Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach kory szczura

Podsumowanie

Prezentujemy zastosowanie wskaźnika fluorescencyjnego TMRM w neuronach korowych w celu określenia względnych zmian intensywności fluorescencji TMRM przed i po zastosowaniu specyficznego bodźca. Wykazujemy również zastosowanie sondy fluorescencyjnej H₂DCF-DA do oceny względnego poziomu reaktywnych form tlenu w neuronach korowych.

Streszczenie

Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) ma kluczowe znaczenie dla utrzymania fizjologicznej funkcji łańcucha oddechowego w celu generowania ATP. Znaczny spadek ΔΨm prowadzi do wyczerpania zasobów energii w komórkach i ich następczej śmierci. Reaktywne formy tlenu (ROS) są istotnymi cząsteczkami sygnałowymi, jednak ich akumulacja w warunkach patologicznych prowadzi do stresu oksydacyjnego. Dwiema głównymi aktualnymi źródłami ROS w komórkach są toksyny środowiskowe oraz proces fosforylacji oksydacyjnej. Dysfunkcja mitochondriów i stres oksydacyjny są powiązane z patofizjologią wielu chorób; w związku z tym możliwość oznaczenia ΔΨm oraz ROS może dostarczyć istotnych informacji o stanie fizjologicznym komórki i funkcji mitochondriów.

Do wyznaczania Δψm w różnych typach komórek można wykorzystać kilka sond fluorescencyjnych (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1), a wiele wskaźników fluorescencji (dihydroetydium, dihydrorodamina 123, H₂(DCF-DA) mogą być wykorzystywane do oznaczania ROS. Prawie wszystkie dostępne sondy fluorescencyjne stosowane do oceny ΔΨm lub ROS są wskaźnikami jednofalowymi, których intensywność fluorescencji wzrasta lub spada proporcjonalnie do bodźca zwiększającego lub zmniejszającego poziom ΔΨm lub ROS. Niezbędne jest zatem pomiar intensywności fluorescencji tych sond na poziomie bazowym oraz po zastosowaniu konkretnego bodźca. Pozwala to na określenie procentowej zmiany intensywności fluorescencji pomiędzy poziomem bazowym a odpowiedzią na bodziec. Zmiana ta odzwierciedla zmianę względnych poziomów ΔΨm lub ROS. W niniejszym filmie demonstrujemy, jak zastosować wskaźnik fluorescencyjny TMRM w neuronach korowych szczura, aby określić procentową zmianę intensywności fluorescencji TMRM pomiędzy poziomem bazowym a stanem po zastosowaniu FCCP, odsprzęgacza mitochondrialnego. Niższe poziomy fluorescencji TMRM wynikające z zastosowania FCCP odzwierciedlają depolaryzację potencjału błony mitochondrialnej. Pokazujemy również, jak zastosować sondę fluorescencyjną H₂DCF-DA do oceny poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w neuronach korowych, najpierw w stanie podstawowym, a następnie po zastosowaniu H2O2₂O₂Niniejszy protokół (po niewielkich modyfikacjach) może być również wykorzystany do określania zmian ∆Ψm oraz ROS w różnych typach komórek oraz w neuronach wyizolowanych z innych obszarów mózgu.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

1. Neurony korowe są izolowane i hodowane z użyciem wcześniej opisanych technik, a następnie wysiewane na naczynia hodowlane z szklanym dnem (MatTek Corporation, Ashland, MA) powlekane poli-D-lizyną i lamininą¹.

2. Przygotowanie roztworów zapasowych dla sond fluorescencyjnych TMRM i H₂DCF-DA

1. Przygotować 10-mM roztwór zapasu TMRM, rozpuszczając 5,0 mg TMRM w 1 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku. Mieszać na wortexie przez 1 min. Następnie podzielić roztwór na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C, chroniąc przed światłem; wykorzystać w ciągu jednego miesiąca.
2. Następnie przygotować 10-mM roztwór zapasu H₂DCF-DA, rozpuszczając 4,87 mg H₂DCF-DA w 1 ml bezwodnego DMSO. Podobnie mieszać na wortexie przez 1 min. Następnie podzielić roztwór na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C, chroniąc przed światłem; wykorzystać w ciągu jednego tygodnia.

