Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Streszczenie

Receptory hormonalne stawonogów są potencjalnymi celami dla nowych pestycydów, ponieważ regulują one wiele istotnych procesów fizjologicznych i behawioralnych. Większość z nich należy do superrodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Skupiliśmy się na charakterystyce receptorów kinin stawonogów u kleszczy i komarów. Kininy stawonogów to wielofunkcyjne neuropeptydy o działaniu myotropowym, diuretycznym i neurotransmitującym. W niniejszej pracy opisano metodę systematycznych analiz zależności struktura-aktywność kinin owadziech w dwóch heterologicznych systemach ekspresji receptorów kinin. Dostarczamy istotnych informacji przydatnych w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin z potencjałem do zaburzania procesów diuretycznych, myotropowych i/lub trawiennych u kleszczy i komarów.

Receptory kinin z kleszcza bydła, Boophilus microplus (Canestrini), oraz komara Aedes aegypti (Linnaeus), zostały stabilnie wyekspresjonowane w ssaczej linii komórkowej CHO-K1. Analizy funkcjonalne tych receptorów przeprowadzono przy użyciu płytkowego testu bioluminescencji wapnia, który mierzy wewnątrzkomórkową bioluminescencję w celu określenia poziomu wapnia cytoplazmatycznego po zastosowaniu peptydów do tych komórek rekombinowanych. Metoda ta wykorzystuje białko ekworynę, fotobiałko wyizolowane z bioluminescencyjnych meduz. Przejściowo przetransfekowaliśmy plazmid ekworyny (mtAEQ/pcDNA1) w liniach komórkowych stabilnie eksponujących receptory kinin. Następnie komórki te poddano działaniu kofaktora koelenterazyny, która tworzy kompleks z wewnątrzkomórkową ekworyną. Wiązanie to rozpada się w obecności wapnia, emitując poziomy luminescencji wskazujące na stężenie wapnia. Ponieważ receptor kinin sygnalizuje poprzez uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia, intensywność sygnału jest powiązana z aktywnością peptydu.

Niniejszy protokół stanowi syntezę kilku wcześniej opisanych procedur z wprowadzonymi modyfikacjami; przedstawia on instrukcje krok po kroku dotyczące stabilnej ekspresji GPCR w linii komórkowej ssaków poprzez funkcjonalne testy płytkowe (Staubly et al., 2002 oraz Stables et al., 1997). Wykorzystując tę metodologię, udało nam się ustanowić stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję receptorów kinin komarów i kleszczy, porównać aktywność trzech kinin komara, zidentyfikować krytyczne pozycje aminokwasowe dla oddziaływania ligand-receptor oraz przeprowadzić półautomatyczny screening biblioteki peptydów. Ponieważ kininy owadzie są podatne na szybką degradację enzymatyczną przez endogenne peptydazy, ich zastosowanie w narzędziach do zwalczania szkodników lub w badaniach endokrynologicznych jest znacznie ograniczone. W związku z tym przetestowaliśmy również analogi kinin zawierające kwas aminizobutyrowy (Aib) w celu zwiększenia ich aktywności i biostabilności. Ten analog odporny na działanie peptydaz stanowi istotny punkt wyjścia w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin owadziego i może pomóc w rozwoju strategii kontroli stawonogów opartych na neuropeptydach.

