Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Podsumowanie

Opracowano nowy eksperyment impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem pręta Kolsky'ego w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych urazowego uszkodzenia mózgu wywołanego falą uderzeniową.

Streszczenie

Opracowano nowatorski eksperyment impulsywnego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem urządzenia typu pręt Kolskiego w celu zbadania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) wywołanego falą uderzeniową. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy, w jaki sposób impulsywne zwiększanie ciśnienia, istotne w kontekście TBI wywołanego falą uderzeniową, jest stosowane wobec komórek neuronalnych in vitro. Jest to osiągane poprzez wykorzystanie dobrze kontrolowanego impulsu ciśnienia wytworzonego przez specjalistyczne urządzenie typu pręt Kolskiego, przy jednoczesnym zapisie pełnej historii ciśnienia wewnątrz komory do zwiększania ciśnienia w komórkach. Komórki neuronalne poddane ciśnieniu są badane bezpośrednio po zabiegu lub inkubowane dalej, aby zbadać długofalowe efekty impulsywnego zwiększania ciśnienia na wzrost neurytów/aksonów, ekspresję genów neuronalnych, apoptozę itp. Zaobserwowano, że impulsywne zwiększanie ciśnienia do około 2 MPa indukuje wyraźną utratę neurytów w porównaniu z komórkami niepoddanymi ciśnieniu. Nasza technika stanowi nową metodę badania mechanizmów molekularnych i komórkowych blast TBI poprzez impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach mózgu przy dobrze kontrolowanej wartości i czasie trwania ciśnienia.

Protokół

1. Kultura komórek neuronalnych

1. Jako model komórkowy można wykorzystać komórki mózgowe, w tym neurony, astrocyty oraz ich kokultury. W ramach demonstracji wykonalności przedstawiono impulsowe ciśnienie przyłożone do linii komórkowej neuronów.
2. Ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) hoduje się na szklanych lamellkach o średnicy 18 mm. Komórki wysiewa się w zagęszczeniu 3×10³ cells/cm² z użyciem pożywki wzrostowej składającej się z DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Szklane lamellki z hodowlą komórek przechowywane są w inkubatorze z 5% CO₂ i nawilżoną atmosferą w temperaturze 37°C.
3. Aby uzyskać różnicowanie neuronalne komórek SH-SY5Y, traktuje się je pożywką dodatkowo uzupełnioną o 10 μM kwasu retinowego (RA) przez 7 dni, wymieniając pożywkę co dwa dni. W 7. dniu komórki są gotowe do poddania działaniu ciśnienia.

