Prosty protokół hodowli komórek wiszących do generowania sferoid 3D

Podsumowanie

Opisujemy prostą, szybką metodę generowania 3D sferoid podobnych do tkanek i ich potencjalne zastosowanie do ilościowego określania różnic w interakcjach komórka-komórka.

Streszczenie

Badania nad kohezją komórka-komórka i adhezją komórka-podłoże były historycznie prowadzone na jednowarstwowych kulturach przylegających do sztywnych substratów. Komórki w tkance są jednak zwykle zamknięte w ciasno upakowanej masie tkankowej, w której komórki nawiązują bliskie połączenia z wieloma bliskimi sąsiadami i składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej. W związku z tym środowisko chemiczne i siły fizyczne doświadczane przez komórki w tkance 3D zasadniczo różnią się od tych, których doświadczają komórki hodowane w hodowli jednowarstwowej. Wykazano, że ma to znaczący wpływ na morfologię komórkową i sygnalizację. Opracowano kilka metod generowania kultur komórkowych 3D, w tym enkapsulację komórek w żelach kolagenowych¹lub w rusztowaniach biomateriałowych². Takie metody, choć przydatne, nie podsumowują intymnej bezpośredniej architektury adhezji komórka-komórka, którą można znaleźć w normalnych tkankach. Są one raczej bardziej zbliżone do systemów hodowli, w których pojedyncze komórki są luźno rozproszone w siatce 3D produktów ECM. Tutaj opisujemy prostą metodę, w której komórki umieszcza się w hodowli wiszącej kropli i inkubuje w warunkach fizjologicznych, aż utworzą prawdziwe sferoidy 3D, w których komórki są w bezpośrednim kontakcie ze sobą i ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być dostosowana do dodawania dowolnego czynnika biologicznego w bardzo małych ilościach, które mogą być interesujące w wyjaśnianiu wpływu na interakcję komórka-komórka lub komórka-ECM. Metoda ta może być również stosowana do wspólnej hodowli dwóch (lub więcej) różnych populacji komórek, aby wyjaśnić rolę interakcji komórka-komórka lub komórka-ECM w określaniu relacji przestrzennych między komórkami. Kohezja komórka-komórka i adhezja komórka-ECM są podstawą badań nad rozwojem embrionalnym, interakcją komórek nowotworowo-zrębowych w inwazji nowotworów, gojeniu się ran oraz do zastosowań w inżynierii tkankowej. Ta prosta metoda pozwoli na generowanie podobnych do tkanek agregatów komórkowych do pomiaru właściwości biomechanicznych lub do analizy molekularnej i biochemicznej w fizjologicznie istotnym modelu.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

1. Przylegające hodowle komórkowe należy wyhodować do 90% zbieżności, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odsączeniu dodać 2 ml (na płytki 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37°C, aż komórki się oderwą. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 2 ml kompletnej pożywki i delikatnie użyj pipety o pojemności 5 ml, aby rozcierać mieszaninę, aż komórki znajdą się w zawiesinie. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
2. Dodać 40 μl 10 mg/ml preparatu DNAzy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Krótko wirować i odwirowywać przy 200 XG przez 5 minut.
3. Odrzucić supernatant i przemyć osad 1 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowych. Powtórzyć, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowych.
4. Policz komórki za pomocą hemacytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie do 2,5 x 10⁶ komórek/ml. Do tej demonstracji wykorzystano automatyczny licznik komórek BioRad TC10.

2. Powstawanie wiszących kropli.

1. Zdejmij pokrywkę z naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i umieść 5 ml PBS na dnie naczynia. Będzie to działać jak komora nawadniająca.
2. Odwróć pokrywkę i za pomocą pipety o pojemności 20 μl nanieś 10 μl kropli na dno pokrywki. Upewnij się, że krople są umieszczone wystarczająco oddalone, aby się nie stykały. Możliwe jest umieszczenie co najmniej 20 kropli na naczyniu.
3. Odwróć pokrywkę na dolną komorę wypełnioną PBS i inkubuj w temperaturze 37°C/5% CO₂/95% wilgotności, codziennie monitoruj krople i inkubuj, aż utworzą się arkusze komórek lub agregaty. Mikroskop stereoskopowy może być używany do oceny tworzenia się agregatów.
4. Po uformowaniu arkuszy można je przenieść do okrągłodennych szklanych kolb do wytrząsania zawierających 3 ml kompletnego podłoża i inkubować w łaźni wodnej z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 aż} do powstania sferoid.

