Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Podsumowanie

Opracowano nowy eksperyment impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem pręta Kolsky'ego w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych urazowego uszkodzenia mózgu wywołanego falą uderzeniową.

Streszczenie

Opracowano nowatorski eksperyment impulsywnego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem urządzenia typu pręt Kolskiego w celu zbadania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) wywołanego falą uderzeniową. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy, w jaki sposób impulsywne zwiększanie ciśnienia, istotne w kontekście TBI wywołanego falą uderzeniową, jest stosowane wobec komórek neuronalnych in vitro. Jest to osiągane poprzez wykorzystanie dobrze kontrolowanego impulsu ciśnienia wytworzonego przez specjalistyczne urządzenie typu pręt Kolskiego, przy jednoczesnym zapisie pełnej historii ciśnienia wewnątrz komory do zwiększania ciśnienia w komórkach. Komórki neuronalne poddane ciśnieniu są badane bezpośrednio po zabiegu lub inkubowane dalej, aby zbadać długofalowe efekty impulsywnego zwiększania ciśnienia na wzrost neurytów/aksonów, ekspresję genów neuronalnych, apoptozę itp. Zaobserwowano, że impulsywne zwiększanie ciśnienia do około 2 MPa indukuje wyraźną utratę neurytów w porównaniu z komórkami niepoddanymi ciśnieniu. Nasza technika stanowi nową metodę badania mechanizmów molekularnych i komórkowych blast TBI poprzez impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach mózgu przy dobrze kontrolowanej wartości i czasie trwania ciśnienia.

Protokół

1. Hodowla komórek neuronalnych

1. Jako model komórkowy można wykorzystać komórki mózgu, w tym neurony, astrocyty oraz ich kokultury. W ramach demonstracji wykonalności przedstawiono impulsowe ciśnienie przyłożone do linii komórkowej neuronów.
2. Komórki neuroblastoma człowieka SH-SY5Y (ATCC, CRL-226) hoduje się na szklanych kryształkach o średnicy 18 mm. Komórki wysiewa się z gęstością 3×10³ cells/cm² w medium wzrostowym składającym się z DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Szkiełka z hodowlami komórkowymi przechowuje się w inkubatorze z 5% CO₂ w warunkach uwilgotnienia i temperaturze 37°C.
3. W celu uzyskania różnicowania neuronów z komórek SH-SY5Y, komórki poddaje się działaniu medium dodatkowo uzupełnionego o 10 μM kwasu retinowego (RA) przez 7 dni, zmieniając medium co dwa dni. W 7. dniu komórki są gotowe do poddania procesowi ciśnieniowemu.