2. Sprzęt do utrwalania ciśnienia: pręt Kolsky'ego

1. Pręt Kolsky’ego, opracowany przez Kolsky’ego¹ w 1949 roku, jest wykorzystywany do pomiaru właściwości mechanicznych materiału przy bardzo wysokiej prędkości obciążania. Aparatura składa się z dwóch prętów, pomiędzy którymi umieszczana jest próbka. Fala naprężeń, wytworzona w pręcie padającym, rozprzestrzenia się do próbki, gdzie rozdziela się na falę odbitą i transmitowaną. Naprężenie w próbce jest proporcjonalne do fali transmitowanej. W niniejszym badaniu wykorzystujemy komorę do ciśnieniowego obciążania komórek, która jest umieszczana pomiędzy dwoma prętami w układzie Kolsky’ego.
2. Dwa pręty ze stopu aluminium (każdy o długości 6 m) są zawieszone na wyrównanych łożyskach mosiężnych, a pomiędzy prętami umieszczona jest komora do ciśnieniowego obciążania komórek in vitro. Pręt upstream jest prętem padającym, na którego jednym końcu zamocowana jest masa 130 lb. Zacisk cierny jest umieszczony w pozycji, która zapewni pożądany czas trwania impulsu. Poprzez zaciśnięcie zacisku i dokręcenie podnośnika nożycowego pomiędzy masą a wspornikiem obciążającym, sekcja zacisk-masa pręta padającego zostaje wstępnie ściśnięta do pożądanego poziomu. Gwałtowne zerwanie naciętej śruby blokującej zacisk za pomocą układu hydraulicznego szybko uwalnia zmagazynowaną kompresję, generując tym samym impuls ciśnienia. Impuls ten rozprzestrzenia się przez pręt padający, porusza tłokiem komory testowej i impulsowo zwiększa ciśnienie cieczy oraz komórek wewnątrz komory. Wzrost ciśnienia w komorze inicjuje z kolei impuls ciśnienia rozprzestrzeniający się w pręcie transmitowanym downstream. Odkształcenia związane z impulsami ciśnienia w prętach są mierzone za pomocą złożonych tensometrów wysokoomowych wzbudzonych napięciem 45 V. Sygnały z tensometrów są rejestrowane cyfrowym oscyloskopem z częstotliwością 1 MHz jako historia obciążenia.
3. Komora do ciśnieniowego obciążania komórek in vitro składa się z układu tłok-cylinder. Cylinder ma średnicę wewnętrzną 2,6 cm i średnicę zewnętrzną 3,8 cm, a u podstawy otworu znajduje się niewielki otwór gwintowany. Otwór ten służy jako odpowietrznik powietrza i odpływ nadmiaru cieczy podczas instalacji próbki komórek. Tłok ma długość 7,5 cm i jest wykonany z tego samego materiału co pręty. Tłok jest owinięty dwiema lub trzema warstwami taśmy teflonowej, która pełni funkcję uszczelnienia o niskim tarciu. Nakrętka końcowa ma długość 32 mm i posiada dwie małe śruby ze stali nierdzewnej, które mocują szkiełka podstawowe (na których hodowane są komórki) podczas obciążania.

3. Impulsywne ciśnieniowe traktowanie komórek neuronalnych

1. Wszystkie elementy komory ciśnieniowej są sterylizowane w autoklawie i przechowywane pod światłem UV. Montaż komory odbywa się w komorze do hodowli komórek. Śruba odpowietrzająca w komorze jest luźno wkręcona w otwór odpowietrzający u podstawy wnęki. Świeże, podgrzane (37°C) medium wzrostowe jest pipetowane do komory w sposób niepowodujący powstawania pęcherzyków. Następnie pobiera się szkiełko podstawowe z hodowlą komórek i umieszcza je na nakrętce tłoka (komórki skierowane na zewnątrz). Małe śruby mocujące są dokręcane do szkiełka, aby utrzymać je na miejscu. Tłok ze szkiełkiem z hodowlą komórek jest lekko wsuwany do wnęki komory, a cały zespół jest przechylany tak, aby otwór odpowietrzający znajdował się w najwyższym punkcie. Śrubę odpowietrzającą się wykręca, a tłok wpycha do wnęki, wypychając najpierw pęcherzyki powietrza, a następnie nadmiar cieczy. Jako prowadnica służy znacznik referencyjny lub szablon, aby zapewnić taką samą objętość medium hodowlanego dla każdego testu. Wymiar osiowy medium w komorze wynosi około 6 mm. Należy zdezynfekować śrubę odpowietrzającą i wkręcić ją z powrotem, aby zapewnić szczelność komory. Komora nie powinna przeciekać pod tym statycznym obciążeniem; jeśli tak się dzieje, należy wymienić lub wzmocnić owijkę teflonową.
2. W tym momencie system prętów Kolsky'ego jest resetowany. Ciężka masa jest przesuwana z powrotem do pozycji wyjściowej, a zużyty (przerwana) sworzeń blokujący jest zastępowany nowym. Nowy sworzeń blokujący jest zaciskany za pomocą hydrauliki do ciśnienia około 200 psi. Używając podnośnika nożycowego, należy ścisnąć sekcję wstępnego obciążenia pręta uderzającego do ciśnienia nieco wyższego niż wartość pożądana, a następnie nieco poluzować, aby w pełni wykorzystać tarcie śruby podnośnika. System akwizycji danych jest teraz uzbrojony.
3. Zmontowana komora ciśnieniowa do komórek jest montowana w systemie. Jest ona umieszczana w klocu V wspieranym przez mały laboratoryjny podnośnik nożycowy i wyrównywana względem dwóch prętów. Każdy styk należy przesmarować cienką warstwą smaru i przetrzeć powierzchnie styku o siebie, aby wyeliminować wszelkie przerwy powietrzne pomiędzy nimi.
4. Test jest teraz gotowy do przeprowadzenia. Sworzeń blokujący zacisk zostaje gwałtownie zerwany poprzez szybkie pompowanie hydraulicznego napędu zacisku. Zacisk rozdzieli się, a system akwizycji danych powinien wyświetlić wyniki. Historia ciśnienia komórek jest wyznaczana z pomiarów przetwornika pręta transmitowanego. Jeśli użyty pręt transmitowany jest wystarczająco długi, pomiar ten powinien obejmować okres od pierwszego zaburzenia do punktu, w którym pomiary wykażą ciśnienie ujemne. Czas trwania impulsu transmitowanego może być krótszy niż impulsu uderzającego, jeśli wewnątrz uwięziony jest pęcherzyk powietrza. Amplituda może nie osiągnąć poziomu impulsu uderzającego, ale powinna wykazywać wystarczająco długi plateau przed rozładowaniem. W przeciwnym razie mógł wystąpić albo duży pęcherzyk powietrza w szczelnej komorze, albo brak osiowości między zespołem a prętem.
5. Następnie komora ciśnieniowa do komórek jest wyjmowana i demontowana w komorze do hodowli komórek. Śrubę odpowietrzającą się wykręca, a tłok wyciąga z komory. Szkiełko podstawowe z hodowlą komórek jest pobierane z końca tłoka.

