Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisano wykonanie i działanie mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, służącego do badania zachowania komórek. Platforma mikroprzepływowa jest pomocnym narzędziem eksperymentalnym, ponieważ pozwala na precyzyjne manipulowanie przepływami płynów, umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wysokoprzepustowych oraz generowanie stabilnych gradientów stężeń substancji rozpuszczalnych. W porównaniu z konwencjonalnymi generatorami gradientów, urządzenia mikroprzepływowe oparte na poli(dimetylosiloksanie) (PDMS) mogą generować stabilne gradienty stężeń czynników wzrostu o ściśle określonych profilach. W niniejszej pracy opracowano proste mikroprzepływowe urządzenia do generowania gradientów z trzema oddzielnymi wlotami. Trzy mikrokanały łączą się w jeden mikrokanał w celu wytworzenia gradientów stężeń. Stabilność i kształt gradientów czynników wzrostu potwierdzono za pomocą dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) o masie cząsteczkowej zbliżonej do epidermalnego czynnika wzrostu (EGF). Wykorzystując to urządzenie mikroprzepływowe, wykazano, że fibroblasty poddane działaniu gradientów stężeń EGF migrowały w kierunku wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek oraz ruchliwość migrujących komórek oceniono ilościowo za pomocą analizy śledzenia komórek. Tym samym to mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być przydatne do badania i analizy zachowania migrujących komórek.
Protokół
A. Mikrofabrykacja mikrofluidycznego urządzenia do generowania gradientu
- Podłoże krzemowe (Si) poddaje się działaniu reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).
- Negatywowy fotorezyst (SU-8 50, Microchem, MA) nanosi się metodą spin-coatingu na podłoże Si przy 1000 rpm przez 1 min.
- Podłoże poddaje się wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) na płycie grzewczej w temperaturze 65°C przez 10 min, a następnie w 95°C przez 30 min.
- Podłoże naświetla się światłem UV (200W) przez 3 min przez maskę z przezroczystej folii o minimalnym rozmiarze wzoru 30 µm.
- Podłoże poddaje się wygrzewaniu po naświetlaniu (post bake....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Komórki poddane działaniu stabilnych gradientów stężeń EGF w urządzeniu mikroprzepływowym migrowały w stronę wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek, indeks chemotaktyczny oraz ruchliwość migrujących komórek zostały zbadane za pomocą analizy śledzenia komórek. W związku z tym ta mikroprzepływowa platforma do generowania gradientów może być użyteczna w badaniach nad przerzutowaniem nowotworów, embriogenezą oraz prowadzeniem aksonów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| dekstran-FITC | Odczynnik | Sigma-Aldrich | FD10S | dekstran (10kD) znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | rekombinowany ludzki czynnik wzrostu naskórka | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poli(dimetylosiloksan) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb) | |
| Negatywowy fotorezyst | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| wafer krzemowy | wafer krzemowy, 4 cale | |||
| Szalki Petriego | ||||
| Rurki polietylenowe | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibonektyna | ||||
| NIH 3T3 | linia komórkowa | komórki fibroblastów | ||
| Mikroskop odwrócony | Nikon Instruments | TE 2000 |
Bibliografia
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