Protokół

1. Uzyskiwanie stabilnych linii komórkowych

1. Sekwencję kodującą wybrany receptor sprzężony z białkami G (GPCR) sklonuj i wsuń do wektora ekspresyjnego zawierającego 5' sekwencję zgodną z motywem Kozaka (GCCA/GCCATGG) wokół kodonu inicjującego, zapewniając optymalne wiązanie rybosomu w systemie ssaczym (Kozak, 1986). W niniejszym protokole wykorzystujemy plazmid pcDNA3.1/Bm-KR do ekspresji receptora kininy kleszcza oraz plazmid pcDNA3.1/Aedae-KR do ekspresji receptora kininy komara (Holmes i in.., 2003; Pietrantonio i in.., 2005). Wektor pcDNA3.1(-) koduje oporność na ampicylinę, służącą do selekcji w bakteriach, oraz oporność na neomycynę (G418), stosowaną do selekcji w komórkach ssaczych.
2. Hoduj komórki CHO-K1 puste (bez plazmidów) (ATCC, Manassas, VA, USA) lub inną pożądaną linię komórkową w kolbie T-25 (BD Falcon) w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO₂₂ wilkownia z wilgotnioną atmosferą (Holmes i in.., 2003). Wszystkie kolejne inkubacje należy przeprowadzać w tych warunkach, chyba że określono inaczej. Utrzymuj puste dołki w pożywce wzrostowej (pożywka F12K z 10% cielęcą surowicą płodową) z 1X antybiotykiem-przeciwgrzybiczym (Antibiotic-Antimycotic, Invitrogen, CA).
3. Aby przesiać komórki, ogrzej wszystkie roztwory do 37 °C. Usuń stary ośrodek z fiolki T-25 i przepłucz 5 ml PBS, a następnie usuń PBS. Aby zatripsynować komórki, dodaj 2 ml roztworu PBS-trypsyna-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% wodorowęglanu sodu, 4 ml 10-krotnego roztworu trypsyna-EDTA) na 2 min. Dodaj 3 ml ośrodka i aspiruj ośrodek w górę i w dół, aby wymieszać komórki. Przenieś ośrodek z komórkami do rurki stożkowej i wirować przez 2 min przy około 200–300 g (1000 obr./min). Odrzuć supernatant i zawieś ponownie komórki w 5 ml ośrodka. Rozcieńcz zawiesinę komórek w stosunku 1:5 lub 1:10 świeżym ośrodkiem i przenieś po 5 ml do nowych fiolki T-25.
4. Gdy komórki rosną w dobrym stanie (około 2–3 dni), posiej komórki CHO-K1 do butelek hodowlanych T-25 i hoduj je przez noc w pożywce wzrostowej bez antybiotyków, aż osiągną około 30% stopnia zacieśnienia (prawdopodobnie po ok. 18 godzinach). Stopień zacieśnienia można określić, obserwując komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym odwróconym.
5. Przygotuj następujące mieszaniny dla każdej próbki:
   1. Połącz 1–2 μg DNA (przykład: użyj 4 μl roztworu o stężeniu 265 μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) z 100 μl pożywki Opti-MEM I o obniżonej zawartości surowicy (Invitrogen).
   2. Wymieszaj 6 μl odczynnika Lipofectin (InvitrogenTM) z 100 μl pożywki F12K pozbawionej surowicy, uzyskując stosunek objętościowy Lipofectin do DNA równy 1:1. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30–45 minut.
   Delikatnie zmieszaj roztwory z punktu 1.5.1 i 1.5.2 w sposób kroplowy (objętość całkowita = 200 μL). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 10–15 minut.
6. Usunąć stary ośrodek wzrostu z komórek i przemyć komórki 5 ml pożywki F12K pozbawionej surowicy, a następnie usunąć pożywkę F12K pozbawioną surowicy. W probówce o pojemności 15 ml ostrożnie zmieszać mieszaninę transfekcyjną z 1,8 ml świeżej pożywki F12K w sposób kroplowy. Następnie przemyć komórki z kroku 1.5 roztworem PBS i dodać do komórek nowy roztwór transfekcyjny. Inkubować przez 18 godzin.