3. Uwagi

1. W zależności od wielkości komórki może być konieczne dostosowanie stężenia w górę lub w dół.
2. Komórki można barwić barwnikami fluorescencyjnymi interkalującymi błonę przed powstaniem kropli wiszącej.
3. Dwa różne typy komórek mogą być różnie barwione i mieszane w stosunku 1:1 (lub innym) przed utworzeniem wiszących kropli. Mogą to być komórki rakowe i zrębowe, tkanki embrionalne lub komórki genetycznie zmodyfikowane tak, aby miały określone sygnatury adhezyjne.
4. Komórki można odłączyć od naczyń do hodowli tkankowych przy użyciu 0,05% trypsyny/2 mM wapnia, aby zachować funkcję kadheryny.
5. W zależności od eksperymentu, rozmiary arkuszy mogą być mierzone lub agregaty mogą być używane do testów mechanicznych lub do analizy biochemicznej lub molekularnej.

4. Reprezentatywne wyniki:

Formowanie się arkusza lub sferoidy zwykle następuje w ciągu 24 godzin, ale może trwać dłużej w zależności od typu komórki. Rycina 1 przedstawia obrazy uchwycone po 18 godzinach inkubacji nieleczonych komórek MAT-LyLu (MLL) raka gruczołu krokowego w hodowli wiszącej (ryc. 1A) lub komórek traktowanych inhibitorem MEK 25 μm PD98059. Należy pamiętać, że obróbka MEKi powoduje wyraźne zagęszczenie arkusza komórek. Zagęszczenie można określić ilościowo, mierząc wielkość 10-20 (lub więcej) zwisających kropli i porównując średnią wielkość między grupami poddawanymi zabiegowi. Zazwyczaj analizujemy obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ, progując każdy obraz, a następnie konwertując obrazy do trybu binarnego, po czym stosujemy analizę cząstek, aby ujawnić całkowity obszar obrazu w pikselach. Można to następnie łatwo przeliczyć na mikrony kwadratowe. Rysunek 2 przedstawia porównanie rozmiarów komórek MLL nieleczonych i MEKi. Jak już wspomniano, obróbka MEKi znacznie zmniejsza rozmiar arkusza w porównaniu z testem t-Studenta (P<0,0001). Dla tego porównania zmierzono 10 agregatów dla każdej z komórek nietraktowanych i poddanych działaniu środka. Rycina 3 przedstawia sferoidę embrionalną wątroby pisklęcia utworzoną po 24 godzinach w hodowli w wiszącej kropli i 2 dniach w kąpieli z wytrząsarką.

Test wiszącej kropli może być również zmodyfikowany tak, aby zawierał więcej niż jeden typ komórki, aby ujawnić przyjęte pozycjonowanie przestrzenne. Na przykład embrionalne komórki wątroby kurcząt można wyizolować, wybarwić barwnikiem fluorescencyjnym interkalującym błonę i zmieszać z komórkami serca zarodka pisklęcia, które zostały wybarwione innym markerem fluorescencyjnym. Rycina 4A pokazuje, że komórki wątroby i serca nie pozostają wymieszane, mają tendencję do "sortowania" się od siebie i przyjmowania konfiguracji sfery w sferze, w której komórki serca są otoczone komórkami wątroby. Tę konfigurację można wytłumaczyć różnicami w adhezji międzykomórkowej między komórkami wątroby i serca. Koncepcja ta jest skodyfikowana w Hipotezie Adhezji Różnicowej, która została wykorzystana do wyjaśnienia zachowania sortowania komórek między tkanką embrionalnej warstwy rozrodczej dla zarodków³i teleost ⁴, dla organizacji komórek wysp trzustkowych ⁵oraz dla sortowania komórek między dwiema populacjami komórek identycznymi pod każdym względem innym niż dla poziomów ekspresji tego samego rodzaju kadheryny (⁶i rysunek 4B). Wynik ten jest szczególnie ważny dla pokazania, w jaki sposób inżynieria prostej różnicy w adhezji między populacjami komórek może prowadzić do wytworzenia struktury narządów, na przykład wyspy trzustkowej ⁵.

