Prezentujemy zastosowanie wskaźnika fluorescencyjnego TMRM w neuronach kory mózgu w celu określenia względnych zmian natężenia fluorescencji TMRM przed i po zastosowaniu specyficznego bodźca. Przedstawiamy również zastosowanie sondy fluorescencyjnej H2DCF-DA do oceny względnego poziomu reaktywnych form tlenu w neuronach kory mózgu.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) ma kluczowe znaczenie dla utrzymania fizjologicznej funkcji łańcucha oddechowego w celu generowania ATP. Znaczna utrata ΔΨm prowadzi do wyczerpania zapasów energii w komórkach, a w konsekwencji do ich śmierci. Reaktywne formy tlenu (ROS) są ważnymi cząsteczkami sygnałowymi, jednak ich akumulacja w warunkach patologicznych prowadzi do stresu oksydacyjnego. Dwoma głównymi źródłami ROS w komórkach są toksyny środowiskowe oraz proces fosforylacji oksydacyjnej. Dysfunkcja mitochondriów i stres oksydacyjny są powiązane z patofizjologią wielu chorób; dlatego możliwość oznaczenia ΔΨm i ROS może dostarczyć istotnych informacji o stanie fizjologicznym komórki oraz funkcji mitochondriów.
Do wyznaczania Δψm w różnych typach komórek można wykorzystać kilka sond fluorescencyjnych (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1), a do wyznaczania ROS wiele wskaźników fluorescencyjnych (dihydroetydium, dihydrorodamina 123, H2DCF-DA). Prawie wszystkie dostępne sondy fluorescencyjne stosowane do oceny ΔΨm lub ROS są wskaźnikami jednofalowymi, których intensywność fluorescencji zwiększa się lub zmniejsza proporcjonalnie do bodźca powodującego wzrost lub spadek poziomów ΔΨm lub ROS. Niezbędne jest zatem pomiar intensywności fluorescencji tych sond na poziomie bazowym oraz po zastosowaniu konkretnego bodźca. Pozwala to na określenie procentowej zmiany intensywności fluorescencji między poziomem bazowym a odpowiedzią na bodziec. Zmiana ta odzwierciedla zmianę względnych poziomów ΔΨm lub ROS. W tym filmie demonstrujemy, jak zastosować wskaźnik fluorescencyjny TMRM w neuronach korowych szczura, aby wyznaczyć procentową zmianę intensywności fluorescencji TMRM między poziomem bazowym a stanem po zastosowaniu FCCP, odsprzęgacza mitochondrialnego. Niższe poziomy fluorescencji TMRM wynikające z działania FCCP odzwierciedlają depolaryzację potencjału błony mitochondrialnej. Pokazujemy również, jak zastosować sondę fluorescencyjną H2DCF-DA do oceny poziomu ROS w neuronach korowych, najpierw w stanie bazowym, a następnie po zastosowaniu H2O2. Niniejszy protokół (z niewielkimi modyfikacjami) może być również stosowany do wyznaczania zmian ∆Ψm i ROS w różnych typach komórek oraz w neuronach izolowanych z innych obszarów mózgu.
Protokół
1. Hodowla komórkowa
- Neurony korowe są izolowane i hodowane przy użyciu wcześniej opisanych technik, a następnie wysiewane na naczynia hodowlane z szklanym dnem (MatTek Corporation, Ashland, MA) powlekane poli-D-lizyną i lamininą1.
2. Przygotowanie roztworów zapasowych dla sond fluorescencyjnych TMRM i H2DCF-DA
- Przygotować 10-mM roztwór zapasowy TMRM, rozpuszczając 5,0 mg TMRM w 1 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku. Mieszać na wortexie przez 1 min. Następnie przygotować alikwoty i przechowywać je w temperaturze -20°C, chroniąc przed światłem; zużyć w ciągu jednego miesiąca.
- Następnie przygotować 10-mM roztwór zapasowy H2DCF-DA, rozpuszczając 4,87 mg H2DCF-DA w 1 ml bezwodnego DMSO. Podobnie mieszać na wortexie przez 1 min. Następnie przygotować alikwoty i przechowywać je w temperaturze -20°C, chroniąc przed światłem; zużyć w ciągu jednego tygodnia.
