Artykuł metodologiczny

Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczurów

DOI:

10.3791/2704

⸱

23 maja 2011

 , 
1Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Loyola University Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy zastosowanie wskaźnika fluorescencji, TMRM, w neuronach korowych, aby określić względne zmiany intensywności fluorescencji TMRM przed i po zastosowaniu określonego bodźca. Przedstawiono również zastosowanie sondy fluorescencyjnejH2DCF-DA do oceny względnego poziomu reaktywnych form tlenu w neuronach korowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) jest krytyczny dla utrzymania fizjologicznej funkcji łańcucha oddechowego do generowania ATP. Znaczna utrata ΔΨm powoduje, że komórki są pozbawione energii, a następnie umierają. Reaktywne formy tlenu (ROS) są ważnymi cząsteczkami sygnałowymi, ale ich akumulacja w warunkach patologicznych prowadzi do stresu oksydacyjnego. Dwa główne źródła ROS w komórkach to toksyny środowiskowe i proces fosforylacji oksydacyjnej. Dysfunkcja mitochondriów i stres oksydacyjny są związane z patofizjologią wielu chorób; w związku z tym możliwość określenia ΔΨm i ROS może dostarczyć ważnych wskazówek na temat fizjologicznego stanu komórki i funkcji mitochondriów.

Kilka sond fluorescencyjnych (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) może być używanych do określania Δψm w różnych typach komórek, a wiele wskaźników fluorescencji (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) może być używanych do określania ROS. Prawie wszystkie dostępne sondy fluorescencyjne używane do oceny ΔΨm lub ROS są wskaźnikami o pojedynczej długości fali, które zwiększają lub zmniejszają swoją intensywność fluorescencji proporcjonalnie do bodźca, który zwiększa lub zmniejsza poziomy ΔΨm lub ROS. Dlatego konieczne jest zmierzenie intensywności fluorescencji tych sond na poziomie podstawowym i po zastosowaniu określonego bodźca. Pozwala to określić procentową zmianę intensywności fluorescencji między poziomem wyjściowym a bodźcem. Ta zmiana intensywności fluorescencji odzwierciedla zmianę względnych poziomów ΔΨm lub ROS. W tym filmie pokazujemy, jak zastosować wskaźnik fluorescencji, TMRM, w neuronach korowych szczurów, aby określić procentową zmianę intensywności fluorescencji TMRM między poziomem wyjściowym a po zastosowaniu FCCP, rozprzęgacza mitochondriów. Niższe poziomy fluorescencji TMRM wynikające z leczenia FCCP odzwierciedlają depolaryzację potencjału błony mitochondrialnej. Pokazujemy również, jak zastosować sondę fluorescencyjnąH2DCF-DA do oceny poziomu ROS w neuronach korowych, najpierw na początku badania, a następnie po zastosowaniuH2O2. Protokół ten (z niewielkimi modyfikacjami) może być również wykorzystany do określenia zmian w ∆Ψm i ROS w różnych typach komórek oraz w neuronach odizolowanych od innych obszarów mózgu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Neurony korowe są izolowane i hodowane przy użyciu wcześniej opisanych technik i powlekane na szalkach hodowlanych ze szklanym dnem (MatTek Corporation, Ashland, MA) pokrytym poli-D-lizyną i lamininą1.

2. Przygotowanie roztworów podstawowych dla sond fluorescencyjnych TMRM i H2DCF-DA

  1. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy TMRM, rozpuszczając 5,0 mg TMRM w 1 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku. Wiruj przez 1 minutę. Następnie przygotuj porcje i przechowuj je w temperaturze -20°C, chroń przed światłem i zużyj w ciągu jednego miesiąca.
  2. Następnie przygotować 10-mM roztwór podstawowy H2DCF-DA, rozpuszczając 4,87 mgH2DCF-DAw 1 ml bezwodnego DMSO. Podobnie wiruj przez 1 minutę. Następnie przygotuj porcje i przechowuj je w temperaturze -20°C, chronić przed światłem i zużyć w ciągu tygodnia.

