Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Podsumowanie

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Streszczenie

Opisano wykonanie i działanie mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, służącego do badania zachowania komórek. Platforma mikroprzepływowa jest pomocnym narzędziem eksperymentalnym, ponieważ pozwala na precyzyjne manipulowanie przepływami płynów, umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wysokoprzepustowych oraz generowanie stabilnych gradientów stężeń substancji rozpuszczalnych. W porównaniu z konwencjonalnymi generatorami gradientów, urządzenia mikroprzepływowe oparte na poli(dimetylosiloksanie) (PDMS) mogą generować stabilne gradienty stężeń czynników wzrostu o ściśle określonych profilach. W niniejszej pracy opracowano proste mikroprzepływowe urządzenia do generowania gradientów z trzema oddzielnymi wlotami. Trzy mikrokanały łączą się w jeden mikrokanał w celu wytworzenia gradientów stężeń. Stabilność i kształt gradientów czynników wzrostu potwierdzono za pomocą dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) o masie cząsteczkowej zbliżonej do epidermalnego czynnika wzrostu (EGF). Wykorzystując to urządzenie mikroprzepływowe, wykazano, że fibroblasty poddane działaniu gradientów stężeń EGF migrowały w kierunku wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek oraz ruchliwość migrujących komórek oceniono ilościowo za pomocą analizy śledzenia komórek. Tym samym to mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być przydatne do badania i analizy zachowania migrujących komórek.

Protokół

A. Mikrofabrykacja mikrofluidycznego urządzenia do generowania gradientu

1. Podłoże krzemowe (Si) poddaje się działaniu reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).
2. Negatywowy fotorezyst (SU-8 50, Microchem, MA) nanosi się metodą spin-coatingu na podłoże Si przy 1000 rpm przez 1 min.
3. Podłoże poddaje się wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) na płycie grzewczej w temperaturze 65°C przez 10 min, a następnie w 95°C przez 30 min.
4. Podłoże naświetla się światłem UV (200W) przez 3 min przez maskę z przezroczystej folii o minimalnym rozmiarze wzoru 30 µm.
5. Podłoże poddaje się wygrzewaniu po naświetlaniu (post bake) w temperaturze 65°C przez 1 min oraz 95°C przez 10 min.
6. Krzemowa forma matrycowa z kanałami o grubości 100 µm jest wywoływana przy użyciu wywoływacza do fotorezystu SU-8.
7. Podłoże zawierające mikrokanały umieszcza się w szalce Petriego.
8. Formy z polidimetylosiloksanu (PDMS) (Sylgard 184) wykonuje się poprzez zmieszanie elastomeru silikonowego z utwardzaczem (stosunek 10:1).
9. Mieszaninę PDMS wlewa się na krzemową formę matrycową.
10. Krzemową formę matrycową umieszcza się w desykatorze próżniowym na 10 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
11. PDMS utwardza się w temperaturze 70°C przez 1~2 godziny.
12. Formy PDMS odkleja się od krzemowej formy matrycowej.

B. Układ eksperymentalny

1. Wloty i wyloty dla komórek oraz wloty infuzyjne urządzenia mikrofluidycznego opartego na PDMS są przygotowywane za pomocą ostrych wycinaków.
2. Urządzenie i szkiełko przedmiotowe (2×3 cale) są nieodwracalnie łączone za pomocą reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).
3. Rurki polietylenowe (PE 20, Becton Dickinon, MD) są wprowadzane do wlotów infuzyjnych urządzenia mikrofluidycznego, a następnie podłączane do pompy strzykawkowej.
4. Dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-dextran (MW=10kD, 10 µM, Sigma) oraz bufor (PBS, Invitrogen, CA) są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego w celu potwierdzenia stabilności gradientów wewnątrz układu.
5. Wnętrze urządzenia mikrofluidycznego jest powlekane macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) (tj. fibronektyną) przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).
6. Komórki fibroblastów NIH 3T3 są trypsynizowane i dysocjowane.
7. Dysocjowane komórki są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego (szerokość 800 µm) przy gęstości komórek 2×10⁶ komórek/ml.
8. 2 ml pożywki oraz 50 ng/ml czynnika wzrostu naskórka (EGF) są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego za pomocą pompy strzykawkowej (0,05 µl/min) w celu wytworzenia gradientów rozpuszczalnych.
9. Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym co 5 min przy użyciu mikroskopu odwróconego (Nikon TE 2000).

 

Dyskusja

Komórki poddane działaniu stabilnych gradientów stężeń EGF w urządzeniu mikroprzepływowym migrowały w stronę wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek, indeks chemotaktyczny oraz ruchliwość migrujących komórek zostały zbadane za pomocą analizy śledzenia komórek. W związku z tym ta mikroprzepływowa platforma do generowania gradientów może być użyteczna w badaniach nad przerzutowaniem nowotworów, embriogenezą oraz prowadzeniem aksonów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
dekstran-FITC	Odczynnik	Sigma-Aldrich	FD10S	dekstran (10kD) znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)
hr-EGF		Invitrogen	13247-051	rekombinowany ludzki czynnik wzrostu naskórka
PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Poli(dimetylosiloksan) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb)
Negatywowy fotorezyst		MicroChem Corp.	SU-8 50
wafer krzemowy				wafer krzemowy, 4 cale
Szalki Petriego
Rurki polietylenowe		BD Biosciences	PE 20
PBS		Invitrogen
Fibonektyna
NIH 3T3	linia komórkowa			komórki fibroblastów
Mikroskop odwrócony		Nikon Instruments	TE 2000