3. Obciążanie neuronów korowych szczura barwnikami TMRM i H2DCF-DA
TMRM jest potencjometrycznym, przenikającym przez błony komórkowe wskaźnikiem fluorescencyjnym, który gromadzi się w silnie naładowanym ujemnie wnętrzu mitochondriów. Ważne jest stosowanie niskich stężeń TMRM (w zakresie 10-50 nM), aby uniknąć autogaszenia TMRM w mitochondriach. Wówczas sygnał fluorescencji TMRM może być bezpośrednio powiązany z ΔΨm w obrębie wewnętrznej błony mitochondrialnej. Utrata ΔΨm powoduje wyciek TMRM z mitochondriów, co skutkuje spadkiem intensywności fluorescencji. H2DCF-DA jest przenikającą przez błony komórkowe sondą przekształcaną w DCF-DA przez wewnątrzkomórkowe esterazy, a jej utlenianie prowadzi do powstania fluorescencyjnego DCF. Końcowe stężenie H2DCF-DA mieści się w zakresie 2-10 μM i powinno być testowane empirycznie w neuronach pochodzących z różnych obszarów mózgu, ponieważ wysokie stężenia ładunku mogą prowadzić do nasycenia fluorescencji DCF nawet w przypadku braku H2O2. Obecność jakiegokolwiek endogennego lub egzogennego utleniacza (np. tlenku azotu, nadtlenku wodoru) zwiększy intensywność fluorescencji DCF. Poniżej przedstawiamy protokół wprowadzania TMRM oraz H2DCF-DA do neuronów korowych szczura.
- Aby załadować neurony korowe szczura barwnikiem TMRM, najpierw przemyj hodowlę neuronów 3 razy buforem Tyrode'a (Tekst na ekranie: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 1,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 oraz 10 mM HEPES; dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH). Następnie przygotuj roztwór TMRM o stężeniu 20 nM, rozcieńczając 10 mM roztwór zapasowy TMRM 10-krotnie w TB, a następnie dodaj 2 μl rozcieńczonego TMRM na 1 ml TB. Inkubuj neurony z TMRM przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 min umieść naczynie z hodowlą na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie.
- Aby załadować neurony korowe szczura barwnikiem H2DCF-DA, przemyj hodowlę neuronów 3 razy buforem TB. Następnie przygotuj roztwór H2DCF-DA o stężeniu 2 μM, rozcieńczając 10 mM roztwór zapasowy H2DCF-DA 10-krotnie w TB, a następnie dodaj 2 μl rozcieńczonego H2DCF-DA na 1 ml TB. Następnie inkubuj neurony z H2DCF-DA przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 min przemyj neurony 4 razy buforem TB, aby usunąć nadmiar wskaźnika fluorescencyjnego przed wykonaniem obrazowania.
4. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z TMRM w celu oznaczenia ΔΨm
- Do obrazowania na żywo neuronów inkubowanych z TMRM wykorzystuje się konfokalny mikroskop skaningowy (Tekst na obrazie: LSM 510, Carl Zeiss Inc.) z zastosowaniem programu do serii czasowej obrazowania na żywo. Należy zastosować niską rozdzielczość i zmniejszoną moc lasera (Tekst na obrazie: niska rozdzielczość: 256 x 256; moc lasera: 1%), aby zminimalizować czas potrzebny na uzyskanie obrazów i uniknąć fotoblaknięcia.
- . Następnie, przy użyciu światła odbitego, należy ustawić ostrość obrazu zamontowanych neuronów obciążonych TMRM. Fluorescencję TMRM bada się poprzez oświetlenie przy 514 nm i detekcję przy 570 nm. Wzmocnienie detekcji kamery należy ustawić tuż poniżej poziomu nasycenia.
- Po ustawieniu wszystkich parametrów, w tym rozdzielczości, mocy lasera, wzmocnienia detekcji kamery oraz interwału time-lapse dla uzyskania obrazów, nie należy zmieniać tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie należy zmienić pole widzenia i rozpocząć zbieranie obrazów.