7. Zamień pożywkę na pożywkę F12K z dodatkiem 10% cielęcego surowicy płodowej bez antybiotyków i inkubuj przez noc. Rozdziel komórki do dwóch butelek T-25 z pożywką F12K z dodatkiem 10% cielęcego surowicy płodowej bez antybiotyków na kolejne 18 godzin (aby rozdzielić komórki, zobacz krok 1.3).
8. Zamień pożywkę na pożywkę selekcyjną (pożywka F12K z dodatkiem 10% cielęcego surowicy płodowej i 800 μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Hoduj komórki w pożywce selekcyjnej przez 3–4 tygodnie. W tym czasie dojdzie do wyselekcjonowania komórek, które stabilnie wbudowały plazmid w swój genom. Dalszą hodowlę prowadź w pożywce utrzymującej (pożywka F12K z dodatkiem 10% cielęcego surowicy płodowej i 400 μg/ml GENETICIN). Co pewien czas zamrażaj linie komórkowe w stosunku 1:1 pożywki mrożącej (pożywka selekcyjna z 20% DMSO), aby zapobiec utracie materiału w przypadku nieoczekiwanej kontaminacji.
9. Selekcja klonalnych linii komórkowych: jako pierwszy krok, przetraw trypsyną i odwirowuj komórki z etapu 1.8 w pożywce utrzymaniowej, zgodnie z etapem 1.3. Suspenduj ponownie komórki w 5 ml pożywki utrzymaniowej, pobierz 0,5 ml zawiesiny komórkowej i dodaj 4,5 ml świeżej pożywki utrzymaniowej, aby uzyskać rozcieńczenie 10-krotne. Przenieś rozcieńczenie 10-krotne do 12 dołków płytki 96-dołkowej, dodając po 100 μl do każdego dołka w celu selekcji pojedynczych komórek.
10. Kontynuuj wykonywanie 10-krotnych rozcieńczeń szeregowych tych komórek, aby uzyskać teoretyczne końcowe zawieszenie jednej komórki na 100 μl (zwykle końcowe rozcieńczenie będzie się mieścić w zakresie 10^-11 do 10^-19; całkowita liczba sekwencyjnych rozcieńczeń 10-krotnych wynosi ^˜19). Bezpośrednio po każdej rozcieńczeniu przenieś 100 μl rozcieńczenia do 12 dołków płytki 96-dołkowej. Po 18 godzinach inkubacji obserwuj płytki 96-dołkowe pod odwróconym mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym i oznacz dołki, które wydają się zawierać tylko jedną pojedynczą komórkę lub dwie komórki wyraźnie wynikłe z podziału jednej komórki. Kontynuuj obserwację każdego dnia i wymieniaj ośrodek co trzy dni.
11. Gdy dołki osiągną 80% stopnia zacieśnienia (około tydzień), przepłukać oznaczone dołki 200 μl roztworem PBS i poddać je trypsynizacji za pomocą 100 μl roztworu PBS-trypsyna-EDTA. Przenieść komórki z każdego oznaczonego dołka do jednego dołka płytki 6-dołkowej zawierającego 1 ml pożywki utrzymawczej. Hodować komórki przez 3 dni, a następnie przenieść je do indywidualnych fiolków typu T25. Przeprowadzić badanie tych komórek przy użyciu testu wapniowej bioluminescencji z peptydami agonistycznymi (patrz sekcja 2).
12. Wybierz 1 linię komórkową z kroku 1.11 wykazującą najwyższą odpowiedź w teście płytkowym bioluminescencji wapniowej i powtórz ponownie selekcję pojedynczych komórek zgodnie z krokami 1.9–1.11. Okresowo zamrażaj linie komórkowe.
13. Z drugiego doboru opisanego w kroku 1.12 wybierz 2–3 linie komórkowe wykazujące najwyższą odpowiedź w teście płytkowym bioluminescencji wapniowej i utrzymuj je w hodowli do dalszych testów płytkowych bioluminescencji wapniowej. Śledź numery pasażowania. Od czasu do czasu zamrażaj linie komórkowe z wczesnych pasaży, aby móc do nich powrócić, jeśli linie o większej liczbie pasażów przestaną dawać spójne wyniki.

