroblasty NIH-3T3 są hodowane w kolbie do hodowli tkankowej przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Komórki są trypsynizowane i dysocjowane.
3. Zdysocjowane komórki są ładowane do kanałów mikrorowków o gęstości komórek 3×10⁶ komórek/ml (Rysunek 1).
   
    
      Rysunek 1
   
   
4. 2 ml pożywki, 100 mM H₂O₂ i test apoptozy (20 μl aneksyny V i 40 μl jodku propidyny, Invitrogen, CA) wprowadza się do kanału za pomocą pompy strzykawkowej (1 μl/min).
5. Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym za pomocą odwróconego mikroskopu (Nikon TE 2000).

Cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates in a microfluidic device. The apoptosis process of cells exposed to hydrogen peroxide was observed in real-time and analyzed by using Annexin V and propidium iodide. Thus, this microfluidic device containing microgroove channels could be useful for high-throughput drug screening.