- Aby zbadać zmiany ΔΨm, można zastosować bodźce takie jak 1 μM FCCP lub 2 μg/ml oligomycyny, które odpowiednio znacznie zdepolaryzują lub hiperpolaryzują potencjał błony mitochondrialnej. Zmiany te będą objawiać się spadkiem intensywności fluorescencji TMRM w porównaniu z bazową intensywnością fluorescencji w przypadku FCCP lub wzrostem intensywności fluorescencji TMRM w przypadku oligomycyny.
5. Obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H2DCF-DA w celu oznaczenia ROS
- Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H2DCF-DA, w pierwszej kolejności zamocuj naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu. Ustaw ostrość obrazu komórek, korzystając ze światła odbitego. Analizuj fluorescencję DCF przy wzbudzeniu 48 nm i emisji 515 nm.
- Następnie ustaw moc lasera na 5-7%, wzmocnienie detektora oraz rozdzielczość 256 x 256. Nie zmieniaj tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie, korzystając z programu serii czasowej, określ częstotliwość pozyskiwania obrazów na żywo.
- Wybierz nowe pole widzenia i rozpocznij akwizycję obrazów. Aby wykryć zmiany w poziomach ROS, potraktuj komórki 10-20 μM H2O2. Odzwierciedli się to wzrostem intensywności fluorescencji DCF w porównaniu z poziomem bazowym.
6. Analiza danych
- Użyj narzędzia do wyznaczania obszaru zainteresowania (Text Overlay: ROI) w programie LSM, aby zaznaczyć odpowiednie obszary. Następnie zmierz intensywność fluorescencji TMRM lub ROS. Wybierz ROI z obszarów mitochondrialnych lub ROI z całego ciała komórki w obrazowanych komórkach, aby zmierzyć odpowiednio intensywność fluorescencji TMRM lub ROS.
- Oblicz średnie intensywności fluorescencji ze wszystkich ROI każdej komórki dla TMRM lub z całych ciał komórek dla wszystkich obrazowanych komórek dla ROS dla każdego punktu czasowego. Wyznacz obszary obok komórek, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Wykonaj kilka pomiarów i oblicz średnią intensywność tła.
- Odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od średnich intensywności fluorescencji ROI w każdej komórce dla każdego punktu czasowego przy użyciu programu Microsoft Excel. Po odjęciu intensywności tła znormalizuj intensywność fluorescencji TMRM lub DCF względem fluorescencji bazowej, korzystając z następującego wzoru (Text Overlay: ΔF = F-Fo/Fo x 10, gdzie F= intensywność fluorescencji w dowolnym punkcie czasowym, Fo= fluorescencja bazowa). Następnie użyj programu Sigma Plot, aby wygenerować wykres przedstawiający zmiany intensywności fluorescencji w czasie.
7. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1A przedstawia obraz fluorescencyjny neuronów kory mózgu szczura inkubowanych z TMRM. Dodanie FCCP, odsprzęgacza mitochondrialnego, prowadzi do depolaryzacji mitochondriów i utraty intensywności fluorescencji TMRM (Rys. 1B). Poziom fluorescencji TMRM w stanie podstawowym pozostaje stabilny przed dodaniem FCCP (pierwsze 350 s; Rys. 1C). Analiza ilościowa zmian fluorescencji TMRM w czasie wykazuje znaczący spadek fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP (Rys. 1C).
Rysunek 1D przedstawia obraz fluorescencyjny neuronów kory mózgu szczura załadowanych DCF. Dodanie H2O2 prowadzi do zwiększenia intensywności fluorescencji DCF w ciałach komórkowych (Rys. 1E). Poziom podstawowy fluorescencji DCF pozostaje niezmienny (pierwsze 120 s) przed zastosowaniem H2O2. Pomiary fluorescencji DCF w czasie (time-lapse) wykazują jej stabilne poziomy, które wzrastają po traktowaniu H2O2 (Rys. 1F).