3. Obciążanie neuronów kory szczura TMRM i H₂DCF-DA

TMRM jest potencjometrycznym, przenikającym przez błony komórkowe wskaźnikiem fluorescencyjnym, który gromadzi się w silnie naładowanym ujemnie wnętrzu mitochondriów. Ważne jest stosowanie niskich stężeń TMRM (w zakresie 10-50 nM), aby uniknąć autogaszenia fluorescencji TMRM w mitochondriach. Wówczas sygnał fluorescencyjny TMRM może być bezpośrednio skorelowany z ΔΨm w obrębie wewnętrznej błony mitochondrialnej. Utrata ΔΨm powoduje wyciek TMRM z mitochondriów, co skutkuje spadkiem intensywności fluorescencji. H₂DCF-DA jest przenikającą przez błony komórkowe sondą, która jest przekształcana w DCF-DA przez wewnątrzkomórkowe esterazy, a jej utlenienie prowadzi do powstania fluorescencyjnego DCF. Końcowe stężenie H₂DCF-DA mieści się w zakresie 2-10 μM i powinno być testowane empirycznie w neuronach pochodzących z różnych obszarów mózgu, ponieważ wysokie stężenia ładunkowe mogą prowadzić do nasycenia fluorescencji DCF nawet w przypadku braku H₂O₂. Obecność jakiegokolwiek endogennego lub egzogennego utleniacza (np. tlenku azotu, nadtlenku wodoru) zwiększy intensywność fluorescencji DCF. Poniżej przedstawiamy protokół obciążania neuronów kory szczura TMRM oraz H₂DCF-DA.

1. Aby załadować neurony korowe szczura barwnikiem TMRM, najpierw przemyć hodowlę neuronów 3 razy buforem Tyrode'a (Tekst na ekranie: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 1,5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ oraz 10 mM HEPES; pH dostosować do 7,4 za pomocą NaOH). Następnie przygotować roztwór TMRM o stężeniu 20 nM poprzez 1000-krotne rozcieńczenie zapasu TMRM 10 mM w buforze TB, a następnie dodać 2 μl rozcieńczonego TMRM na 1 ml TB. Inkubować neurony z TMRM przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 min umieścić naczynie z hodowlą na stoliku mikroskopu i rozpocząć obrazowanie.
2. Aby załadować neurony korowe szczura barwnikiem H₂DCF-DA, przemyć hodowlę neuronów 3 razy buforem TB. Następnie przygotować roztwór H₂DCF-DA o stężeniu 2 μM poprzez 10-krotne rozcieńczenie zapasu H₂DCF-DA 10 mM w buforze TB, a następnie dodać 2 μl rozcieńczonego H₂DCF-DA na 1 ml TB. Następnie inkubować neurony z H₂DCF-DA przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 min przemyć neurony 4 razy buforem TB, aby usunąć nadmiar wskaźnika fluorescencyjnego przed wykonaniem obrazowania.

4. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z TMRM w celu oznaczenia ΔΨm

1. Do obrazowania na żywo neuronów inkubowanych z TMRM wykorzystuje się konfokalny skaningowy mikroskop laserowy (Tekst na ekranie: LSM 510, Carl Zeiss Inc.) z zastosowaniem programu do serii czasowej dla żywych komórek. Należy zastosować niską rozdzielczość i osłabioną moc lasera (Tekst na ekranie: niska rozdzielczość: 256 x 256; moc lasera: 1%), aby zminimalizować czas potrzebny na uzyskanie obrazów oraz uniknąć fotobielenia.
2. . Następnie, przy użyciu światła odbitego, należy ustawić ostrość obrazu zamontowanych neuronów obciążonych TMRM. Fluorescencję TMRM bada się przy oświetleniu 514 nm i detekcji przy 570 nm. Wzmocnienie detekcji kamery należy ustawić tuż poniżej poziomu nasycenia.
3. Po ustawieniu wszystkich parametrów, w tym rozdzielczości, mocy lasera, wzmocnienia detekcji kamery oraz interwału time-lapse dla pozyskiwania obrazów, nie należy zmieniać tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie należy zmienić pole widzenia. Rozpocząć zbieranie obrazów.
4. Aby przetestować zmiany ΔΨm, można zastosować bodźce, takie jak 1 μM FCCP lub 2 μg/ml oligomycyny, które odpowiednio znacząco zdepolaryzują lub hiperpolaryzują potencjał błony mitochondrialnej. Zmiany te będą objawiać się spadkiem intensywności fluorescencji TMRM w porównaniu z bazową intensywnością fluorescencji w przypadku FCCP lub wzrostem intensywności fluorescencji TMRM w przypadku oligomycyny.

5. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H²DCF-DA w celu oznaczenia ROS

1. Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H₂DCF-DA, najpierw umieść szalkę z hodowlą na stole mikroskopu. Ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła odbitego. Analizuj fluorescencję DCF przy wzbudzeniu przy 488 nm i emisji przy 515 nm.
2. Następnie ustaw moc lasera na 5-7%, wzmocnienie detektora oraz rozdzielczość 256 x 256. Nie zmieniaj tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie, korzystając z programu serii czasowych, ustaw częstotliwość pozyskiwania obrazów na żywo.
3. Wybierz nowe pole i rozpocznij akwizycję obrazów. Aby wykryć zmiany w poziomach ROS, potraktuj komórki 100-200 μM H₂O₂. Przejawi się to wzrostem intensywności fluorescencji DCF w porównaniu z poziomem bazowym.

6. Analiza danych

1. Użyj narzędzia do wyznaczania obszaru zainteresowania (Text Overlay: ROI) z programu LSM, aby zaznaczyć odpowiednie obszary. Następnie zmierz intensywność fluorescencji TMRM lub ROS. Wybierz ROI z obszarów mitochondrialnych lub ROI z całego ciała komórki w obrazowanych komórkach, aby zmierzyć odpowiednio intensywność fluorescencji TMRM lub ROS.
2. Dla każdego punktu czasowego oblicz średnie intensywności fluorescencji ze wszystkich ROI każdej komórki dla TMRM lub z całych ciał komórkowych dla wszystkich obrazowanych komórek dla ROS. Wyznacz obszary obok komórek, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Wykonaj kilka pomiarów i oblicz średnią intensywność tła.
3. Odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od średnich intensywności fluorescencji ROI w każdej komórce dla każdego punktu czasowego za pomocą programu Microsoft Excel. Po odjęciu intensywności tła znormalizuj intensywność fluorescencji TMRM lub DCF względem fluorescencji bazowej, korzystając z następującego wzoru (Text Overlay: ΔF = F-F_o/F_o x 100, gdzie F= intensywność fluorescencji w dowolnym punkcie czasowym, Fo= fluorescencja bazowa). Następnie użyj programu Sigma Plot, aby wygenerować wykres przedstawiający zmiany intensywności fluorescencji w czasie.

7. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1A przedstawia obraz fluorescencyjny neuronów kory mózgu szczura inkubowanych z TMRM. Dodanie FCCP, odsprzęgacza mitochondrialnego, prowadzi do depolaryzacji mitochondriów i utraty intensywności fluorescencji TMRM (Ryc. 1B). Poziom bazowy fluorescencji TMRM pozostaje stabilny przed dodaniem FCCP (pierwsze 350 sec; Ryc. 1C). Analiza ilościowa zmian fluorescencji TMRM w czasie wykazuje znaczący spadek fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP (Ryc. 1C).

Rycina 1D przedstawia obraz fluorescencyjny neuronów kory mózgu szczura obciążonych DCF. Dodatek H₂O₂ powoduje wzrost intensywności fluorescencji DCF w ciałach komórkowych (Ryc. 1E). Poziom bazowy fluorescencji DCF pozostaje niezmieniony (pierwsze 120 s) przed aplikacją H₂O₂. Pomiary fluorescencji DCF w czasie (time-lapse) wykazują jej stabilne poziomy, które wzrastają po zastosowaniu H₂O₂ (Ryc. 1F).