4. Ocena zachowania komórek pod ciśnieniem

1. Po utwornieniu nadciśnienia komórki można poddać natychmiastowej inspekcji lub inkubować dalej w celu późniejszego badania. Przy zachowaniu odpowiednich procesów pracy aseptycznej możliwa jest dłuższa inkubacja po zabiegu.
2. Komórki poddane nadciśnieniu można badać za pomocą wszystkich technik biologii molekularnej i komórkowej. W przypadku nadciśnienia komórek neuronalnych, w celu zbadania fizjologii komórkowej i molekularnej w warunkach TBI, można przeprowadzić analizy oceniające zmiany indukowane ciśnieniem w obrastaniu neurytów, zmiany cytoszkieletu mikrotubularnego, ekspresję genów neuronalnych, apoptozę itp. Jako kontrolne próbki komórek stosuje się komórki hodowane w ten sam sposób i przetrzymywane w komorze nadciśnieniowej przez ten sam okres czasu, ale niepoddane nadciśnieniu (tzw. kontrola komory).
3. W celu oceny zmian w obrastaniu neurytów, komórki poddane nadciśnieniu oraz komórki kontrolne z komory bada się pod mikroskopem optycznym bezpośrednio po nadciśnieniu oraz po 1 i 24 h inkubacji. Przykład obrazów komórek neuronalnych przedstawiono w sekcji „Representative Results” (Rysunek 2). Zmianę długości neurytów można określić ilościowo za pomocą immunofluorescencyjnego barwienia aktyny i analizy obrazu. Komórki utrwalono 4% w/v roztworem paraformaldehydu, przemyto buforem piorącym z 0,05% v/v Tween-20 i permeabilizowano 0,1% v/v roztworem Triton X-100. Po blokowaniu 1% w/v roztworem albuminy surowicy bydlęcej, komórki inkubowano z faloidyną sprzężoną z izotiocyjanianem tetrametylorodaminy (TRITC). Obrazy immunofluorescencyjne komórek wykonano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a długości neurytów w komórkach poddanych nadciśnieniu i kontrolnych wyznaczono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH).
4. Neuryty można zidentyfikować jako aksony lub dendryty. Aby ocenić zmiany morfologiczne w aksonach lub dendrytach, opisane powyżej eksperymenty można powtórzyć, stosując przeciwciała wykrywające każdą z tych struktur, tj. przeciwciała przeciwko neurofilamentom (NF) dla aksonów i przeciwciała przeciwko białku związanemu z mikrotubulami (MAP2) dla dendrytów.
5. Mikrotubule są jednym z kluczowych komponentów cytoszkieletu neuronów, a uszkodzenia mikrotubul są wykorzystywane jako marker urazu neuronalnego.² Mikrotubule można zwizualizować immunofluorescencyjnie, stosując przeciwciało przeciwko β-tubulinie. Komórki utrwalono po 0 i 24 h od nadciśnienia, zabarwiono przeciwciałem przeciwko β-tubulinie i obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.
6. Aby ocenić wpływ impulsowego nadciśnienia na ekspresję genów neuronalnych i apoptotycznych, z komórek poddanych nadciśnieniu i kontrolnych wyekstrahowano całkowite RNA. Ekspresję genów można zbadać, przeprowadzając ilościową RT-PCR lub RT-PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z naszymi opublikowanymi protokołami.³

