Metody oceny w EKG wskaźników ryzyka sercowego oraz podatności na arytmie indukowane akonityną u szczurów po statusie epilepticus

Podsumowanie

Opisano techniki pomiaru aktywności elektrycznej serca za pomocą elektrokardiogramu (EKG) oraz analizy czynników ryzyka kardiologicznego i podatności na arytmie po stanie epileptycznym (SE) u szczura.

Streszczenie

Śmiertelne arytmie serca przyczyniają się do śmiertelności w wielu stanach patologicznych. Kilka parametrów uzyskiwanych z nieinwazyjnego, łatwo dostępnego elektrokardiogramu (ECG) stanowi uznanych i dobrze zwalidowanych wskaźników prognostycznych ryzyka kardiologicznego u pacjentów cierpiących na szereg kardiomiopatii. Zwiększona częstość akcji serca, zmniejszona zmienność rytmu serca (HRV) oraz zwiększona czas trwania i zmienność elektrycznej aktywności komór serca (odcinek QT) wskazują na podwyższone ryzyko kardiologiczne ^1-4. W modelach zwierzęcych cenne jest porównywanie tych zmiennych pochodzących z ECG oraz podatności na eksperymentalnie wywołane arytmie. Dożylna infuzja czynnika arytmogennego, akonityny, jest szeroko stosowana do oceny podatności na arytmie w szeregu warunków eksperymentalnych, w tym w modelach zwierzęcych depresji ⁵ i nadciśnienia tętniczego ⁶, po wysiłku fizycznym ⁷ i ekspozycji na zanieczyszczenia powietrza ⁸, a także do określania skuteczności przeciwarytmicznej środków farmakologicznych ^9,10.

Należy zauważyć, że dyspersja QT u ludzi jest miarą zmienności odstępu QT w całym zestawie odprowadzeń w standardowym 12-odprowadzeniowym EKG. W konsekwencji pomiar dyspersji QT z 2-odprowadzeniowego EKG u szczura, opisany w niniejszym protokole, różni się od pomiaru obliczanego z zapisów EKG u ludzi. Stanowi to ograniczenie w translacji danych uzyskanych od gryzoni na potrzeby kliniczne u ludzi.

Status epilepticus (SE) to pojedynczy napad lub seria nieustannie nawracających napadów trwających ponad 30 min ^{11,12 11,12}, który w 20% przypadków kończy się zgonem ¹³. Wiele osób przeżywa SE, ale umiera w ciągu 30 dni ^14,15. Mechanizm (lub mechanizmy) tej opóźnionej śmiertelności nie jest w pełni zrozumiały. Sugerowano, że przyczyną wielu z tych zgonów są śmiertelne arytmie komorowe ^14-17. Oprócz SE, pacjenci doświadczający spontanicznie nawracających napadów, t. j. epilepsji, są narażeni na przedwczesną nagłą i nieoczekiwaną śmierć związaną z epilepsją (SUDEP) ¹⁸. Podobnie jak w przypadku SE, dokładne mechanizmy pośredniczące w SUDEP nie są znane. Zaproponowano, że istotny wkład mają w to nieprawidłowości komorowe i wynikające z nich arytmie ^18-22.

Aby zbadać mechanizmy zgonów kardiologicznych związanych z napadami oraz skuteczność terapii kardioprotekcyjnych, konieczne jest uzyskanie wskaźników ryzyka na podstawie EKG oraz ocena podatności na arytmie serca w modelach zwierzęcych zaburzeń napadowych ^23-25. W niniejszej pracy opisujemy metody implantacji elektrod EKG u szczura laboratoryjnego rasy Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) po wystąpieniu SE, gromadzenia i analizy zapisów EKG oraz indukcji arytmii podczas dożylnej infuzji akonityny.

Niniejsze procedury mogą być wykorzystywane do bezpośredniego określenia zależności między pochodnymi z EKG pomiarami aktywności elektrycznej serca a podatnością na arytmie komorowe w ratowych modelach zaburzeń napadowych lub w przypadku każdej patologii związanej z zwiększonym ryzykiem nagłego zgonu sercowego.

Protokół

1. Materiały do konstrukcji

1. Kaniulę do żyły szyjnej wykonuje się z kawałka (10 mm) rurki polietylenowej PE-50, ściętej pod kątem na jednym końcu, a następnie napełnia ją solą fizjologiczną z heparyną (50 U heparyny/mL soli fizjologicznej).
2. Elektrody do zapisu EKG wykonuje się z dwóch odcinków izolowanego srebrnego drutu (30AWG) o długości 10 mm. Jeden koniec obu drutów należy odizolować i przylutować do mikro złącza, a izolację skręcić, tworząc trzeci przewód służący jako uziemienie. Z dystalnego końca drutów należy usunąć 5 mm izolacji i ją odrzucić.