2. Sprzęt do wytwarzania ciśnienia: rura Kolsky'ego

1. Pręt Kolsky'ego, opracowany przez Kolsky'ego¹ w 1949 roku, jest wykorzystywany do pomiaru właściwości mechanicznych materiału przy bardzo wysokiej prędkości obciążania. Aparatura składa się z dwóch prętów z próbką umieszczoną w kontakcie między nimi. Fala naprężeń, wytworzona na pręcie dopadającym, rozchodzi się do próbki, gdzie dzieli się na falę odbitą i transmitowaną. Naprężenie w próbce jest proporcjonalne do fali transmitowanej. W niniejszym badaniu wykorzystujemy komorę do naprzężania komórek, która zostaje umieszczona pomiędzy dwoma prętami w układzie Kolsky'ego.
2. Dwa pręty ze stopu aluminium (każdy o długości 6 m) są zawieszone na wyrównanych mosiężnych łożyskach, a pomiędzy nimi umieszczona jest komora do naprzężania komórek in vitro. Prętem dopadającym jest pręt przedni, z masą 130 lb zacisniętą na jednym z końców. Zacisk cierny jest umieszczony w pozycji, która zapewni pożądaną długość impulsu. Poprzez zaangażowanie zacisku i dokręcenie podnośnika nożycowego między masą a podporą obciążeniową, sekcja zacisk-masa pręta dopadającego jest wstępnie ściśnięta do pożądanego poziomu. Wymuszenie nagłego zerwania naciętego śrubowego zamka blokującego zacisk za pomocą systemu hydraulicznego gwałtownie uwalnia zmagazynowaną kompresję, generując w ten sposób impuls ciśnienia. Impuls ten rozchodzi się przez pręt dopadający, napędza tłok komory testowej i impulsowo zwiększa ciśnienie płynu oraz komórek wewnątrz komory. Naprzężanie komory z kolei inicjuje impuls ciśnienia rozchodzący się w pręcie transmitowanym w dół strumienia. Odkształcenia związane z impulsami ciśnienia w prętach są mierzone za pomocą złożonych tensometrów o wysokiej rezystancji wzbudzonych napięciem 45 voltów. Sygnały z tensometrów są rejestrowane cyfrowym oscyloskopem z częstotliwością 1 MHz jako historia obciążania.
3. Komora do naprzężania komórek in vitro składa się z układu tłok-cylinder. Cylinder ma średnicę wewnętrzną 2,6 cm i średnicę zewnętrzną 3,8 cm oraz mały otwór wykonany w podstawie wnęki. Otwór ten służy jako odpowietrznik powietrza i nadmiaru płynu podczas instalacji próbki komórkowej. Tłok ma długość 7,5 cm i jest wykonany z tego samego materiału co pręty. Tłok jest owinięty dwiema lub trzema warstwami taśmy teflonowej, która służy jako uszczelnienie o niskim tarciu. Nakrętka końcowa ma długość 32 mm i posiada dwie małe śruby ze stali nierdzewnej, które zabezpieczają szklane przykrycia (na których hodowane są komórki) podczas obciążania.

3. Impulsowe ciśnienie komórek neuronalnych

1. Wszystkie części komory ciśnieniowej są sterylizowane w autoklawie i przechowywane pod lampą UV. Montaż komory odbywa się wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowych. Śruba odpowietrzająca w komorze jest lekko wkręcona w otwór wentylacyjny u podstawy wnęki. Do komory pipetuje się uprzednio ogrzane (37°C) świeże medium wzrostowe, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie pobiera się szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek i umieszcza je na nakrętce tłoka (komórkami skierowanymi na zewnątrz). Małe śruby mocujące są dokręcane do szkiełka, aby utrzymać je na miejscu. Tłok ze szkiełkiem przedmiotowym z hodowlą komórek jest lekko włożony do wnęki komory, a cały zespół jest przechylony tak, aby otwór wentylacyjny znajdował się w najwyższym punkcie. Śruba odpowietrzająca zostaje wyjęta, a tłok jest wpychany do wnęki, najpierw wypychając pęcherzyki powietrza, a następnie nadmiar cieczy. Jako prowadnica służy znacznik referencyjny lub szablon, aby zapewnić taką samą objętość medium hodowlanego dla każdego testu. Wymiar osiowy medium w komorze wynosi około 6 mm. Należy zdezynfekować śrubę odpowietrzającą i wkręcić ją z powrotem, aby zapewnić szczelność komory. Komora nie powinna przeciekać pod tym obciążeniem statycznym; jeśli przecieka, konieczna jest wymiana lub wzmocnienie owinięcia teflonowego.
2. W tym momencie system prętów Kolsky'ego jest resetowany. Ciężka masa zostaje przesunięta do pozycji wyjściowej, a zużyty (złamaną) sworzeń blokujący zostaje zastąpiony nowym. Nowy sworzeń blokujący zostaje zakleszczony za pomocą układu hydraulicznego pod ciśnieniem około 20 psi. Użyj podnośnika nożycowego, aby ścisnąć sekcję wstępnego obciążenia pręta uderzeniowego do ciśnienia nieco wyższego niż wartość zadana, a następnie poluzuj go, aby w pełni wykorzystać tarcie śruby podnośnika. System akwizycji danych jest teraz uzbrojony.
3. Zmontowana komora ciśnieniowa do komórek jest montowana w systemie. Zostaje ona umieszczona w bloku V wspieranym przez mały laboratoryjny podnośnik nożycowy i wyrównana względem dwóch prętów. Każdy styk należy przesmarować cienką warstwą smaru i przetrzeć powierzchnie styku o siebie, aby wyeliminować wszelkie szczeliny powietrzne pomiędzy nimi.
4. Test jest teraz gotowy do przeprowadzenia. Śruba blokująca zacisk zostaje gwałtownie zerwana poprzez szybkie pompowanie hydraulicznego napędu zacisku. Zacisk rozdzieli się, a system akwizycji danych powinien wyświetlić wyniki. Historia ciśnienia w komorze komórkowej jest wyznaczana z pomiarów z czujnika pręta transmitującego. Jeśli użyty pręt transmitujący jest wystarczająco długi, pomiar ten powinien obejmować okres od pierwszej perturbacji do momentu, w którym pomiary wykażą ciśnienie ujemne. Czas trwania impulsu transmitowanego może być krótszy niż impulsu uderzeniowego w przypadku uwięzienia pęcherzyka powietrza. Amplituda może nie osiągnąć wartości impulsu uderzeniowego, ale powinna posiadać wystarczająco długi plateau przed rozładowaniem. W przeciwnym razie mógł wystąpić albo duży pęcherzyk powietrza w szczelnej komorze, albo rozregulowanie zespołu względem pręta.
5. Następnie komora ciśnieniowa do komórek jest wyjmowana i demontowana wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowych. Śruba odpowietrzająca zostaje wykręcona, a tłok wyciągnięty z komory. Szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek zostaje zdjęte z końca tłoka.