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Przykład profilu ciśnienia przyłożonego do komórek w komorze ciśnieniowej. Aparatura pręta Kolskiego z powodzeniem generuje impulsowe ciśnienie typu jednopulsowego o wartości 2 MPa i czasie trwania około 0,7 ms.

Rysunek 2. Przykład odpowiedzi komórek neuronalnych na impulsowe ciśnienie. Komórki SH-SY5Y poddane impulsowemu ciśnieniu o wartości 2 MPa wykazują wyraźną degradację neurytów/aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w komorze.

6. Trudności i rozwiązania

1. Uszczelnienie komory jest jedną z głównych przeszkód do pokonania. Stwierdzono, że szerokie dyski z o-ringami mają tendencję do żłobienia i zwiększonego tarcia. Aby wyeliminować efekty tarcia oraz zapobiec żłobieniu, stosuje się prostą metodę owijania tłoka teflonową taśmą hydrauliczną. Rozwiązuje to opisane problemy i pozwala uzyskać pożądany poziom oraz czas trwania ciśnienia.
2. Zachowanie komórek neuronalnych pod ciśnieniem, zwłaszcza przy ocenie wtórnych mechanizmów TBI lub efektów długoterminowych, powinno być badane po długim czasie po inkubacji. Komora zawierająca komórki jest narażona na potencjalnie niejałowe warunki podczas przenoszenia do pręta Kolsky'ego, utłaczniania i przenoszenia z powrotem do dygestorium. Dzięki wstępnej sterylizacji części komory oraz prawidłowej procedurze montażu i demontażu szkiełka z kulturą komórek i komory wewnątrz dygestorium, możliwa jest długoterminowa inkubacja po zabiegu, trwająca nawet kilka tygodni.
3. Powtarzalność danych jest ważnym parametrem w eksperymentach z mechaniczną stymulacją komórkową. W przypadku naszego urządzenia powtarzalność odpowiedzi komórek neuronalnych jest określana przez to, jak wielokrotnie udaje się uzyskać pożądany impulsowy profil ciśnienia, zarówno pod kątem poziomu, jak i czasu trwania. Ponieważ rejestrujemy uzyskany profil ciśnienia dla każdego cyklu, dane dotyczące odpowiedzi komórkowej z niepożądanych profili ciśnienia mogą zostać później ręcznie wykluczone.
4. Cały proces utłaczniania, obejmujący montaż komory, przeniesienie i zamocowanie w pręcie Kolsky'ego, samo utłacznianie, przeniesienie z powrotem oraz demontaż komory, trwa mniej niż 10 min. Kolejne szkiełko z kulturą komórek może zostać poddane utłacznianiu natychmiast po poprzednim cyklu. Dzięki temu można sprawnie przeprowadzić wystarczającą liczbę eksperymentów. Nasz zestaw wykorzystuje szkiełka podstawowe o średnicy 18 mm. Jeden eksperyment utłaczniania nie dostarcza wystarczającej ilości białek do western immunoblottingu ze względu na rozmiar podłoża (a także częściowo dlatego, że niektóre z utłaczanych komórek obumierają). Około trzech powtórzonych eksperymentów utłaczniania zapewnia ilość białka wymaganą do immunoblottingu. Ponownie, powtarzalność jest za każdym razem weryfikowana za pomocą profilu ciśnienia.