2. Test bioluminescencyjny z zastosowaniem płytek wapniowych

1. Włącz gen raportera do wektora ekspresyjnego. W niniejszym przypadku wykorzystano plazmid aequoryny mtAEQ/pcDNA1 (dar dr. C. J. P. Grimmelikhuijzena i Michaela Williamsona, Uniwersytet w Kopenhadze, Dania). Transformuj plazmid w E. coli komórki MC1061/PS (Invitrogen) i wyizoluj je za pomocą zestawu QIAprep spin miniprep kit (Qiagen Inc.). W ostatnim kroku eluuj plazmid buforem Tris bez EDTA, a nie wodą.
2. Namnóż linie komórkowe z kroku 1.13 eksprymujące pożądany receptor w pożywce utrzymaniowej. Gdy komórki osiągną 90% stopień zacieśnienia, odetnij je trypsyną, odwirowuj i ponownie zawieś w 5 ml pożywki utrzymaniowej, jak w kroku 1.3. Rozcieńcz komórki (około 10-krotnie pożywką utrzymaniową) i policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek (Bright-Line Hemacytometer) pod mikroskopem. Dostosuj liczbę komórek do około 2 x 10⁵ komórek/ml (średnio 20 komórek w jednym z 9 pól pokazanych na komorze do zliczania krwinek). Zasiej 2 ml rozcieńczonych komórek w pożywce do każdej studzyszki płytki sześciostudzienkowej. Inkubuj przez 24 godziny (po inkubacji komórki powinny osiągnąć około 60% stopnia zacieśnienia).
3. Wymień podłoże w 6-dołkowej płytce na podłoże OPTI-MEM. Do każdego dołka dodaj 96 μl OPTI-MEM i 4 μl odczynnika do transfekcji FuGENE 6 (Roche Biochemicals) w probówce mikrocentryfugowej i inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki dodaj 1 μg plazmidu aequorin/pcDNA1, następnie delikatnie wymieszaj przez 1 minutę i inkubuj przez 15–20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszaninę kroplami do każdego dołka, delikatnie wstrząsając płytką. Inkubuj płytki przez 6 godzin, a następnie wymień podłoże na podłoże F12K zawierające 10% cielęce surowice płodowe bez antybiotyku.
4. Po inkubacji komórek w 6-dołkowej płytce przez 24 godziny, odtrawić komórki trypsyną, odwirować i ponownie zawiesić zgodnie z krokiem 1.3. Określić liczbę komórek w konsystencji 400 000 komórek/ml zgodnie z krokiem 2.1 i przenieść po 100 μl (łącznie 40 000 komórek/100 μl) do każdego dołka 96-dołkowej białej mikropłytki o cienkim dnie (Costar 3610). Inkubować przez kolejne 24 godziny, aż do osiągnięcia około 80% stopnia zacieśnienia komórek. Jest to optymalne stężenie komórek do testu luminescencyjnego.
5. Przygotuj po 90 μl na dołek pozbawionego wapnia pożywki DMEM (Invitrogen) zawierającej 5 μM koelenterazyny (Invitrogen) w warunkach ciemności (koelenterazyna jest wrażliwa na światło). Weź tackę z punktu 2.4, usuń stary roztwór i dodaj po 90 μl tego roztworu do każdego dołka. Inkubuj tace przez 3 godziny w ciemności w temperaturze 37°C i 5% CO₂.₂, po czym komórki w płytce są gotowe do przeprowadzenia testu.