Rysunek 1. Ocena potencjału błony mitochondrialnej i poziomu ROS w żywych neuronach korowych szczura. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny neuronów korowych z obciążeniem TMRM. Po przeskanowaniu bazowej fluorescencji TMRM neurony potraktowano protonoforem FCCP (1 μM). Po prawej stronie znajduje się pseudokolorowy pasek intensywności fluorescencji TMRM, gdzie jasny żółty i czarny kolor reprezentują odpowiednio maksymalną i minimalną intensywność. Utrata fluorescencji TMRM w obszarach mitochondrialnych wskazuje na spadek ΔΨm po zastosowaniu FCCP (panel B). Ilościowe przedstawienie zmian intensywności fluorescencji TMRM w różnych punktach czasowych przed i po zastosowaniu FCCP pokazano na panelu C. (D) Obraz fluorescencyjny neuronów kory mózgu szczura załadowanych H2DCF-DA. Po określeniu podstawowej fluorescencji DCF komórki poddano działaniu 200 μM H2O2, a następnie oceniono zmianę fluorescencji DCF. Wzrost fluorescencji DCF odzwierciedla wzrost poziomu ROS po H2O2 leczenie (E). Analiza ilościowa zmiany fluorescencji DCF przed i po H2O2 leczenie, przedstawiono na panelu F. Pasek skali = 10 μm
Wideo.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie żywych komórek z zastosowaniem TMRM w neuronach korowych przed i po dodaniu FCCP przy użyciu obiektywu 40X. Intensywność pseudokolorów wskazuje maksymalną (jasnożółty kolor, przed dodaniem FCCP) oraz zmniejszoną (kolor czerwony, po dodaniu FCCP) intensywność fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo
Wideo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Obrazowanie żywych komórek z użyciem DCF w neuronach korowych przed i po H2O2 dodawanie przy użyciu obiektywu 40X. Bazowa fluorescencja DCF ma kolor jasnozielony w ciałach komórek, a dodanie H2O2 zwiększa intensywność fluorescencji DCF do koloru jaskrawozielonego. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo
Dyskusja
Przedstawiliśmy procedurę krok po kroku, opisującą sposób wyznaczania ΔΨm i ROS w neuronach korowych szczura z wykorzystaniem odpowiednio fluorescencyjnych wskaźników TMRM i H2DCF-DA. W przypadku innych typów komórek ważne jest empiryczne określenie końcowej stężenia i czasu inkubacji dla TMRM lub H2DCF-DA. Generalnie stężenia TMRM mieszczą się w zakresie 20-200 nM, a czas inkubacji komórek z TMRM wynosi od 20 do 60 min. Końcowe stężenie H2DCF-DA mieści się w zakresie 2-10 μM, a czas inkubacji komórek w roztworze ładującym zawierającym ten wskaźnik wynosi od 30 do 45 min.
Ważne jest zoptymalizowanie mocy lasera oraz prędkości skanowania podczas obrazowania, aby uniknąć zarówno fototoksyczności komórek, jak i zmian natężenia fluorescencji (na przykład migotania fluorescencji TMRM) w przypadku braku bodźca. Zoptymalizowane ustawienia optyczne powinny skutkować sygnałem fluorescencji, który w przypadku braku bodźca nie jest nadmiernie nasycony ani niedosytowany (próg). Optymalne warunki pozyskiwania obrazów z wybranego pola przy określonej mocy lasera i prędkości skanowania zostają osiągnięte, gdy w ciągu 10-15 min obrazowania na żywo nie występują zmiany natężenia fluorescencji sondy w przypadku braku bodźca.
Inne sondy fluorescencyjne do oznaczania ΔΨm obejmują rodamynę 123 oraz tetra metylowy ester etylowy rodamyny (TMRE). Stwierdzono jednak, że hamują one procesy oddechowe w izolowanych mitochondriach2. Co istotne, TMRM nie wpływa na oddychanie mitochondrialne przy niskich stężeniach2 i wykazuje niską fototoksyczność oraz fotowybielanie3 w porównaniu z innymi sondami. H2DCF-DA jest dobrym wskaźnikiem ROS, ponieważ jest dobrze zatrzymywany w komórkach i rozpoznaje kilka gatunków utleniaczy, takich jak nadtlenki, ponadtlenki oraz tlenek azotu4.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (K22NS050137 dla J.C.B.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szalki hodowlane z szklanym dnem | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| NbActive4 | BrainBits | NbActive4 | |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| H2DCF-DA | Invitrogen | C400 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2∙2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| MgCl2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630 |
Bibliografia
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. , (2007).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
- Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
- Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).
Przedruki i uprawnienia