4. Ocena zachowania komórek pod ciśnieniem

1. Po przeprowadzeniu nadciśnienia komórki można poddać natychmiastowej inspekcji lub inkubować dalej w celu późniejszego badania. Przy zastosowaniu odpowiednich procesów aseptyki możliwa jest dłuższa inkubacja po nadciśnieniu.
2. Komórki poddane nadciśnieniu można badać za pomocą wszystkich technik biologii molekularnej i komórkowej. W przypadku nadciśnienia komórek neuronalnych, w celu zbadania fizjologii komórkowej i molekularnej w warunkach TBI, można przeprowadzić testy oceniające zmiany indukowane ciśnieniem w obrastaniu neurytów, zmiany cytoszkieletu mikrotubularnego, ekspresji genów neuronalnych, apoptozie itp. Jako kontrolne próbki komórek wykorzystuje się komórki hodowane w ten sam sposób i przechowywane w komorze nadciśnieniowej przez ten sam czas, ale niepoddane nadciśnieniu (tzw. kontrola komory).
3. W celu oceny zmian w obrastaniu neurytów komórki poddane nadciśnieniu oraz komórki kontrolne z komory bada się pod mikroskopem optycznym natychmiast po nadciśnieniu oraz po 1 i 24 h inkubacji. Przykład obrazów komórek neuronalnych przedstawiono w sekcji „Representative Results” (Rysunek 2). Zmianę długości neurytów można ilościowo określić za pomocą immunofluorescencyjnego barwienia aktyny i analizy obrazu. Komórki utrwala się roztworem paraformaldehydu 4% w/v, płucze buforem myjącym Tween-20 0,05% v/v i permeabilizuje roztworem Triton X-10 0,1% v/v. Po blokowaniu roztworem albuminy surowicy bydlęcej 1% w/v komórki inkubuje się z faloidyną sprzężoną z izotiocyjanianem tetrametylorodaminy (TRITC). Obrazy immunofluorescencyjne komórek wykonuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a długości neurytów dla komórek poddanych nadciśnieniu i kontrolnych quantyfikuje się przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH).
4. Neuryty można zidentyfikować jako aksony lub dendryty. Aby ocenić zmiany morfologiczne w aksonach lub dendrytach, można powtórzyć opisane powyżej eksperymenty, stosując przeciwciała wykrywające każdą z tych struktur, tj. przeciwciało przeciwko neurofilamentom (NF) dla aksonów oraz przeciwciało przeciwko białku stowarzyszonemu z mikrotubulami (MAP2) dla dendrytów.
5. Mikrotubule są jednym z kluczowych składników cytoszkieletu neuronów, a uszkodzenia mikrotubul są wykorzystywane jako marker uszkodzenia neuronalnego.² Mikrotubule można zwizualizować immunofluorescencyjnie za pomocą przeciwciała przeciwko β-tubulinie. Komórki utrwala się po 0 i 24 h od nadciśnienia, barwi przeciwciałem przeciwko β-tubulinie i obserwuje pod mikroskopem fluorescencyjnym.
6. Aby ocenić wpływ impulsywnego nadciśnienia na ekspresję genów neuronalnych i apoptotycznych, z komórek poddanych nadciśnieniu i kontrolnych ekstrahuje się całkowite RNA. Ekspresję genów można zbadać, wykonując ilościowe RT-PCR lub RT-PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z naszymi opublikowanymi protokołami.³