2. Implantacja cewnika do żyły szyjnej

1. Zanurz zwierzę w narkozie poprzez podanie uretanu drogą ip (1.2 g/kg).
2. Regularnie sprawdzaj (w odstępach 10 min) głębokość anestezji, oceniając odruch wycofania łapy i/lub odruchy rogówkowe. W razie potrzeby uzupełnij dawkę anestetyku.
3. Po osiągnięciu przez zwierzę odpowiedniego poziomu znieczulenia, ogól prawą stronę szyi od obojczyka do brody.
4. Wykonaj nacięcie podłużne (10-15 mm) w skórze nad tętnicą szyjną i rozszerz nacięcie.
5. Stosując techniki rozwarstwiania tępego, rozsuń leżące poniżej mięśnie, aby zlokalizować i wyizolować prawą żyłę szyjną.
6. Umieść dwa kawałki jedwabiu chirurgicznego (#2) pod żyłą szyjną, pozycjonując szwy w najbardziej rostralnej i kaudalnej części nacięcia. Zawiąż ligaturę rostralną, aby zatrzymać przepływ krwi w żyle.
7. Odciągnij ligaturę kaudalną, aby unieść naczynie znad tkanki podłoża i wykonaj małe nacięcie. Następnie wprowadź ścięty koniec wypełnionego heparyną (50 U/ml w soli fizjologicznej) cewnika polietylenowego PE-50 (długość 10 mm) i przesuń jego końcówkę o około 8 mm do poziomu prawego przedsionka.
8. Aby zabezpieczyć cewnik, zawiąż ligaturę kaudalną wokół naczynia i cewnika. Na koniec zamknij ranę za pomocą klipsów chirurgicznych lub szwów.
9. Podczas implantacji cewnika, odsłonięty koniec należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi lub zatkać, aby zapobiec cofaniu się krwi przed podłączeniem do pompy infuzyjnej.

3. Implantacja elektrod CG

1. Ułóż zwierzę na plecach i ogól klatkę piersiową.
2. W celu umieszczenia elektrod wykonaj dwa podłużne nacięcia (≈ 10 mm), jedno w górnej prawej i jedno w dolnej lewej ćwiartce klatki piersiowej, a następnie odsunie skórę, aby odsłonić mięśnie klatki piersiowej.
3. W każdym z odsłoniętych obszarów zaszyj jeden z odsłoniętych 5-mm końców elektrod z drutu srebrnego w mięśniach klatki piersiowej, a elektrodę uziemiającą umieść podskórnie.
4. Zamknij nacięcia za pomocą klipsów chirurgicznych i podłącz mikrołącze do urządzenia rejestrującego.
5. Luźno owiń zwierzę ręcznikiem, aby utrzymać temperaturę ciała podczas procedury.

4. Rejestracja EKG

1. Rejestracje są wykonywane przy użyciu systemu akwizycji danych Powerlab i komputera Macintosh lub podobnego sprzętu i oprogramowania (wzmocnienie: 50X; filtracja: 1-10 Hz).
2. Po 20-30 min okresie równoważenia należy rejestrować EKG przez 20 min.

5. Indukowanie arytmii komorowych

1. Podłącz cewnik żylny do zdalnej strzykawki umieszczonej w programowalnej pompie infuzyjnej.
2. Rozpocznij infuzję akonityny z prędkością zapewniającą stałą dawkę 5 ug/kg/min przez 7 minut.
3. Po wystąpieniu migotania komór lub po zakończeniu okresu infuzji poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z zatwierdzoną procedurą.

6. Analiza EKG

1. Odcinek QT reprezentuje całkowity czas trwania elektrycznej aktywności komór serca. Rys. 1 przedstawia modelowy zapis EKG oraz czas trwania odstępu QT. Oblicz średni czas pomiędzy początkiem załamka Q a końcem załamka T dla wszystkich zarejestrowanych uderzeń serca w pięciominutowym przedziale czasowym uzyskanym podczas 20-minutowego okresu rejestracji.
2. Aby skorygować odstęp QT pod kątem różnic w częstości akcji serca (QTc), należy zastosować wzór Bazetta: QTc=QT/(RR)^½, gdzie RR to średni odstęp między uderzeniami serca. Odstęp RR oblicza się jako czas pomiędzy kolejnymi załamkami Q uzyskanymi w analizowanym okresie.
3. Dyspersję QT (QTd) oblicza się poprzez odjęcie minimalnego QT od maksymalnego QT zarejestrowanego dla każdego zwierzęcia.

