Metody oceny w EKG wskaźników ryzyka sercowego oraz podatności na arytmie indukowane akonityną u szczurów po statusie epilepticus

Podsumowanie

Opisano techniki pomiaru aktywności elektrycznej serca za pomocą elektrokardiogramu (EKG) oraz analizy czynników ryzyka kardiologicznego i podatności na arytmie po stanie epileptycznym (SE) u szczura.

Streszczenie

Śmiertelne arytmie serca przyczyniają się do śmiertelności w wielu stanach patologicznych. Kilka parametrów uzyskiwanych z nieinwazyjnego, łatwo dostępnego elektrokardiogramu (ECG) stanowi uznanych i dobrze zwalidowanych wskaźników prognostycznych ryzyka kardiologicznego u pacjentów cierpiących na szereg kardiomiopatii. Zwiększona częstość akcji serca, zmniejszona zmienność rytmu serca (HRV) oraz zwiększona czas trwania i zmienność elektrycznej aktywności komór serca (odcinek QT) wskazują na podwyższone ryzyko kardiologiczne ^1-4. W modelach zwierzęcych cenne jest porównywanie tych zmiennych pochodzących z ECG oraz podatności na eksperymentalnie wywołane arytmie. Dożylna infuzja czynnika arytmogennego, akonityny, jest szeroko stosowana do oceny podatności na arytmie w szeregu warunków eksperymentalnych, w tym w modelach zwierzęcych depresji ⁵ i nadciśnienia tętniczego ⁶, po wysiłku fizycznym ⁷ i ekspozycji na zanieczyszczenia powietrza ⁸, a także do określania skuteczności przeciwarytmicznej środków farmakologicznych ^9,10.

Należy zauważyć, że dyspersja QT u ludzi jest miarą zmienności odstępu QT w całym zestawie odprowadzeń w standardowym 12-odprowadzeniowym EKG. W konsekwencji pomiar dyspersji QT z 2-odprowadzeniowego EKG u szczura, opisany w niniejszym protokole, różni się od pomiaru obliczanego z zapisów EKG u ludzi. Stanowi to ograniczenie w translacji danych uzyskanych od gryzoni na potrzeby kliniczne u ludzi.

Status epilepticus (SE) to pojedynczy napad lub seria nieustannie nawracających napadów trwających ponad 30 min ^{11,12 11,12}, który w 20% przypadków kończy się zgonem ¹³. Wiele osób przeżywa SE, ale umiera w ciągu 30 dni ^14,15. Mechanizm (lub mechanizmy) tej opóźnionej śmiertelności nie jest w pełni zrozumiały. Sugerowano, że przyczyną wielu z tych zgonów są śmiertelne arytmie komorowe ^14-17. Oprócz SE, pacjenci doświadczający spontanicznie nawracających napadów, t. j. epilepsji, są narażeni na przedwczesną nagłą i nieoczekiwaną śmierć związaną z epilepsją (SUDEP) ¹⁸. Podobnie jak w przypadku SE, dokładne mechanizmy pośredniczące w SUDEP nie są znane. Zaproponowano, że istotny wkład mają w to nieprawidłowości komorowe i wynikające z nich arytmie ^18-22.

Aby zbadać mechanizmy zgonów kardiologicznych związanych z napadami oraz skuteczność terapii kardioprotekcyjnych, konieczne jest uzyskanie wskaźników ryzyka na podstawie EKG oraz ocena podatności na arytmie serca w modelach zwierzęcych zaburzeń napadowych ^23-25. W niniejszej pracy opisujemy metody implantacji elektrod EKG u szczura laboratoryjnego rasy Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) po wystąpieniu SE, gromadzenia i analizy zapisów EKG oraz indukcji arytmii podczas dożylnej infuzji akonityny.

Niniejsze procedury mogą być wykorzystywane do bezpośredniego określenia zależności między pochodnymi z EKG pomiarami aktywności elektrycznej serca a podatnością na arytmie komorowe w ratowych modelach zaburzeń napadowych lub w przypadku każdej patologii związanej z zwiększonym ryzykiem nagłego zgonu sercowego.

Protokół

1. Materiały do budowy

1. Kaniulę do żyły szyjnej wykonuje się z odcinka (100 mm) rurki polietylenowej PE-50, ściętej pod skosem na jednym końcu, a następnie napełnionej solą fizjologiczną z heparyną (50 U heparyny/mL soli fizjologicznej).
2. Elektrody do zapisu EKG wykonuje się z dwóch 100-milimetrowych odcinków izolowanego srebrnego drutu (30AWG). Jeden koniec obu drutów zostaje odizolowany i przylutowany do mikrołącza, a izolacje zostają skręcone w celu utworzenia trzeciego drutu służącego jako masa. Z dystalnego końca drutów usuwa się 5 mm izolacji.