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Przykład profilu ciśnienia przyłożonego do komórek wewnątrz komory ciśnieniowej. Aparatura z prętem Kolsky'ego skutecznie generuje impulsowe ciśnienie typu jednopulsowego na poziomie 2 MPa o czasie trwania około 0,7 ms.

Rycina 2. Przykład odpowiedzi komórek neuronalnych na impulsowe ciśnienie. Komórki SH-SY5Y poddane impulsowemu ciśnieniu o wartości 2 MPa wykazują wyraźną degradację neurytów/aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w komorze.

6. Trudności i rozwiązania

1. Uszczelnienie komory jest jedną z głównych przeszkód, które należy pokonać. Stwierdzono, że szerokie dyski z o-ringami powodują problem żłobienia oraz zwiększone tarcie. Aby wyeliminować efekty tarcia, a także zapobiec żłobieniu, zastosowano prostą metodę owijania tłoka teflonową taśmą hydrauliczną. Rozwiązuje to wymienione problemy i pozwala uzyskać pożądany poziom oraz czas trwania ciśnienia.
2. Zachowanie komórek neuronalnych pod ciśnieniem, zwłaszcza przy ocenie mechanizmów wtórnych TBI lub efektów długoterminowych, należy badać po długim czasie po inkubacji. Komora zawierająca komórki jest narażona na potencjalnie niesterylne warunki podczas przenoszenia do pręta Kolsky’ego, procesu tłoczenia i powrotu do dygestorium do hodowli komórkowych. Dzięki wstępnej sterylizacji części komory oraz prawidłowemu montażowi i demontażowi szkiełka z hodowlą komórkową i komory wewnątrz dygestorium, możliwa jest długoterminowa inkubacja po zabiegu, trwająca nawet kilka tygodni.
3. Powtarzalność danych jest istotnym parametrem w eksperymentach z mechaniczną stymulacją komórkową. W przypadku naszego urządzenia powtarzalność odpowiedzi komórek neuronalnych określa się na podstawie tego, czy pożądany profil impulsowego ciśnienia – zarówno pod względem poziomu, jak i czasu trwania – jest uzyskiwany wielokrotnie. Ponieważ rejestrujemy uzyskany profil ciśnienia dla każdego procesu tłoczenia, dane dotyczące odpowiedzi komórkowej z niepożądanych profili ciśnienia mogą być później ręcznie wykluczone.
4. Cały proces tłoczenia, obejmujący montaż komory, przeniesienie i zamocowanie w pręcie Kolsky’ego, samo tłoczenie, przeniesienie z powrotem oraz demontaż komory, trwa mniej niż 10 min. Kolejne szkiełko z hodowlą komórkową może zostać poddane tłoczeniu natychmiast po poprzednim cyklu. Dzięki temu można efektywnie przeprowadzić wystarczającą liczbę eksperymentów. Nasza konfiguracja wykorzystuje szkiełka przedmiotowe o średnicy 18 mm. Jeden eksperyment nie dostarcza wystarczającej ilości białek do western immunoblottingu ze względu na rozmiar podłoża (a także częściowo dlatego, że niektóre z poddanych ciśnieniu komórek obumierają). Około trzech powtórnych eksperymentów dostarcza ilość białka wymaganą do immunoblottingu. Ponownie, powtarzalność jest każdorazowo sprawdzana na podstawie profilu ciśnienia.

