Artykuł metodologiczny

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2732

⸱

20 kwietnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University (TAMU), 2Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University (TAMU)

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Streszczenie

Receptory hormonalne stawonogów są potencjalnymi celami dla nowych pestycydów, ponieważ regulują one wiele istotnych procesów fizjologicznych i behawioralnych. Większość z nich należy do superrodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Skupiliśmy się na charakterystyce receptorów kinin stawonogów u kleszczy i komarów. Kininy stawonogów to wielofunkcyjne neuropeptydy o działaniu myotropowym, diuretycznym i neurotransmitującym. W niniejszej pracy opisano metodę systematycznych analiz zależności struktura-aktywność kinin owadziech w dwóch heterologicznych systemach ekspresji receptorów kinin. Dostarczamy istotnych informacji przydatnych w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin z potencjałem do zaburzania procesów diuretycznych, myotropowych i/lub trawiennych u kleszczy i komarów.

Receptory kinin z kleszcza bydła, Boophilus microplus (Canestrini), oraz komara Aedes aegypti (Linnaeus), zostały stabilnie wyekspresjonowane w ssaczej linii komórkowej CHO-K1. Analizy funkcjonalne tych receptorów przeprowadzono przy użyciu płytkowego testu bioluminescencji wapnia, który mierzy wewnątrzkomórkową bioluminescencję w celu określenia poziomu wapnia cytoplazmatycznego po zastosowaniu peptydów do tych komórek rekombinowanych. Metoda ta wykorzystuje białko ekworynę, fotobiałko wyizolowane z bioluminescencyjnych meduz. Przejściowo przetransfekowaliśmy plazmid ekworyny (mtAEQ/pcDNA1) w liniach komórkowych stabilnie eksponujących receptory kinin. Następnie komórki te poddano działaniu kofaktora koelenterazyny, która tworzy kompleks z wewnątrzkomórkową ekworyną. Wiązanie to rozpada się w obecności wapnia, emitując poziomy luminescencji wskazujące na stężenie wapnia. Ponieważ receptor kinin sygnalizuje poprzez uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia, intensywność sygnału jest powiązana z aktywnością peptydu.

Niniejszy protokół stanowi syntezę kilku wcześniej opisanych procedur z wprowadzonymi modyfikacjami; przedstawia on instrukcje krok po kroku dotyczące stabilnej ekspresji GPCR w linii komórkowej ssaków poprzez funkcjonalne testy płytkowe (Staubly et al., 2002 oraz Stables et al., 1997). Wykorzystując tę metodologię, udało nam się ustanowić stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję receptorów kinin komarów i kleszczy, porównać aktywność trzech kinin komara, zidentyfikować krytyczne pozycje aminokwasowe dla oddziaływania ligand-receptor oraz przeprowadzić półautomatyczny screening biblioteki peptydów. Ponieważ kininy owadzie są podatne na szybką degradację enzymatyczną przez endogenne peptydazy, ich zastosowanie w narzędziach do zwalczania szkodników lub w badaniach endokrynologicznych jest znacznie ograniczone. W związku z tym przetestowaliśmy również analogi kinin zawierające kwas aminizobutyrowy (Aib) w celu zwiększenia ich aktywności i biostabilności. Ten analog odporny na działanie peptydaz stanowi istotny punkt wyjścia w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin owadziego i może pomóc w rozwoju strategii kontroli stawonogów opartych na neuropeptydach.

