Gradientowe urządzenie mikroprzepływowe do biologii komórki

Summary

Opisujemy protokół mikrowytwarzania urządzenia mikroprzepływowego generującego gradienty, które może generować gradienty przestrzenne i czasowe w dobrze zdefiniowanym mikrośrodowisku. W tym podejściu urządzenie mikroprzepływowe generujące gradient może być wykorzystywane do badania ukierunkowanej migracji komórek, embriogenezy, gojenia się ran i przerzutów raka.

Abstract

Opisano wytwarzanie i działanie generującego gradient urządzenia mikroprzepływowego do badania zachowania komórek. Platforma mikroprzepływowa jest narzędziem eksperymentalnym, ponieważ może precyzyjnie manipulować przepływami płynów, umożliwiać eksperymenty o wysokiej przepustowości i generować stabilne rozpuszczalne gradienty stężeń. W porównaniu z konwencjonalnymi generatorami gradientów, urządzenia mikroprzepływowe oparte na poli(dimetylosiloksanach) (PDMS) mogą generować stabilne gradienty stężeń czynników wzrostu o dobrze zdefiniowanych profilach. W tym przypadku opracowaliśmy proste urządzenia mikroprzepływowe generujące gradient z trzema oddzielnymi wlotami. Trzy mikrokanały połączone w jeden mikrokanał w celu wygenerowania gradientów stężeń. Stabilność i kształt gradientów czynników wzrostu potwierdzono za pomocą izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu o masie cząsteczkowej zbliżonej do naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Za pomocą tego urządzenia mikroprzepływowego wykazaliśmy, że fibroblasty wystawione na gradienty stężeń EGF migrowały w kierunku wyższych stężeń. Kierunkową orientację migracji komórek i ruchliwość migrujących komórek oceniono ilościowo za pomocą analizy śledzenia komórek. Tak więc to generujące gradient urządzenie mikroprzepływowe może być przydatne do badania i analizowania zachowania migrujących komórek.

Protocol

A. Mikrofabrykacja urządzenia mikroprzepływowego generującego gradient

1. Wafel krzemowy jest traktowany reaktywną plazmą tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
2. Fotorezystor ujemny (SU-8 50, Microchem, MA) jest powlekany wirowo z prędkością 1000 obr./min przez 1 minutę na płytce Si.
3. Wafelek piecze się na miękko w temperaturze 65°C przez 10 minut, a następnie w temperaturze 95°C przez 30 minut na płycie grzewczej.
4. Wafel jest wystawiany na działanie światła UV (200 W) przez 3 minuty przez przezroczystą maskę o minimalnym rozmiarze elementu 30 μm.
5. Wafel jest wypiekany w temperaturze 65°C przez 1 min i w temperaturze 95°C przez 10 min.
6. Forma główna Si z kanałami o grubości 100 μm została opracowana przy użyciu wywoływacza fotorezystu SU-8.
7. Wafel zawierający mikrokanaliki umieszcza się na szalce Petriego.
8. Formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) (Sylgard 184) są wytwarzane przez zmieszanie elastomeru silikonowego i utwardzacza (stosunek 10:1).
9. Mieszaninę PDMS wylewa się na formę główną Si.
10. Formę wzorcową Si umieszcza się na eksykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków na 10 minut.
11. PDMS utwardza się w temperaturze 70 °C przez 1 ~ 2 godziny.
12. Formy PDMS są odklejane od formy głównej Si.

B. Konfiguracja eksperymentalna

1. Wlot, wylot i wlot komórki urządzenia mikroprzepływowego opartego na PDMS jest wykrawany za pomocą ostrych dziurkaczy.
2. Urządzenie i szklane szkiełko (2×3 cala) są nieodwracalnie połączone przez reaktywną plazmę tlenową (5 min przy 30 W, Harrick Scientific, NY).
3. Rurka polietylenowa (PE 20, Becton Dickinon, MD) jest wkładana do wlotów infuzji urządzenia mikroprzepływowego, a następnie podłączana do pompy strzykawkowej.
4. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran (MW = 10 kD, 10 μM, Sigma) i bufor (PBS, Invitrogen, CA) są podawane do urządzenia mikroprzepływowego w celu potwierdzenia stabilnych gradientów wewnątrz urządzenia fluidycznego.
5. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) (tj. fibronektyna) jest powlekana wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).
6. Komórki fibroblastów NIH 3T3 są trypsynizowane i dysocjowane.
7. Zdysocjowane komórki są ładowane do urządzenia mikroprzepływowego (o szerokości 800 μm) o gęstości komórek 2×10⁶ komórek/ml.
8. 2 ml pożywki i 50 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) wprowadza się do urządzenia mikroprzepływowego w celu generowania rozpuszczalnych gradientów za pomocą pompy strzykawkowej (0,05 μl/min).
9. Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym co 5 minut za pomocą odwróconego mikroskopu (Nikon TE 2000).

 

Discussion

Komórki wystawione na działanie stabilnych gradientów stężeń EGF w urządzeniu mikroprzepływowym migrowały w kierunku wyższych stężeń. Kierunkową orientację migracji komórek, indeks chemotaktologiczny, ruchliwość migrujących komórek badano za pomocą analizy śledzenia komórek. Dlatego ta generująca gradient platforma mikroprzepływowa może być przydatna do badania przerzutów raka, embriogenezy i przewodnictwa aksonów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik Dextran-FITC		Sigma-Aldrich	FD10S	Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) sprzężony dekstran (10kD)
hr-EGF		Invitrogen	13247-051	ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu
PDMS		KR Anderson Co.	2065622	Poli(dimetylosiloksan) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 funta)
Ujemny fotorezystor		MicroChem Corp.	SU-8 50
Si wafel				silikonowy, 4-calowe
szalki
Rurki		BD Biosciences	PE 20
PBS		Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3	linia			Komórki fibroblastów
	odwrócony	Nikon Instruments	TE 2000