2. Implantacja cewnika do żyły szyjnej

1. Zanurzyć zwierzę w narkozie poprzez podanie uretanu dootrzewnowo (1,2 g/kg).
2. Regularnie sprawdzać (w odstępach 10 min) głębokość znieczulenia, oceniając odruch wycofania łapy i/lub odruchy rogówkowe. W razie potrzeby uzupełnić dawkę środka znieczulającego.
3. Gdy zwierzę osiągnie odpowiednią głębokość znieczulenia, ogolić prawą stronę szyi od obojczyka do podbródka.
4. Wyonać nacięcie podłużne (10-15 mm) w skórze nad tętnicą szyjną i rozszerzyć nacięcie.
5. Stosując techniki rozczepiania tępego, rozsunąć leżące poniżej mięśnie, aby zlokalizować i wyizolować prawą żyłę szyjną.
6. Umieścić dwa fragmenty jedwabnej nici chirurgicznej (#2) pod żyłą szyjną, pozycjonując szwy w najbardziej rostralnej i kaudalnej części nacięcia. Zawiązać ligaturę rostralną, aby zatrzymać przepływ krwi w żyle.
7. Odciągnąć ligaturę kaudalną, aby unieść naczynie nad tkankę podścielającą i wykonać niewielkie nacięcie. Następnie wprowadzić ścięty koniec wypełnionego heparyną (50 U/ml w soli fizjologicznej) cewnika polietylenowego PE-50 (o długości 100 mm) i przesunąć jego końcówkę na odległość około 8 mm, do poziomu prawego przedsionka.
8. Aby zabezpieczyć cewnik, zawiązać ligaturę kaudalną wokół naczynia i cewnika. Na koniec zamknąć ranę za pomocą klamer chirurgicznych lub szwów.
9. Podczas implantacji cewnika odsłonięty koniec należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi lub zatkać, aby zapobiec cofaniu się krwi przed podłączeniem do pompy infuzyjnej.

3. Implantacja elektrod CG

1. Położyć zwierzę na grzbiecie i ogolić klatkę piersiową.
2. W celu umieszczenia elektrod wykonać dwa nacięcia podłużne (≈ 10 mm), jedno w prawym górnym i jedno w lewym dolnym kwadrancie klatki piersiowej, a następnie odsunąć skórę, aby odsłonić mięśnie klatki piersiowej.
3. Przyszyć jeden z odsłoniętych końców (5 mm) elektrod z drutu srebrnego do mięśni klatki piersiowej w każdym z odsłoniętych obszarów, a elektrodę uziemiającą umieścić podskórnie.
4. Zamknąć nacięcia za pomocą klipsów chirurgicznych i podłączyć mikroznłącze do urządzenia rejestrującego.
5. Luźno owinąć zwierzę ręcznikiem, aby utrzymać temperaturę ciała podczas procedury.

4. Rejestracja EKG

1. Rejestracja jest prowadzona przy użyciu systemu akwizycji danych Powerlab i komputera Macintosh lub podobnego sprzętu i oprogramowania (wzmocnienie 50X; filtracja 1-1000 Hz).
2. Po 20-30 min okresie ekwilibracji należy rejestrować EKG przez 20 min.

5. Indukowanie arytmii komorowych

1. Podłącz cewnik żyły szyjnej do zdalnej strzykawki umieszczonej w programowalnej pompie infuzyjnej.
2. Rozpocznij infuzję akonityny z prędkością zapewniającą stałą dawkę 5 ug/kg/min przez 7 minut.
3. Po wystąpieniu migotania komór lub po zakończeniu okresu infuzji, przeprowadź eutanazję zwierzęcia zgodnie z zatwierdzoną procedurą.

6. Analiza EKG

1. Odstęp QT reprezentuje całkowity czas trwania aktywności elektrycznej komór. Rys. 1 przedstawia modelowy zapis EKG oraz czas trwania odstępu QT. Oblicz średni czas od początku załamka Q do końca załamka T dla wszystkich zarejestrowanych uderzeń serca w ciągu pięciominutowego interwału, wybranego z całkowitego 20 min okresu rejestracji.
2. Aby skorygować odstęp QT pod kątem różnic w częstotliwości akcji serca (QTc), należy zastosować wzór Bazetta: QTc=QT/(RR)^½, gdzie RR jest średnim odstępem między uderzeniami serca. Odstęp RR oblicza się jako czas pomiędzy kolejnymi załamkami Q zarejestrowanymi w analizowanym okresie.
3. Dyspersję QT (QTd) oblicza się poprzez odjęcie minimalnego QT od maksymalnego QT zarejestrowanego dla każdego zwierzęcia.