Protokół

1. Ustanowienie stabilnych linii komórkowych

  1. Sklonuj interesujący Cię GPCR i wstaw go do wektora ekspresji zawierającego 5' sekwencję konsensusu Kozaka (GCCA/GCCATGG) wokół kodonu start w celu optymalnego wiązania rybosomalnego w systemie ssaków (Kozak, 1986). Tutaj używamy plazmidu pcDNA3.1 / Bm-KR dla receptora kininy kleszcza i plazmidu pcDNA3.1 / Aedae-KR dla receptora kininy komara (Holmes i wsp., 2003; Pietrantonio i wsp., 2005). Wektor pcDNA3.1(-) koduje oporność na ampicylinę do selekcji u bakterii i oporność na neomycynę (G418) na selekcję w komórkach ssaków.
  2. Hoduj puste komórki CHO-K1 (bez plazmidów) (ATCC, Manassas, VA, USA) lub inną pożądaną linię komórkową w kolbie T-25 (BD Falcon) w temperaturze 37°C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 (Holmes i wsp., 2003). Wszystkie dalsze inkubacje powinny być przeprowadzane w tych warunkach, chyba że określono inaczej. Utrzymuj puste komórki w pożywce wzrostowej (pożywka F12K z 10% płodową surowicą bydlęcą) za pomocą 1X Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (Invitrogen, CA).
  3. Aby podzielić komórki, podgrzej wszystkie roztwory do temperatury 37 °C. Usunąć starą pożywkę z kolby T-25 i przepłukać 5 ml PBS, a następnie usunąć PBS. Aby trypsynizować komórki, dodaj 2 ml PBS-Trypsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% wodorowęglanu sodu, 4 ml 10X trypsyna-EDTA) przez 2 min. Dodaj 3 ml pożywki i odsysaj pożywkę w górę iw dół, aby wymieszać komórki. Przenieść pożywkę z komórkami do stożkowej probówki i wirować przez 2 minuty przy 200-300 g (1 000 obr./min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o pojemności 5 ml. Rozcieńczyć zawieszone komórki do stężenia 1:5 lub 1:10 świeżą pożywką i przenieść 5 ml do nowej kolby T-25.
  4. Po zdrowym wzroście komórek (około 2-3 dni), wysiewaj komórki CHO-K1 do kolb kultur tkankowych T-25 i hoduj je przez noc w pożywce wzrostowej bez antybiotyków, aż osiągną około 30% zlewu (około 18 godzin). Stopień konfluencji można określić, obserwując komórki pod odwróconą mikroskopią fluorescencyjną.
  5. Dla każdej próbki należy przygotować następujące mieszaniny:
    1. Połącz 1-2 μg DNA (przykład: użyj 4 μl 265 μg / μl pcDNA3.1 / Aedae-KR) ze 100 μl zredukowanego podłoża surowicy Opti-MEM I (Invitrogen).
    2. Wymieszaj 6 μl odczynnika Lipofektyny (InvitrogenTM) ze 100 μl F12K wolnej pożywki surowicy, uzyskując stosunek lipofektyny do DNA 1:1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut.
    Delikatnie wymieszać roztwory z 1.5.1 z 1.5.2 kroplami (całkowita objętość = 200 μl). Odstawić w temperaturze pokojowej na 10-15 minut.
  6. Usuń starą pożywkę wzrostową z komórek i przemyj komórki 5 ml pożywki wolnej od surowicy F12K, a następnie usuń pożywkę wolną od surowicy F12K. W probówce o pojemności 15 ml delikatnie wymieszaj mieszaninę transfekcji z 1,8 ml świeżej pożywki F12K w sposób kroplowy. Następnie umyj komórki z kroku 1.5 PBS i dodaj ten nowy roztwór do transfekcji do komórek. Inkubować przez 18 godzin.
  7. Zmień pożywkę na pożywkę F12K plus 10% płodowej surowicy bydlęcej bez antybiotyków i inkubuj przez noc. Podzielić komórki na dwie kolby T-25 z podłożem F12K plus 10% płodowej surowicy bydlęcej bez antybiotyków przez kolejne 18 godzin (w celu podziału komórek patrz krok 1.3).
  8. Zastąp pożywkę pożywką selektywną (pożywka F12K plus 10% płodowej surowicy bydlęcej 800 μg/ml GENETYCYNY, Invitrogen). Hoduj komórki za pomocą selektywnej pożywki przez 3-4 tygodnie. Z biegiem czasu będzie to selekcjonować komórki, które stabilnie włączyły plazmid do swojego genomowego DNA. Kontynuuj utrzymywanie komórek za pomocą pożywki podtrzymującej (pożywka F12K plus 10% płodowej surowicy bydlęcej z 400 μg/ml genetycyny). Okresowo zamrażaj linie komórkowe za pomocą pożywki do zamrażania w stosunku 1:1 (pożywka selektywna z 20% DMSO), aby zapobiec stratom w przypadku nieoczekiwanego zanieczyszczenia.
  9. Wybór klonalnych linii komórkowych: w pierwszym kroku trypsynizuj i odwiruj komórki z kroku 1.8 z pożywką konserwacyjną, jak w kroku 1.3. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki konserwacyjnej, pobrać 0,5 ml zawiesiny komórek i dodać 4,5 ml świeżej pożywki konserwacyjnej, aby uzyskać 10-krotne rozcieńczenie. Przenieś 10-krotne rozcieńczenie do 12 dołków na 96-dołkowej płytce, dodając 100 μl do każdej studzienki, aby wybrać pojedyncze komórki.
  10. Kontynuować wykonywanie 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń tych komórek w celu uzyskania teoretycznej końcowej zawiesiny jednej komórki na 100 μl (zwykle końcowe rozcieńczenie będzie mieścić się w zakresie od 10-11 do 10-19; całkowita liczba 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wynosi ̃19). Bezpośrednio po każdym rozcieńczeniu przenieść 100 μl rozcieńczenia do 12 dołków płytki 96-dołkowej. Po 18 godzinach inkubacji obserwuj 96 płytek dołkowych pod mikroskopem odwróconego światła lub fluorescencji i zaznacz studzienki, które wydają się zawierać tylko jedną pojedynczą komórkę lub zawierają dwie komórki, które w oczywisty sposób oddzieliły się od jednej komórki. Obserwuj codziennie i zmieniaj podłoże co trzy dni.
  11. Gdy studzienki są w 80% zlewające się (około tygodnia), przepłucz oznaczone studzienki 200 μl PBS i trypsynizuj je 100 μl roztworu PBS-trypsyna-EDTA. Przenieść komórki z każdej oznaczonej studzienki do jednego dołka 6-dołkowej płytki z 1 ml pożywki konserwacyjnej. Hoduj te komórki przez 3 dni, a następnie przenieś je do pojedynczej kolby T25. Zbadać te komórki za pomocą testu bioluminescencji wapnia z peptydami agonistycznymi (patrz punkt 2).
  12. Wybierz 1 linię komórkową z kroku 1.11 z najwyższą odpowiedzią w teście bioluminescencji wapnia na płytce i przeprowadź po raz drugi selekcję pojedynczych komórek, wykonując kroki 1.9-1.11. Okresowo zamrażaj linie komórkowe.
  13. Z selekcji wtórnej opisanej w kroku 1.12 wybierz 2-3 linie komórkowe o najwyższej odpowiedzi w teście bioluminescencji wapnia na płytce i utrzymuj je w hodowli do dalszych testów na płytkach bioluminescencyjnych wapnia. Śledź numery przejazdów. Od czasu do czasu zamrażaj linie komórkowe z wczesnych pasaży, aby zawsze móc do nich wrócić, jeśli linie komórkowe z większą liczbą pasaży przestaną działać konsekwentnie.

