Urządzenie mikroprzepływowe z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Summary

Opisujemy protokół produkcji urządzeń mikroprzepływowych, które umożliwiają przechwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wzorzyste mikrostruktury, takie jak rowki w kanałach mikroprzepływowych, są wykorzystywane do tworzenia obszarów o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórka może dokować.

Abstract

Opisujemy urządzenie mikroprzepływowe z mikrorowkowymi wzorami do badania zachowania komórek. Ta platforma mikroprzepływowa składa się z górnego kanału przepływowego i dolnego podłoża z mikrorowkami. Aby wytworzyć kanały z mikrorowkami, górna forma z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) zawierająca wycisk kanałów mikroprzepływowych została wyrównana i połączona z podłożem z mikrorowkami. Za pomocą tego urządzenia mysie komórki fibroblastów zostały unieruchomione i ukształtowane w mikrorowkowanych podłożach (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm). Aby zbadać apoptozę w urządzeniu mikroprzepływowym, media zawierające nadtlenek wodoru, anektynę V i jodek propidyny były perfundowane do kanału fluidycznego przez 2 godziny. Odkryliśmy, że komórki wystawione na stres oksydacyjny uległy apoptozie. Te komórki apoptotyczne zostały potwierdzone przez anektynę V, która wiązała się z fosfatydyloseryną w zewnętrznym płatku błony komórkowej podczas procesu apoptozy. Korzystając z tego urządzenia mikroprzepływowego z mikrorowkowymi wzorami, proces apoptozy obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano za pomocą odwróconego mikroskopu zawierającego komorę inkubacyjną (37°C, 5% CO_{2 ).} W związku z tym to urządzenie mikroprzepływowe połączone z mikrorowkowanymi podłożami może być przydatne do badania zachowania komórek i przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Protocol

A. Mikrofabrykacja urządzenia mikroprzepływowego

1. 4-calowa płytka krzemowa jest traktowana reaktywną plazmą tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
2. Fotorezystor ujemny (SU-8 2015, Microchem, MA) jest powlekany wirowo z prędkością 900 obr./min przez 1 minutę na płytce Si.
3. Wafel jest miękko pieczony w temperaturze 95°C przez 6 minut na płycie grzejnej i jest wystawiony na działanie światła UV (200 W) przez 4 minuty przez folię maskującą zawierającą mikrokanaliki.
4. Wafel jest wypiekany w temperaturze 95°C przez 6 minut i wywoływany przy użyciu wywoływacza fotorezystu SU-8.
5. Wzorzysty wafel fotorezystu zawierający mikrokanaliki umieszcza się na szalce Petriego.
6. Formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) (Sylgard 184) są wytwarzane przez zmieszanie elastomeru silikonowego i utwardzacza (stosunek 10:1).
7. Mieszaninę PDMS wylewa się na formę główną Si i umieszcza na eksykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków.
8. PDMS utwardza się w temperaturze 70 °C przez 1 ~ 2 godziny.
9. Formy PDMS są następnie odklejane od formy głównej Si.

B. Montaż urządzenia

1. Górne kanały przepływowe o grubości 40 μm i dolne kanały mikrorowkowe o grubości 40 μm (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) uzyskuje się z dwóch różnych form głównych Si.
2. Kanał wlotowy i wylotowy urządzenia fluidycznego jest dziurkowany.
3. Kanały fluidyczne i kanały mikrorowkowe są nieodwracalnie połączone przez reaktywną plazmę tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
4. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) (tj. fibronektyna) jest powlekana wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).

C. Rozsiewanie komórek i konfiguracja eksperymentalna

1. Mysie fibroblasty NIH-3T3 są hodowane w kolbie do hodowli tkankowej przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Komórki są trypsynizowane i dysocjowane.
3. Zdysocjowane komórki są ładowane do kanałów mikrorowków o gęstości komórek 3×10⁶ komórek/ml (Rysunek 1).
   
    
      Rysunek 1
   
   
4. 2 ml pożywki, 100 mM H₂O₂ i test apoptozy (20 μl aneksyny V i 40 μl jodku propidyny, Invitrogen, CA) wprowadza się do kanału za pomocą pompy strzykawkowej (1 μl/min).
5. Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym za pomocą odwróconego mikroskopu (Nikon TE 2000).

Discussion

Komórki unieruchomiono i umieszczono w mikrorowkowanych podłożach w urządzeniu mikroprzepływowym. Proces apoptozy komórek wystawionych na działanie nadtlenku wodoru obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano przy użyciu aneksyny V i jodku propidyny. W związku z tym to urządzenie mikroprzepływowe zawierające kanały mikrorowkowe może być przydatne do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Poli(dimetylosiloksan), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 funta)
DMEM	podłoże	Invitrogen	11965	Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Media
FBS	surowica	Invitrogen	10082-147	Płodowa surowica bydlęca
Nadtlenek wodoru	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H1009
Test apoptozy		Invitrogen	V13242	Aneksyna A, jodek propidyny
Ujemny fotorezystor		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Narzędzie do wafli Si	4-calowy			wafel silikonowy
Reaktywny odczynnik plazmowy tlenu		Harrick Scientific Products, Inc.		traktować wafel 5 min przy
mikroskopie odwróconym	Narzędzie	Nikon Instruments	TE 2000