7. Analiza zmienności rytmu serca

1. Do zautomatyzowanego obliczania wariancji czasowej i/lub spektralnej rytmu serca wykorzystuje się programy komputerowe (np. LabChart 7, ADInstruments, Inc.), które analizują zmienność odstępów RR uzyskanych w okresie analizy.

8. Analiza podatności na arytmie komorowe

1. Oblicz czas utajenia od rozpoczęcia wlewu akonityny do wystąpienia pierwszego przedwczesnego skurczu komór (PVC, Ryc. 2, Panel 1), tachykardii komorowej (VT, Ryc. 2, Panel 2) oraz migotania komór (VF, Ryc. 2, Panel 3).

9. Reprezentatywne wyniki

Rys. 3 przedstawia jeden z pomiarów HRV w domenie spektralnej (pierwiastek kwadratowy średniej z kwadratów różnic między kolejnymi odstępami RR, RMSSD) u szczurów kontrolnych oraz u zwierząt, u których wywołano SE tydzień przed badaniem. Ten parametr HRV, reprezentujący zmiany w przywspółczulnej kontroli funkcji serca ²⁶, jest znacznie obniżony u zwierząt po status epilepticus. Rys. 4 pokazuje, że zarówno skorygowany odstęp QT (QTc, Panel A), jak i dyspersja QT (QTd, Panel B) są istotnie zwiększone dwa tygodnie po SE²⁷. Wspólnie dane te pozwalają przewidzieć, że SE zwiększa ryzyko wystąpienia arytmii komorowych. Przewidywanie to zostało potwierdzone przez wyniki wykazujące, że okresy infuzji akonityny niezbędne do wywołania eksperymentalnych arytmii (PVC, VT, VF) zaobserwowanych w tych badaniach były znacznie krótsze u zwierząt po SE (Rys. 5)²⁷.

Rycina 1. Modelowy zapis EKG prawidłowego cyklu pracy serca z widocznymi załamkami P, QRS i T. Odstęp QT oblicza się jako czas pomiędzy liniami przerywanymi.

Rycina 2. Panel 1) Przedwczesne skurcze komór (PVC) to izolowane skurcze komór (B), które występują pomiędzy normalnymi uderzeniami serca (A). Zapisy PVC charakteryzują się brakiem załamków P i T. Panel 2 Tachykardia komorowa (VT) to seria wielokrotnych skurczów komór (C), które występują bez pomiędzywszczepionych normalnych uderzeń serca (A). Panel 3 Migotanie komór (VF) to brak rozpoznawalnego rytmu oraz brak związku między zespołami QRS a załamkami P (D).

Rycina 3. Pierwiastek z kwadratu średniej różnic sukcesywnych (RMSSD; msec) odstępów między uderzeniami serca obserwowany u szczurów kontrolnych oraz u zwierząt poddanych status epilepticus (SE) na 1 tydzień przed badaniem. **p<0.01 w porównaniu z grupą kontrolną.

Rycina 4. Średni skorygowany odstęp QT (Panel A) oraz dyspersja QT (Panel B) obliczone na podstawie zapisów EKG uzyskanych od zwierząt kontrolnych (Cont) oraz od szczurów, u których dwa tygodnie przed badaniem wywołano status epilepticus (SE). *p<0.05 w porównaniu do grupy Cont. (Metcalf, et al., Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc, użyte za zgodą z ²⁷).

Rycina 5. Latencje (s) pomiędzy rozpoczęciem wlewu akonityny a wystąpieniem pierwszej przedwczesnej pobudki komorowej (PVC), tachykardii komorowej (VT) i migotania komór (VF) u zwierząt kontrolnych (Cont) oraz szczurów, u których dwa tygodnie przed badaniem wywołano status epilepticus (SE). *p<0.05, **p<0.01 w porównaniu z grupą Cont. (Metcalf, et al., Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc, użyte za zgodą z ²⁷).

Dyskusja

Kluczowe znaczenie mają dwa aspekty opisanych procedur. Po pierwsze, tempo podawania akonityny do serca musi być jednakowe u wszystkich zwierząt. Wymaga to spójnego rozmieszczenia końcówek cewników żylnych w stosunku do serca oraz dokładnej regulacji szybkości infuzji. Tempo dostarczania akonityny do serc musi być równomierne, aby można było prawidłowo ocenić czas wystąpienia arytmii komorowych w odniesieniu do zmienionej podatności. Jeśli podawanie akonityny będzie zróżnicowane, czas utajenia do wystąpienia arytmii może...