7. Analiza zmienności rytmu serca

1. Do zautomatyzowanego obliczania wariancji czasowej i/lub spektralnej częstości akcji serca wykorzystuje się programy komputerowe (np. LabChart 7, ADInstruments, Inc.), które analizują zmienność interwałów RR uzyskanych w okresie analizy.

8. Analiza podatności na arytmie komorowe

1. Oblicz czas utajenia od rozpoczęcia wlewu akonityny do wystąpienia pierwszego przedwczesnego skurczu komór (PVC, Ryc. 2, Panel 1), tachykardii komorowej (VT, Ryc. 2, Panel 2) oraz migotania komór (VF, Ryc. 2, Panel 3).

9. Reprezentatywne wyniki

Ryc. 3 przedstawia jeden z parametrów HRV w dziedzinie widmowej (pierwiastek kwadratowy średniej kwadratowej różnic między kolejnymi odstępami RR, RMSSD) u szczurów kontrolnych oraz u zwierząt, u których wywołano SE na tydzień przed badaniem. Ten parametr HRV, odzwierciedlający zmiany w przywspółczulnej kontroli funkcji serca ²⁶, jest znacząco obniżony u zwierząt po status epilepticus. Ryc. 4 pokazuje, że zarówno skorygowany odstęp QT (QTc, Panel A), jak i dyspersja QT (QTd, Panel B) są znacząco zwiększone dwa tygodnie po SE²⁷. Wraz wzięte dane te pozwalają przewidywać, że SE zwiększa ryzyko arytmii komorowych. Przewidywanie to zostaje potwierdzone przez wyniki wskazujące, że okresy wlewu akonityny niezbędne do wywołania eksperymentalnych arytmii (PVC, VT, VF) zaobserwowanych w tych badaniach były znacząco krótsze u zwierząt po SE (Ryc. 5)²⁷.

Rycina 1.Przykładowy zapis EKG prawidłowego rytmu serca z widocznymi załamkami P, QRS i T. Odcinek QT wyznacza się jako czas pomiędzy liniami przerywanymi.

Rycina 2. Panel 1) Zbyt wczesne skurcze komór (PVC) to izolowane skurcze komór (B), które występują pomiędzy normalnymi uderzeniami serca (A). Zapisy PVC charakteryzują się brakiem załamków P i T. Panel 2 Tachykardia komorowa (VT) to seria wielokrotnych skurczów komór (C), które występują bez przerywających je prawidłowych uderzeń serca (A). Panel 3 Migotanie komór (VF) charakteryzuje się brakiem rozpoznawalnego rytmu oraz brakiem związku pomiędzy zespołami QRS a załamaniami P (D).

Rysunek 3. Pierwiastkowa średnia kwadratowa różnic kolejnych odstępów między uderzeniami serca (RMSSD; ms) obserwowana u szczurów kontrolnych oraz u zwierząt poddanych statusowi epilepticus (SE) tydzień przed badaniem. **p<0,01 w porównaniu do grupy kontrolnej.

Rycina 4. Średni skorygowany odstęp QT (Panel A) oraz dyspersja QT (Panel B) obliczone na podstawie zapisów EKG uzyskanych od zwierząt kontrolnych (Cont) oraz od szczurów, u których dwa tygodnie przed badaniem wywołano status epilepticus (SE). *p<0,05 w porównaniu z grupą kontrolną (Cont.). (Metcalf i wsp., Am. J. Physiol. Heart and Circ, 209, Am Physiol Soc, użyte za zgodą) ²⁷).

Rysunek 5. Opóźnienia (s) pomiędzy rozpoczęciem infuzji akonityny a wystąpieniem pierwszej dodatkowej skurczu komorowego (PVC), tachykardii komorowej (VT) oraz migotania komór (VF) u zwierząt kontrolnych (Cont) oraz szczurów poddanych statusowi epilepticus (SE) na dwa tygodnie przed badaniem. *p<0,05, **p<0,01 w porównaniu z grupą kontrolną (Cont.) (Metcalf i in., Am. J. Physiol. Heart and Circ, 209, Am Physiol Soc, użyto za zgodą) ²⁷).

Dyskusja

Kluczowe znaczenie mają dwa aspekty opisanych procedur. Po pierwsze, tempo podawania akonityny do serca musi być jednakowe u wszystkich zwierząt. Wymaga to spójnego rozmieszczenia końcówek cewników żylnych w stosunku do serca oraz dokładnej regulacji szybkości infuzji. Tempo dostarczania akonityny do serc musi być równomierne, aby można było prawidłowo ocenić czas wystąpienia arytmii komorowych w odniesieniu do zmienionej podatności. Jeśli podawanie akonityny będzie zróżnicowane, czas utajenia do wystąpienia arytmii może...