Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Podsumowanie

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Streszczenie

Badania nad kohezją międzykomórkową i adhezją komórek do podłoża były historycznie prowadzone na kulturach monowarstwy przylegających do sztywnych podłoży. Jednakże komórki w obrębie tkanki są zazwyczaj zamknięte w gęsto upakowanej masie tkankowej, w której nawiązują one bliskie połączenia z wieloma sąsiednimi komórkami oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. W związku z tym środowisko chemiczne i siły fizyczne, którym podlegają komórki w tkance 3D, różnią się zasadniczo od tych, których doświadczają komórki hodowane w monowarstwie. Wykazano, że ma to znaczący wpływ na morfologię i sygnalizację komórkową. Opracowano kilka metod generowania 3D kultur komórkowych, w tym enkapsulację komórek w żelach kolagenowych¹ lub w rusztowaniach z biomateriałów². Metody te, choć użyteczne, nie odtwarzają ścisłej architektury bezpośredniej adhezji międzykomórkowej występującej w normalnych tkankach. Raczej bardziej przypominają one systemy hodowli, w których pojedyncze komórki są luźno rozproszone w trójwymiarowej sieci produktów ECM. Tutaj opisujemy prostą metodę, w której komórki umieszcza się w hodowli w kropli wiszącej i inkubuje w warunkach fizjologicznych do czasu utworzenia prawdziwych sferoidów 3D, w których komórki pozostają w bezpośrednim kontakcie ze sobą oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. Metoda ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może zostać dostosowana tak, aby umożliwić dodanie dowolnego czynnika biologicznego w bardzo małych ilościach, co może być istotne w wyjaśnianiu wpływu na interakcje międzykomórkowe lub interakcje komórka-ECM. Metodę tę można również wykorzystać do ko-hodowli dwóch (lub więcej) różnych populacji komórek, aby wyjaśnić rolę interakcji międzykomórkowych lub interakcji komórka-ECM w określaniu relacji przestrzennych między komórkami. Kohezja międzykomórkowa i adhezja komórka-ECM stanowią fundamenty badań nad rozwojem embrionalnym, interakcją komórek nowotworowych ze stroma w inwazji złośliwej, gojeniem ran oraz zastosowaniami w inżynierii tkankowej. Ta prosta metoda zapewni sposób generowania przypominających tkankę agregatów komórkowych do pomiaru właściwości biomechanicznych lub do analiz molekularnych i biochemicznych w fizjologicznie istotnym modelu.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

1. Adherentne kultury komórkowe należy hodować do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odlaniu płynu, dodać 2 ml (dla płytek 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Proces trypsynizacji należy przerwać, dodając 2 ml pożywki kompletnej, a następnie delikatnie pipetować mieszaninę za pomocą pipety 5 ml do uzyskania zawiesiny komórkowej. Komórki przenieść do probówki stożkowej 15 ml.
2. Dodać 40 μl roztoku DNAzy o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez 5 minut w RT. Krótko wymieszać na wortexie i wirować przy 200 XG przez 5 minut.
3. Odlać nadsącz i przemyć osad 1 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowej. Powtórzyć czynność, a następnie resuspendować komórki w 2 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowej.
4. Policzyć komórki za pomocą hemacytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie do 2,5 x 10⁶ komórek/ml. W niniejszej demonstracji użyto automatycznego licznika komórek BioRad TC10.

2. Formowanie kropel wiszących.

1. Zdejmij pokrywkę z 60 mm szalki hodowlanej i wlej 5 mls PBS na dno szalki. Będzie ona pełnić funkcję komory nawilżającej.
2. Odwróć pokrywkę i za pomocą pipety 20 μl nanieś krople o objętości 10 μl na jej wewnętrzną stronę. Upewnij się, że krople są rozmieszczone w odpowiednich odstępach, tak aby się nie stykały. Na jednej pokrywce można nanieść co najmniej 20 kropel.
3. Nałóż odwróconą pokrywkę na dno szalki wypełnione PBS i inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ i 95% wilgotności; monitoruj krople codziennie i inkubuj do czasu utworzenia się płatów komórkowych lub agregatów. Do oceny tworzenia się agregatów można użyć stereomikroskopu.
4. Po utworzeniu się płatów można je przenieść do szklanych kolb z okrągłym dnem zawierających 3 mls pełnej pożywki i inkubować w wytrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37°C i 5% CO₂ aż do momentu powstania sferoidów.