3. Obsługa instrumentu i analiza danych

1. Każdy czytnik płytek do luminescencji biologicznej jest inny. Nasz test przeprowadzamy za pomocą czytnika płytek NOVOstar (BMG Labtechnologies) w trybie luminescencji biologicznej. Jeśli korzystasz z innego urządzenia, protokół należy dostosować.
2. Opróżnij pompy czytnika płyt (lub WYPRIMUJ POMPY) przed użyciem. Wyłącz światło w pomieszczeniu przed umieszczeniem płytki w uchwycie. Po zamknięciu uchwytu płytki włącz światło.
3. Rozpuść peptydy (w rurce Eppendorf o pojemności 1,5 ml) w pożywce DMEM pozbawionej wapnia. Przed użyciem ustaw „Głębokość aspiracji” i „Wyznaczenie pozycji” roztworu peptydów. Podawaj komórkom 10 μl (10x) roztworu peptydów o różnych stężeniach (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3 lub innego pożądanego peptydu) i natychmiast rozpocznij rejestrowanie emisji światła. Ustawiliśmy przyrząd do rejestrowania emisji światła (465 nm) z każdego dołka co 2 sekundy przez łączny czas trwania 50 sekund.
4. Upewnij się, aby dołączyć kontrolę pozytywną, taką jak aktywny analog (używano analogu FFFSWGa, Taneja-Bageshwar i in.., 2009) oraz kontrolę ujemną, taką jak komórki transfekowane tylko wektorem. Kontrola ujemna będzie potrzebna podczas analizy danych do ustalenia progu podstawowego (zobacz reprezentatywne wyniki). Jako kontrolę ujemną można również dodać niespokrewniony, nieaktywny peptyd.
5. Po zakończeniu przebiegu przepłucz pompę aparatu (lub PRIME PUMPS), a następnie załaduj kolejny próbkę peptydu. Zapisz dane i ponownie przepłucz pompy.
6. Przetwarzanie danych: Przenieś dane dotyczące emisji światła z każdej studzioszki do arkusza danych programu Microsoft Excel.
7. Wklej dane z Excela do oprogramowania Prism 4.0 firmy GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Różne stężenia peptydów umieszczono na osi X, a jednostki luminescencji biologicznej na osi Y. Aby znormalizować dane, sporządź krzywą logarytmiczną odpowiedzi. Wybierz analizę dopasowania nieliniowej krzywej regresji (równanie sigmoidalnej odpowiedzi dawka-efekt ze zmiennym nachyleniem), aby uzyskać krzywe stężenie-odpowiedź dla każdego peptydu. Program na końcu wykreśla wartości i podaje wartość EC₅₀.
8. Każdy eksperyment należy powtórzyć trzykrotnie w celu analizy danych.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po ekspresji w komórkach CHO-K1 receptor kininy komara Aedes aegypti zachowywał się jako receptor wieloligandowy i funkcjonalnie odpowiadał na stężenia rzędu 1 nM trzech badanych oddzielnie endogennych kinin Aedes, Aedae kinin 1–3, w teście luminescencyjnym płytkowym z wykorzystaniem wapnia. Rycina 1 pokazuje, że kolejność siły działania była następująca: Aedae-K-3 > Aedae-K-2 > Aedae-K-1, w oparciu o odpowiedni wykładnik EC₅₀ wartości Aedae-K-3, 16,04 nM; Aedae-K-2, 26,6 nM oraz Aedae-K-1, 48,85 nM, które różniły się istotnie statystycznie (P < 0,05) (Pietrantonio i in.., 2005).

Wykorzystaliśmy również ten test do określenia, które reszty kinin są kluczowe dla oddziaływania peptydu kininowego z receptorem. Peptydy kininowe owadów współdzielą pentapeptyd C-końcowy, który reprezentuje minimalną sekwencję niezbędną do aktywności biologicznej, znaną również jako rdzeń. W Tabeli 1 przedstawiono analogi rdzenia peptydu kininowego, syntetyzowane jako seria zastąpień alaniną rdzeniowego pentapeptydu kininowego FFSWGa, i przetestowano je za pomocą testu talerzowego opartego na bioluminescencji wapniowej (Taneja-Bageshwar i in.., 2006). Stwierdziliśmy, że aminokwasy Phe¹ i Trp⁴ były niezbędne dla aktywności kinin owadów w przypadku obu receptorów.