Rysunek 1. Obrazy komórek inkubowanych w hodowli wiszącej przez 18 godzin przy braku (A) lub obecności (B) 25 μm inhibitora MEK PD98059. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego Nikon Eclipse TE 300 oraz aparatu cyfrowego Photometrics CoolSnap ES.

Rysunek 2. Kwantyfikacja indukowanego przez MEKi zagęszczenia komórek MLL raka prostaty szczura. Wiszące kultury kroplowe komórek MLL niepoddanych działaniu substancji i potraktowanych MEKi inkubowano przez 18 godzin, po czym określono wielkość agregatu, jak opisano powyżej. Analizę statystyczną zagregowanej wielkości przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta. Gwiazdka reprezentuje statystycznie istotną różnicę w wielkości agregatu (P<0,0001) między komórkami nietraktowanymi a komórkami poddanymi działaniu MEKi i sugeruje, że traktowanie MEKi skutkuje znacznie mniejszymi i bardziej zwartymi agregatami.

Rysunek 3. sferoida utworzona przez inkubację embrionalnych komórek wątroby piskląt w hodowli wiszącej przez 18 godzin, a następnie w inkubatorze/kąpieli wstrząsającej przez 48 godzin. Zdjęcie zostało wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego Nikon SMZ800 i kamery Sony Black CCD.

Rysunek 4. Hodowla w wiszącej kropli ujawnia zachowanie sortowania między różnymi typami komórek. W panelu A embrionalne komórki wątroby kurcząt wybarwiono barwnikiem interkalacyjnym błony PKH-2 i zmieszano w równych proporcjach z barwionymi PKH-26 komórkami embrionalnym serca piskląt. W panelu B dwa transfekowane N-kadheryną klony komórek L (LN4 i LN2a), wyrażające N-cad na swoich powierzchniach w stosunku 2,4:1, zostały również wybarwione barwnikami interkalacyjnymi z membraną fluorescencyjną PKH-2 i PKH-26 (Sigma-Aldrich), zmieszanymi w równych proporcjach i wyhodowanymi jako wiszące krople⁷. Po 18 godzinach w hodowli, arkusze komórek przeniesiono do kolb wstrząsających i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Agregaty utrwalono w 2% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami i obejrzano za pomocą skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego BioRad MRC600 podłączonego do mikroskopu Optiphot-2 firmy Nikon. Pobrano skrawki optyczne zarówno z kanału zielonego, jak i czerwonego, a stacja robocza Silicon Graphix Crimson VGX wyposażona w oprogramowanie do obrazowania Vital Images Voxel View Ultra została wykorzystana do przypisania fałszywych kolorów do obu kanałów i połączenia obrazów, ujawniając wygenerowane konfiguracje anatomiczne. (A) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat demonstrujący otoczenie komórek serca (tutaj w pseudo-kolorze żółtym) przez komórki wątroby w pseudokolorze niebieskim (od ⁸). (B) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat demonstrujący otoczenie komórek o wysokiej ekspresji N-kadheryny (zielony) przez komórki wyrażające niższe poziomy N-kadheryny (czerwony) (od ⁶).

Dyskusja

Badania wykazały, że hodowla komórek w kontekście trójwymiarowym (3D) wytwarza odrębną morfologię komórkową i sygnalizację w porównaniu ze sztywnym dwuwymiarowym (2D) systemem hodowli⁹. Na przykład żele kolagenowe wypełnione fibroblastami pokazują, że morfologia fibroblastów w 3D jest zupełnie inna niż obserwowana w 2D ^10,11. Podobnie, hodowla 3D może indukować specyficzne tkankowo różnicowanie komórek nabłonka sutka. Systemy hodowli 3D zostały wykorzystane do rozróżnienia między komórkami normalnym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
automatyczny licznik komórek	Bio-Rad	TC10
wodna z wytrząsaniem z pokrywą szczytową CO2	Labline Instruments	3540