3. Uwagi

1. W zależności od wielkości komórek może być konieczna korekta stężenia w górę lub w dół.
2. Przed utworzeniem kropli wiszącej komórki można barwić fluorescencyjnymi barwnikami interkalującymi w błonę.
3. Dwa różne typy komórek można zbarwić różnymi barwnikami i wymieszać w stosunku 1:1 (lub innym) przed utworzeniem kropli wiszącej. Mogą to być komórki nowotworowe i stromalne, tkanki embrionalne lub komórki zmodyfikowane genetycznie tak, aby posiadały specyficzne sygnatury adhezyjne.
4. Komórki można odłączyć od naczyń hodowlanych, używając 0,05% trypsyny/2 mM wapnia, aby zachować funkcję kadheryn.
5. W zależności od eksperymentu można zmierzyć wielkość arkuszy lub wykorzystać agregaty do testów mechanicznych bądź do analiz biochemicznych lub molekularnych.

4. Reprezentatywne wyniki:

Tworzenie się arkusza lub sferoidy zazwyczaj następuje w ciągu 24 godzin, jednak czas ten może być dłuższy w zależności od typu komórek. Rysunek 1 przedstawia obrazy wykonane po 18 godzinach inkubacji nieleczonych komórek raka prostaty MAT-LyLu (MLL) w kulturze kropli wiszących (Rysunek 1A) oraz komórek traktowanych inhibitorem MEK PD98059 w stężeniu 25 μm. Należy zauważyć, że zastosowanie MEKi prowadzi do wyraźnego zagęszczenia arkusza komórkowego. Zagęszczenie można określić ilościowo, mierząc rozmiar 10–20 (lub więcej) kropli wiszących i porównując średnią wielkość między grupami badawczymi. Zazwyczaj analizujemy obrazy przy użyciu oprogramowania ImageJ, stosując progowanie każdego obrazu, a następnie konwertując obrazy na tryb binarny, po czym przeprowadzamy analizę cząstek w celu wyznaczenia całkowitej powierzchni obrazu w pikselach. Wartość tę można następnie łatwo przeliczyć na mikrony kwadratowe. Rysunek 2 przedstawia porównanie wielkości nieleczonych i traktowanych MEKi komórek MLL. Jak zaznaczono, zastosowanie MEKi znacząco redukuje wielkość arkusza, co potwierdzono testem t Studenta (P<0.0001). Do tego porównania zmierzono 10 agregatów dla każdej z grup komórek nieleczonych i traktowanych. Rysunek 3 przedstawia sferoidę embrionalnej wątroby kurczaka, utworzoną po 24 godzinach w kulturze kropli wiszących i 2 dniach w łaźni wytrząsowej.

Test wiszącej kropli można również zmodyfikować, aby objął więcej niż jeden typ komórek, co pozwala na ujawnienie przyjmowanego rozmieszczenia przestrzennego. Na przykład można wyizolować embrionalne komórki wątroby kurczaka, zabarwić je fluorescencyjnym barwnikiem interkalującym w błonę i zmieszać z embrionalnymi komórkami serca kurczaka, które zostały zabarwione innym markerem fluorescencyjnym. Rycina 4A pokazuje, że zamiast pozostać wymieszane, komórki wątroby i serca mają tendencję do „sortowania się” od siebie i przyjmowania konfiguracji sfery wewnątrz sfery, w której komórki serca są otoczone przez komórki wątroby. Konfigurację tę można wyjaśnić różnicami w adhezji międzykomórkowej między komórkami wątroby a komórkami serca. Koncepcja ta została skodyfikowana w hipotezie różnicowej adhezji (Differential Adhesion Hypothesis), która była wykorzystywana do wyjaśnienia zachowania sortowania komórek między tkankami zarodkowych warstw embrionów płazów³ i ryb kostnoszkieletowych ⁴, organizacji komórek wysepek trzustkowych ⁵ oraz sortowania komórek między dwiema populacjami komórek identycznymi pod każdym względem z wyjątkiem poziomów ekspresji tego samego typu kadheryny (⁶ i Rycina 4B). Wynik ten jest szczególnie istotny dla zademonstrowania, w jaki sposób zaprojektowanie prostej różnicy w adhezji między populacjami komórek może prowadzić do powstania struktury narządu, na przykład wysepki trzustkowej ⁵.