Test może również służyć do badania peptydów zaprojektowanych pod kątem zwiększonej biostabilności. Tabela 2 przedstawia zaprojektowane analogi kinin zawierające kwas aminoisomasłowy (Aib) przetestowane na rekombinowanym recepcie kininowym kleszczy, a rycina 2 ilustruje porównanie aktywności sześciu analogów kwasu alfa-aminomasłowego na linii komórkowej CHO-K1 eksprymującej receptor kininowy kleszczy, wykonywane za pomocą testu płytkowego opartego na bioluminescencji wapniowej (Taneja-Bageshwar i inni., 2009). Analog heksapeptydowy FFFSWGa dodaje się jako pozytywną kontrolę aktywności receptora. Analog FF[Aib]WGa okazał się bardziej aktywny niż ten kontrolny analog heksapeptydowy. Analog zawierający dwie zamiany kwasu aminoisobutyrkowego, [Aib]FF[Aib]WGa, był najbardziej aktywnym spośród przetestowanych analogów podwójnej zamiany (Tabela 2 i Rycina 2).

Aby zapoznać się z większą liczbą przykładów zastosowania tego testu, zarówno dotychczasowych, jak i potencjalnych, zobacz Nachman i Pietantonio (2010), Nachman i in.. (2009), Taneja-Bageshwar i in.. (2008a) oraz Taneja-Bageshwar i inni. (2008b).

Rycina 1. Szacowanie Aedes stężenie skuteczne kinin (EC₅₀na komórkach CHO-K1 E10 przy użyciu testu płytkowego opartego na bioluminescencji wapniowej Oś y krzywych stężenie-odpowiedź uzyskano na podstawie jednostek luminescencji biologicznej wyrażonych jako procent maksymalnej odpowiedzi zaobserwowanej dla każdego peptydu. Punkty danych reprezentują średnią z sześciu powtórzeń uzyskanych w trakcie trzech niezależnych eksperymentów. Słupki reprezentują błąd standardowy. (A) Szacowanie EC50 dla Aedae-K1₅₀ = 48 nM. (B) Szacowanie EC50 dla Aedae-K2₅₀ = 26 nM. (C) Szacowanie EC50 dla Aedae-K3₅₀ = 16 nM. EC₅₀ Aedae-K3 < EC₅₀ Aedae-K2 < EC₅₀ Aedae-K1; P < 0,05. Analizę statystyczną i wykresy wykonano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 4.0.

Rycina 2. Porównanie aktywności sześciu analogów alfa-aminokwasu izomasłowego na linię komórkową CHO-K1 eksprymującą receptor kininowy kleszczy za pomocą testu płytkowego opartego na luminescencji wapniowej. Oś y przedstawia procent maksymalnych jednostek luminescencji dla każdego analogu, wyrażony jako procent luminescencji zaobserwowanej w danej stężeniu w porównaniu z maksymalną odpowiedzią zaobserwowaną we wszystkich przetestowanych stężeniach dla każdego analogu. Analizę statystyczną i sporządzanie wykresów wykonano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 4.0.

	Linia komórkowa receptorów kleszczy		Linia komórkowa receptorów komarów
Peptydy	EC50 (nM)	Maksymalna odpowiedź bioluminescencyjna przy stężeniu 1 mM	EC50 (nM)	Maksymalna odpowiedź luminescencji przy stężeniu 1 mM
AFSWGa	I	I	I	I
FASWGa	586	5,600	N.D.	400
FFAWGa	64	12,800	621	3,050
FFSAGa	I	I	I	I
FFSWAa	417	10,600	2,800	1,830
FFSWGa	590	10,800	N.D.	525
FSWGa	I	I	I	I
FFSWa	I	I	I	I
FFSWG-OH	I	I	I	I
FFFSWGa	259	13,000	562	10,000
FF[Aib]WGa	29	12,700	445	9,300