Dyskusja

W celu badania uszkodzeń komórek mózgowych w warunkach TBI (urazowego uszkodzenia mózgu) zastosowano wiele technik eksperymentalnych in vitro. Obejmują one m.in. rozciąganie neuronów/astrocytów, naprężenia ścinające indukowane przepływem, upuszczanie ciężarka, nacięcia rylcem, przecięcia laserowe oraz litotrypsję.^4,5 Przyjęto, że dominującym czynnikiem fizycznym w przypadku TBI jest krótkotrwałe nadciśnienie.^6,7 W szczególności fala uderzeniowa w blast TBI (urazie wywołanym wybuchem) ma czas trwania impulsu rzędu milisekund.⁴ W oparciu o to założenie i obserwacje opracowano komorę barometryczną zdolną do przejściowego zwiększania ciśnienia, która jest wykorzystywana do oceny zachowania komórek mózgu w warunkach TBI. Na przykład w komorze do barotraumy z uderzeniem cieczowym zastosowano impuls ciśnienia o czasie trwania 20-30 ms i ciśnieniu szczytowym do 0,5 MPa, aby zbadać zachowanie ludzkich komórek glejowych w warunkach TBI.⁶ Niedawno VandeVord i wsp.⁷ użyli barometrycznej komory z uderzeniem metalowej kuli do badania zachowania astrocytów w warunkach TBI, jednak uderzenie metalowej kuli generowało wielokrotne impulsy ciśnienia. W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowatorskie urządzenie do kompresji komórek, które generuje impulsowe nadciśnienie typu jednopulsowego. Urządzenie zostało opracowane na podstawie układu pręta Kolsky'ego, który był wykorzystywany jako aparat do badań materiałowych w naszych⁸ oraz innych badaniach.^1,9 Zdolność pręta Kolsky'ego do testowania materiałów przy bardzo wysokiej prędkości obciążania została zmodyfikowana tak, aby umożliwić przyłożenie nadciśnienia typu jednopulsowego do hodowanych komórek wewnątrz komory ciśnieniowej (Rysunek 1). Udało nam się skutecznie kontrolować wartość i czas trwania impulsowego nadciśnienia. Jako reprezentatywną odpowiedź komórkową wykazaliśmy, że przy ciśnieniu 2 MPa komórki neuronalne SH-SY5Y wykazują znaczną utratę neurytów i aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w nieociśnionej komorze.

Podsumowując, opracowaliśmy nowatorską aparaturę do impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach, wykorzystując specjalnie zaprojektowane urządzenie w postaci pręta Kolsky'ego, oraz wykazaliśmy potencjał jego zastosowania w badaniu odpowiedzi komórek neuronalnych w warunkach TBI. Zauważamy również, że technika ta jest bardzo wszechstronna, ponieważ dowolny typ komórek może zostać poddany działaniu ciśnień impulsowych o różnym natężeniu i czasie trwania. W związku z tym urządzenie może być wykorzystywane do badania zachowań mechanotransdukcji komórkowej indukowanej ciśnieniem impulsowym, nie tylko w celu uszkadzania komórek, ale także do ich pozytywnej stymulacji w zakresie funkcji i determinacji losu komórkowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)
szklane laminki o średnicy 18 mm
pożywka do hodowli komórkowej: DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny
kwas retinowy (10 μM) do indukowania neurogenezy
urządzenie do impulsowegoy pressuryzacji z prętem Kolsky'ego
tłokowo-cylindryczna komora do pressuryzacji komórek
śruby ze stali nierdzewnej do mocowania laminki z hodowlą komórek na tłoku
smar do powierzchni styku między komorą komórkową a prętem Kolsky'ego
ogólne odczynniki do biologii molekularnej do oceny odpowiedzi komórek na pressuryzację (utrwalacz, przeciwciała, barwnik fluorescencyjny, odczynniki do PCR itp.)