Rysunek 1. Obrazy komórek inkubowanych w kulturze kropli wiszącej przez 18 godzin w obecności (B) lub w nieobecności (A) 25 μm inhibitora MEK PD98059. Obrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego Nikon Eclipse TE 300 oraz cyfrowej kamery Photometrics CoolSnap ES.

Rysunek 2. Ilościowe określenie kondensacji komórek MLL raka prostaty szczura indukowanej przez MEKi. Hodowle w kropelkach wiszących z nieleczonych i leczonych MEKi komórek MLL inkubowano przez 18 godzin, po czym określono rozmiar agregatów zgodnie z powyższym opisem. Analizę statystyczną rozmiaru agregatów przeprowadzono za pomocą testu t Studenta. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę w rozmiarze agregatów (P<0.0001) między komórkami nieleczonymi a leczonymi MEKi i sugeruje, że leczenie MEKi prowadzi do powstania znacznie mniejszych i bardziej zwartych agregatów.

Rycina 3. Sferoid powstały w wyniku inkubacji zarodkowych komórek wątroby kurczaka w kulturze wiszącej kropli przez 18 godzin, a następnie w inkubatorze z wytrząsarką przez 48 godzin. Obraz został wykonany przy użyciu stereomikroskopu Nikon SMZ800 i kamery Sony Black CCD.

Rysunek 4. Hodowla w kropelce wiszącej wykazuje zachowanie sortowania między różnymi typami komórek. Na panelu A komórki zarodkowej wątroby kurczaka barwiono barwnikiem wbudowującym się w błonę PKH-2 i mieszano w równych proporcjach z komórkami zarodkowego serca kurczaka barwionymi PKH-26. Na panelu B dwa klony komórek L z transfekcją N-kadheryny (LN4 i LN2a), wykazujące ekspresję N-kad na swojej powierzchni w stosunku 2,4:1, zostały również zabarwione fluorescencyjnymi barwnikami wbudowującymi się w błonę PKH-2 i PKH-26 (Sigma-Aldrich), zmieszane w równych proporcjach i hodowane w kropelkach wiszących⁷. Po 18 godzinach hodowli arkusze komórkowe przeniesiono do kolb z wytrząsarką i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Agregaty utrwalono w 2% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i obrazowano za pomocą systemu skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego BioRad MRC600 połączonego z mikroskopem Nikon Optiphot-2. Zebrano przekroje optyczne z kanału zielonego i czerwonego, a stacja robocza Silicon Graphix Crimson VGX wyposażona w oprogramowanie do obrazowania Vital Images Voxel View Ultra służyła do przypisania kolorów sztucznych do obu kanałów i do nałożenia obrazów, co ujawniło powstałe konfiguracje anatomiczne. (A) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat wykazujący otaczanie komórek serca (tutaj w pseudokolorze żółtym) przez komórki wątroby w pseudokolorze niebieskim (z ⁸). (B) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat wykazujący otaczanie komórek o wysokiej ekspresji N-kadheryny (zielone) przez komórki o niższym poziomie ekspresji N-kadheryny (czerwone) (z ⁶).

Dyskusja

Badania wykazały, że hodowanie komórek w kontekście trójwymiarowym (3D) prowadzi do powstania odmiennej morfologii komórkowej i sygnalizacji w porównaniu z sztywnym systemem hodowli dwuwymiarowej (2D)⁹. Na przykład żele kolagenowe zasiedlone przez fibroblasty wykazują, że morfologia fibroblastów w 3D znacząco różni się od tej obserwowanej w 2D ^10,11. Podobnie, hodowla 3D może indukować tkankowo swoistą różnicowanie komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego. Systemy hodowli 3D były wykorzystywane do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
automatyczny licznik komórek	Bio-Rad	TC10
potrząsowa łaźnia wodna z pokrywą CO2	Labline Instruments	3540