Tabela 1. Szacowane potencje (EC₅₀) oraz maksymalna odpowiedź bioluminescencyjna wszystkich badanych peptydów na liniach komórkowych z transfekowanymi receptorami kleszczy i komarów*

*EC₅₀ szacuje stężenie potrzebne do wywołania odpowiedzi półmaksymalnej. I: Nieaktywny, jeśli odpowiedź bioluminescencji jest mniejsza niż 300 jednostek (poziom komórek transfekowanych wektorem pustym). A: Pozycja, w której odpowiedni resztę w peptydzie FFSWGa zastąpiono alaniną. N.D.: Analoga przetestowano, ale była albo mało aktywna, albo nieaktywna w niższych stężeniach molowych, w związku z czym nie można było określić wartości EC50.

K-Aib-1	[Aib]FF[Aib]WGa
K-Aib-2	[α MeF]FF[Aib]WGa
K-Aib-3	Ac-R[Aib]FF[Aib]WGa
K-Aib-4	Ac-R[β3F]FF[Aib]WGa
K-Aib-5	[Aib]RFF[Aib]WGa
K-Aib-6	[Aib-Aib-Aib-Aib]RFF[Aib]WGa

Tabela 2. Analogi kinin (K) zawierające kwas aminoisomasłowy (Aib) przetestowane na rekombinowanym recepcie kininowym kleszczy. Ac: acetylo; α Me: α-metylofenyloalanina; β3F: β3-fenyloalanina; a: amid.

Dyskusja

Dzięki zastosowaniu niniejszego protokołu udało nam się przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną pierwszego receptora neuropeptydowego odkrytego u Arachnida (kleszcze, roztocza i pająki) – receptora kininowego kleszcza. Metoda ta ma trzy główne zastosowania. Po pierwsze, technikę tę można wykorzystać do deoatfania receptorów poprzez pomiary aktywności ligandów. Po drugie, test ten pozwala na określenie zależności między strukturą a aktywnością (SAR) ligandu i receptora. Po trzecie, metody te mogą być wykorzystane w procesie poszukiwania nowych leków. Co więcej, protokół ten może służyć do badania aktywności agonistów lub antagonistów niemal każdego GPCR. Rozpoczynamy proces adaptacji tego protokołu do skriningu małych bibliotek związków. Wykorzystana przez nas linia komórkowa nie wykazuje ekspresji powszechnego białka G, G₁₆. Nie było ono wymagane, ponieważ receptory kininowe stawonogów sygnalizują poprzez białko Gq i wewnątrzkomórkową kaskadę wapniową, a właściwości sygnalizacyjne te zostają zachowane w komórkach ssaków, co wykazano w niniejszej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
komórki CHO-K1	ATCC	CCL-61	Manassas, VA, USA
pożywka F12K	Invitrogen	21127
płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F0643
Trypsyna-EDTA (10x)	Invitrogen	15400
antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy	Invitrogen	15240
pożywka z obniżoną zawartością surowicy Opti-MEM I	Invitrogen	31985
odczynnik Lipofectin	Invitrogen	18292-011
GENETICIN	Invitrogen	10131035
MC1061/P3 Ultracomp	Invitrogen	C663-03
zestaw QIAprep spin miniprep	Qiagen	19064
odczynnik do transfekcji FuGENE 6	Roche Group	11 814 443 001
biała mikropłytka 96-dołkowa z cienkim dnem	Costar	3610
pożywka DMEM bez wapnia	Invitrogen	21068
C–lenterazyna	Invitrogen	C-2944
Hemocytometr Bright-Line	Hausser Scientific		Horsham, PA
NOVOstar	BMG Labtechnologies
oprogramowanie Prism 4.0	GraphPad Software Inc.		San Diego, CA, USA
kolby T-25 i T-75	BD Biosciences	353014 i 353135