Rysunek 1. Ocena potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ROS w żywych neuronach korowych szczura. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny neuronów korowych obciążonych TMRM. Po przeskanowaniu baseline'owej fluorescencji TMRM neurony poddano działaniu protonofora FCCP (1 μM). Po prawej stronie znajduje się pasek intensywności pseudokolorowej fluorescencji TMRM, gdzie kolor jasnoyellow i czarny reprezentują odpowiednio intensywność maksymalną i minimalną. Utrata fluorescencji TMRM z obszarów mitochondrialnych wskazuje na załamanie ΔΨm po zastosowaniu FCCP (panel B). Ilościowe przedstawienie zmiany natężenia fluorescencji TMRM w różnych punktach czasowych przed i po zastosowaniu FCCP pokazano na panelu C. (D) Obraz fluorescencyjny neuronów korowych szczura obciążonych H2DCF-DA. Po określeniu baseline'owej fluorescencji DCF komórki poddano działaniu 200 μM H₂O₂ i oceniono zmianę fluorescencji DCF. Wzrost fluorescencji DCF odzwierciedla wzrost poziomu ROS po zastosowaniu H₂O₂ (E). Analiza ilościowa zmiany fluorescencji DCF przed i po zastosowaniu H₂O₂ przedstawiona jest na panelu F. Pasek skali = 10 μm

Wideo.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie żywych komórek z użyciem TMRM w neuronach korowych przed i po dodaniu FCCP przy użyciu obiektywu 40X. Intensywność pseudokolorów wskazuje na maksymalną (jasnożółty kolor, przed dodaniem FCCP) oraz zmniejszoną (kolor czerwony, po dodaniu FCCP) intensywność fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Wideo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie żywych komórek z użyciem DCF w neuronach korowych przed i po dodaniu H₂O₂ przy użyciu obiektywu 40X. Bazowa fluorescencja DCF ma kolor jasnozielony w ciałach komórkowych, a dodanie H2O2 zwiększa intensywność fluorescencji DCF do koloru jaskrawozielonego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo

Dyskusja

Przedstawiliśmy procedurę krok po kroku opisującą sposób wyznaczania ΔΨm oraz ROS w neuronach korowych szczura z wykorzystaniem wskaźników fluorescencyjnych TMRM oraz H₂DCF-DA. W przypadku innych typów komórek istotne jest empiryczne ustalenie końcowego stężenia i czasu inkubacji dla TMRM lub H₂DCF-DA. Ogólnie stężenia TMRM mieszczą się w zakresie 20-200 nM, a czas inkubacji komórek z TMRM wynosi od 20 do 60 min. Końcowe stężenie H₂DCF-DA mieści się w zakresie 2-10 μM, a czas inkubacji komórek w roztworze ładującym zawierającym ten wskaźnik wynosi od 30 do 45 min.

Ważne jest zoptymalizowanie mocy lasera oraz prędkości skanowania podczas obrazowania, aby uniknąć zarówno fototoksyczności komórek, jak i zmian natężenia fluorescencji (na przykład migotania fluorescencji TMRM) w przypadku braku bodźca. Zoptymalizowane ustawienia optyczne powinny skutkować sygnałem fluorescencji, który nie jest nadmiernie nasycony ani niedosycony (próg) przy braku bodźca. Optymalne warunki pozyskiwania obrazów z wybranego pola przy konkretnej mocy lasera i prędkości skanowania zostają osiągnięte, gdy w ciągu 10-15 min obrazowania na żywo nie występują zmiany natężenia fluorescencji sondy w obecności braku jakiegokolwiek bodźca.

Inne sondy fluorescencyjne służące do wyznaczania ΔΨm to rodamina 123 oraz tetra metylowy ester etylowy rodaminy (TMRE). Stwierdzono jednak, że hamują one procesy oddychania w izolowanych mitochondriach². Co istotne, TMRM w niskich stężeniach nie wpływa na oddychanie mitochondrialne² oraz charakteryzuje się niską fototoksycznością i fotowyblakaniem³ w porównaniu z innymi sondami. H₂DCF-DA jest dobrym wskaźnikiem ROS, ponieważ jest dobrze zatrzymywany w komórkach i rozpoznaje kilka gatunków utleniaczy, takich jak nadtlenki, ponadtlenki oraz tlenek azotu⁴.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka hodowlana z szklanym dnem	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H2DCF-DA	Invitrogen	C400
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2∙2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
MgCl2∙6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G6152
HEPES	Invitrogen	15630