3. Ładowanie neuronów korowych szczurów za pomocą TMRM i H2DCF-DA

TMRM to potencjometryczny, przepuszczalny dla komórek wskaźnik fluorescencyjny, który gromadzi się w wysoce ujemnie naładowanym wnętrzu mitochondriów. Ważne jest, aby stosować niskie stężenia (zakres 10-50 nM) TMRM, aby uniknąć automatycznego wygaszania mitochondrialnego TMRM. Następnie sygnał fluorescencyjny TMRM może być bezpośrednio powiązany z ΔΨm przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Utrata ΔΨm powoduje wyciek TMRM z mitochondriów, co powoduje utratę intensywności fluorescencji. H2DCF-DA jest przepuszczalną dla komórek sondą przekształcaną w DCF-DA przez esterazy wewnątrzkomórkowe, a jej utlenianie powoduje fluorescencyjne DCF. Końcowe stężenieH2DCF-DA waha się w zakresie 2-10 μM i powinno być testowane empirycznie w neuronach pochodzących z różnych regionów mózgu, ponieważ wysokie stężenia obciążenia mogą powodować nasycenie fluorescencji DCF nawet przy brakuH2O2. Obecność jakiegokolwiek endogennego lub egzogennego utleniacza (np. tlenku azotu, nadtlenku wodoru) zwiększy intensywność fluorescencji DFC. Poniżej przedstawiamy protokół ładowania neuronów korowych szczurów za pomocą TMRM i H2DCF-DA.

  1. Aby załadować neurony korowe szczura TMRM, najpierw umyj wyhodowane neurony 3 razy buforem Tyrode'a (nakładka tekstowa: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 1,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 10 mM HEPES; dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH). Następnie należy przygotować 20 nM TMRM, rozcieńczając 10 mM TMRM 1/1000 razy w TB, a następnie dodać 2 μl rozcieńczonego TMRM na 1 ml TB. Inkubuj neurony z TMRM przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 minutach zamontuj szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie.
  2. Aby załadować neurony korowe szczura H2DCF-DA, umyj wyhodowane neurony 3 razy gruźlicą. Następnie przygotować 2 μM H2DCF-DA, rozcieńczając 10 mM H2DCF-DA 1/10 razy w TB, a następnie dodać 2 μl rozcieńczonego H2DCF-DA na 1 ml TB. Następnie inkubuj neurony z H2DCF-DA przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 minutach przemyj neurony 4 razy gruźlicą, aby usunąć nadmiar wskaźnika fluorescencyjnego przed uzyskaniem obrazów.

4. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych za pomocą TMRM w celu określenia ΔΨm

  1. Do wykonywania obrazowania na żywo neuronów inkubowanych za pomocą TMRM wykorzystuje się konfokalną laserową mikroskopię skaningową (Text Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc.), z zastosowaniem programu szeregów czasowych na żywo. Zastosuj niską rozdzielczość i stłumioną moc lasera (nakładka tekstowa: niska rozdzielczość: 256 x 256; moc lasera: 1%), aby zminimalizować czas potrzebny do uzyskania obrazów i uniknąć fotowybielania.
  2. . Następnie dostosuj ostrość zamontowanych neuronów załadowanych TMRM za pomocą światła odbitego. Zbadaj fluorescencję TMRM przez oświetlenie przy 514 nm i detekcję przy 570 nm. Ustaw wzmocnienie detekcji kamery tuż poniżej poziomu nasycenia.
  3. Po ustawieniu wszystkich parametrów, takich jak rozdzielczość, moc lasera, wzmocnienie detekcji kamery i interwał poklatkowy w celu uzyskania obrazów, nie zmieniaj tych ustawień między eksperymentami. Następnie zmień pole. Zacznij kolekcjonować obrazy.
  4. Aby przetestować zmiany ΔΨm, można zastosować bodźce takie jak 1 μM FCCP lub 2 μg/ml oligomycyny, które odpowiednio znacznie zdepolaryzują lub hiperpolaryzują potencjał błony mitochondrialnej. Zmiany te będą odzwierciedlone przez zmniejszenie intensywności fluorescencji TMRM w porównaniu z wyjściową intensywnością fluorescencji w przypadku FCCP lub wzrost intensywności fluorescencji TMRM w przypadku oligomycyny.

5. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H2DCF-DA w celu określenia ROS

  1. Aby wykonać obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych zH2DCF-DA, najpierw zamontuj szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość komórek za pomocą odbitego światła. Zbadaj fluorescencję DCF przez wzbudzenie przy 488 nm i emisję przy 515 nm.
  2. Następnie dostosuj moc lasera do 5-7%, wzmocnienie detektora i rozdzielczość 256 x 256. Nie zmieniaj tych ustawień między eksperymentami. Następnie ustaw częstotliwość uzyskiwania obrazów na żywo za pomocą programu szeregów czasowych.
  3. Wybierz nowe pole i rozpocznij pobieranie obrazów. Aby wykryć zmiany w poziomach ROS, potraktuj komórki 100-200 μMH2O2. Znajdzie to odzwierciedlenie we wzroście intensywności fluorescencji DCF w porównaniu z poziomem wyjściowym.

6. Analiza danych

  1. Użyj narzędzia obszaru zainteresowania (Nakładka tekstowa: ROI) z programu LSM, aby wybrać obszary. Następnie zmierz intensywność fluorescencji TMRM lub ROS. Wybierz ROI z regionów mitochondrialnych lub ROI z całego ciała komórki w obrazowanych komórkach, aby zmierzyć intensywność fluorescencji odpowiednio TMRM lub ROS.
  2. Oblicz średnią intensywność fluorescencji ze wszystkich ROI każdej komórki dla TMRM lub z całych ciał komórek dla wszystkich obrazowanych komórek dla ROS dla każdego punktu czasowego. Zaznacz regiony obok komórek, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Wykonaj kilka pomiarów i oblicz średnią intensywność tła.
  3. Odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od średniej intensywności fluorescencji ROI w każdej komórce dla każdego punktu czasowego za pomocą programu Microsoft Excel. Po odjęciu intensywności tła znormalizuj intensywność fluorescencji TMRM lub DCF do fluorescencji wyjściowej za pomocą tego wzoru (Nakładka tekstowa: ΔF = F-Fo/Fo x 100, gdzie F = intensywność fluorescencji w dowolnym punkcie czasowym, Fo = fluorescencja wyjściowa). Następnie użyj programu Sigma Plot, aby wygenerować wykres przedstawiający zmiany intensywności fluorescencji w czasie.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1A pokazuje fluorescencyjny obraz neuronów korowych szczura inkubowanych za pomocą TMRM. Dodanie FCCP, rozprzęgającego mitochondriów, prowadzi do depolaryzacji mitochondriów i utraty intensywności fluorescencji TMRM (ryc. 1B). Wyjściowy poziom fluorescencji TMRM pozostaje stabilny przed dodaniem FCCP (pierwsze 350 sekund; Rys. 1C). Analiza ilościowa zmian fluorescencji TMRM w czasie wykazuje znaczny spadek fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP (ryc. 1C).

Rysunek 1D pokazuje obraz fluorescencyjny neuronów korowych szczurów załadowanych DCF. DodanieH2O2powoduje zwiększenie intensywności fluorescencji DCF w ciałach komórkowych (ryc. 1E). Wyjściowy poziom fluorescencji DCF pozostaje niezmieniony (pierwsze 120 sekund) przed zastosowaniemH2O2. Pomiary poklatkowe fluorescencji DCF pokazują jej stały poziom, który wzrasta po zabieguH2O2(ryc. 1F).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Ocena potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ROS w żywych neuronach korowych szczurów. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny neuronów korowych obciążonych TMRM. Po zeskanowaniu wyjściowej fluorescencji TMRM, neurony potraktowano protonoforem FCCP (1 μM). Po prawej stronie znajduje się pseudokolorowy pasek intensywności fluorescencji TMRM, gdzie jasnożółty i reprezentują odpowiednio maksymalną i minimalną intensywność. Utrata fluorescencji TMRM z regionów mitochondrialnych wskazuje na załamanie się ΔΨm po leczeniu FCCP (panel B). Ilościowe przedstawienie zmiany intensywności fluorescencji TMRM w różnych punktach czasowych przed i po leczeniu FCCP pokazano w panelu C. (D) Obraz fluorescencyjny neuronów korowych szczura załadowanych H2DCF-DA. Po określeniu wyjściowej fluorescencji DCF komórki potraktowano 200 μM H2O2 i oceniono zmianę fluorescencji DCF. Wzrost fluorescencji DCF odzwierciedla wzrost poziomów ROS po traktowaniuH2O2(E). Ilościowa analiza zmian fluorescencji DCF, przed i po zabieguH2O2, przedstawiono w panelu F. Podziałka liniowa = 10 μm

Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie żywych komórek TMRM w neuronach korowych przed i po dodaniu FCCP przy użyciu obiektywu 40X. Intensywność pseudokoloru pokazuje maksymalną (jasnożółtą, przed addycją FCCP) i zmniejszoną (kolor czerwony, po dodaniu FCCP) intensywność fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film

Wideo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie DCF na żywo w neuronach korowych przed i po dodaniuH2O2przy użyciu obiektywu 40X. Podstawowa fluorescencja DCF ma jasnozielony kolor w ciałach komórek, a dodatek H2O2 zwiększa intensywność fluorescencji DCF do jasnozielonego koloru. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy procedurę krok po kroku opisującą, jak określić ΔΨm i ROS w neuronach korowych szczurów za pomocą wskaźników fluorescencyjnych TMRM i H2DCF-DA, odpowiednio. W przypadku innych typów ogniw ważne jest empiryczne określenie końcowego stężenia i czasu ładowania dla TMRM lub H2DCF-DA. Ogólnie rzecz biorąc, stężenia TMRM wahają się od 20-200 nM, a czas inkubacji komórek z TMRM waha się od 20 do 60 minut. Końcowe stężenieH2DCF-DA waha się od 2-10 μM, a inkubacja komórek w roztworze ładującym zawierającym ten wskaźnik waha się od 30-45 min.

Ważne jest, aby zoptymalizować moc lasera i szybkość skanowania podczas wykonywania zdjęć, aby uniknąć zarówno fototoksyczności dla komórek, jak i zmian intensywności fluorescencji (na przykład migotania fluorescencji TMRM) przy braku jakiegokolwiek bodźca. Zoptymalizowane ustawienia optyczne powinny skutkować sygnałem fluorescencyjnym, który nie jest nadmiernie lub niedostatecznie nasycony (próg) przy braku bodźca. Optymalne warunki do zbierania obrazów z wybranego pola przy określonej mocy lasera i prędkości skanowania są osiągane wtedy, gdy nie występują zmiany w intensywności fluorescencji sondy przy braku jakiegokolwiek bodźca przez 10-15 min obrazowania na żywo.

Inne sondy fluorescencyjne do oznaczania ΔΨm obejmują rodaminę 123 i ester etylowy tetrametylu rodaminy (TMRE). Stwierdzono jednak, że hamują one procesy oddechowe w izolowanych mitochondriach2. Co ważne, TMRM nie ma wpływu na oddychanie mitochondrialne w niskich stężeniach2 i ma niską fototoksyczność i fotowybielanie3 w porównaniu z innymi sondami. H2DCF-DA jest dobrym wskaźnikiem ROS, ponieważ jest dobrze zatrzymywany w komórkach i rozpoznaje kilka rodzajów utleniaczy, takich jak nadtlenki, nadtlenki i tlenek azotu4.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (K22NS050137 J.C.B.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane ze szklanym dnemMatTek Corp.P35G-1.5-14-C
NbActive4BrainBitsNbActive4
TMRMInvitrogenT668
H2DCF-DAInvitrogenC400
NaClSigma-AldrichS6191
KClSigma-AldrichP3911
CaCl2∙ 2H2OSigma-AldrichC3306
MgCl2∙ 6H2OSigma-AldrichM2670
D-GlucoseSigma-AldrichG6152
HEPESInvitrogen15630

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. , (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fluorescencja TMRMfluorescencja H2DCFDAobrazowanie fluorescencyjnetraktowanie FCCPtraktowanie nadtlenkiem wodoruanaliza intensywno ci fluorescencjiobrazowanie ywych kom rek

Powiązane artykuły