Dyskusja

W celu badania uszkodzeń komórek mózgowych w warunkach TBI (urazowego uszkodzenia mózgu) zastosowano wiele technik eksperymentalnych in vitro. Obejmują one m.in. rozciąganie neuronów/astrocytów, naprężenia ścinające indukowane przepływem, upuszczanie ciężarka, nacięcia rylcem, przecięcia laserowe oraz litotrypsję.^4,5 Przyjęto, że dominującym czynnikiem fizycznym w przypadku TBI jest krótkotrwałe nadciśnienie.^6,7 W szczególności fala uderzeniowa w blast TBI (urazie wywołanym wybuchem) ma czas trwania impulsu rzędu milisekund.⁴ W oparciu o to założenie i obserwacje opracowano komorę barometryczną zdolną do przejściowego zwiększania ciśnienia, która jest wykorzystywana do oceny zachowania komórek mózgu w warunkach TBI. Na przykład w komorze do barotraumy z uderzeniem cieczowym zastosowano impuls ciśnienia o czasie trwania 20-30 ms i ciśnieniu szczytowym do 0,5 MPa, aby zbadać zachowanie ludzkich komórek glejowych w warunkach TBI.⁶ Niedawno VandeVord i wsp.⁷ użyli barometrycznej komory z uderzeniem metalowej kuli do badania zachowania astrocytów w warunkach TBI, jednak uderzenie metalowej kuli generowało wielokrotne impulsy ciśnienia. W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowatorskie urządzenie do kompresji komórek, które generuje impulsowe nadciśnienie typu jednopulsowego. Urządzenie zostało opracowane na podstawie układu pręta Kolsky'ego, który był wykorzystywany jako aparat do badań materiałowych w naszych⁸ oraz innych badaniach.^1,9 Zdolność pręta Kolsky'ego do testowania materiałów przy bardzo wysokiej prędkości obciążania została zmodyfikowana tak, aby umożliwić przyłożenie nadciśnienia typu jednopulsowego do hodowanych komórek wewnątrz komory ciśnieniowej (Rysunek 1). Udało nam się skutecznie kontrolować wartość i czas trwania impulsowego nadciśnienia. Jako reprezentatywną odpowiedź komórkową wykazaliśmy, że przy ciśnieniu 2 MPa komórki neuronalne SH-SY5Y wykazują znaczną utratę neurytów i aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w nieociśnionej komorze.

Podsumowując, opracowaliśmy nowatorską aparaturę do impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach, wykorzystując specjalnie zaprojektowane urządzenie w postaci pręta Kolsky'ego, oraz wykazaliśmy potencjał jego zastosowania w badaniu odpowiedzi komórek neuronalnych w warunkach TBI. Zauważamy również, że technika ta jest bardzo wszechstronna, ponieważ dowolny typ komórek może zostać poddany działaniu ciśnień impulsowych o różnym natężeniu i czasie trwania. W związku z tym urządzenie może być wykorzystywane do badania zachowań mechanotransdukcji komórkowej indukowanej ciśnieniem impulsowym, nie tylko w celu uszkadzania komórek, ale także do ich pozytywnej stymulacji w zakresie funkcji i determinacji losu komórkowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)
szklane laminki o średnicy 18 mm
pożywka do hodowli komórkowej: DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny
kwas retinowy (10 μM) do indukowania neurogenezy
urządzenie do impulsowegoy pressuryzacji z prętem Kolsky'ego
tłokowo-cylindryczna komora do pressuryzacji komórek
śruby ze stali nierdzewnej do mocowania laminki z hodowlą komórek na tłoku
smar do powierzchni styku między komorą komórkową a prętem Kolsky'ego
ogólne odczynniki do biologii molekularnej do oceny odpowiedzi komórek na pressuryzację (utrwalacz, przeciwciała, barwnik fluorescencyjny, odczynniki do PCR itp.)