Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Podsumowanie

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Streszczenie

Badania nad kohezją międzykomórkową i adhezją komórek do podłoża były historycznie prowadzone na kulturach monowarstwy przylegających do sztywnych podłoży. Jednakże komórki w obrębie tkanki są zazwyczaj zamknięte w gęsto upakowanej masie tkankowej, w której nawiązują one bliskie połączenia z wieloma sąsiednimi komórkami oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. W związku z tym środowisko chemiczne i siły fizyczne, którym podlegają komórki w tkance 3D, różnią się zasadniczo od tych, których doświadczają komórki hodowane w monowarstwie. Wykazano, że ma to znaczący wpływ na morfologię i sygnalizację komórkową. Opracowano kilka metod generowania 3D kultur komórkowych, w tym enkapsulację komórek w żelach kolagenowych¹ lub w rusztowaniach z biomateriałów². Metody te, choć użyteczne, nie odtwarzają ścisłej architektury bezpośredniej adhezji międzykomórkowej występującej w normalnych tkankach. Raczej bardziej przypominają one systemy hodowli, w których pojedyncze komórki są luźno rozproszone w trójwymiarowej sieci produktów ECM. Tutaj opisujemy prostą metodę, w której komórki umieszcza się w hodowli w kropli wiszącej i inkubuje w warunkach fizjologicznych do czasu utworzenia prawdziwych sferoidów 3D, w których komórki pozostają w bezpośrednim kontakcie ze sobą oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. Metoda ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może zostać dostosowana tak, aby umożliwić dodanie dowolnego czynnika biologicznego w bardzo małych ilościach, co może być istotne w wyjaśnianiu wpływu na interakcje międzykomórkowe lub interakcje komórka-ECM. Metodę tę można również wykorzystać do ko-hodowli dwóch (lub więcej) różnych populacji komórek, aby wyjaśnić rolę interakcji międzykomórkowych lub interakcji komórka-ECM w określaniu relacji przestrzennych między komórkami. Kohezja międzykomórkowa i adhezja komórka-ECM stanowią fundamenty badań nad rozwojem embrionalnym, interakcją komórek nowotworowych ze stroma w inwazji złośliwej, gojeniem ran oraz zastosowaniami w inżynierii tkankowej. Ta prosta metoda zapewni sposób generowania przypominających tkankę agregatów komórkowych do pomiaru właściwości biomechanicznych lub do analiz molekularnych i biochemicznych w fizjologicznie istotnym modelu.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

1. Adherentne kultury komórkowe należy hodować do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odlaniu płynu, dodać 2 ml (dla płytek 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Proces trypsynizacji należy przerwać, dodając 2 ml pożywki kompletnej, a następnie delikatnie pipetować mieszaninę za pomocą pipety 5 ml do uzyskania zawiesiny komórkowej. Komórki przenieść do probówki stożkowej 15 ml.
2. Dodać 40 μl roztoku DNAzy o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez 5 minut w RT. Krótko wymieszać na wortexie i wirować przy....

Dyskusja

Badania wykazały, że hodowanie komórek w kontekście trójwymiarowym (3D) prowadzi do powstania odmiennej morfologii komórkowej i sygnalizacji w porównaniu z sztywnym systemem hodowli dwuwymiarowej (2D)⁹. Na przykład żele kolagenowe zasiedlone przez fibroblasty wykazują, że morfologia fibroblastów w 3D znacząco różni się od tej obserwowanej w 2D ^10,11. Podobnie, hodowla 3D może indukować tkankowo swoistą różnicowanie komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego. Systemy hodowli 3D były wykorzystywane do .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
automatyczny licznik komórek	Bio-Rad	TC10
potrząsowa łaźnia wodna z pokrywą CO2	Labline Instruments	3540