2. Test płytki bioluminescencji wapnia

  1. Zwiąż interesujący nas gen reporterowy do wektora ekspresji. Tutaj użyliśmy plazmidu aequorin mtAEQ/pcDNA1 (prezent od dr C. J. P. Grimmelikhuijzen i Michaela Williamsona z Uniwersytetu w Kopenhadze, Dania). Przekształć plazmid w komórkach E. coli MC1061/PS (Invitrogen) i oczyść je za pomocą zestawu do miniprepu wirowego QIAprep (Qiagen Inc.). W ostatnim etapie wymyj plazmid za pomocą buforu Tris bez EDTA, a nie wody.
  2. Hoduj linie komórkowe od kroku 1.13 wyrażające pożądany receptor w pożywce podtrzymującej. Gdy komórki są w 90% zlewne, trypsynizować, odwirować, a następnie ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki konserwującej, jak w kroku 1.3. Rozcieńczyć komórki (około 10x pożywką konserwacyjną) i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek (Bright-Line Hemacytometer) pod mikroskopem. Dostosuj liczbę komórek do około 2 x 105 komórek / ml (średnio 20 komórek w jednym z 9 kwadratów pokazanych w hemacytometrze). Umieścić 2 ml rozcieńczonych komórek w pożywce do każdego dołka na płytce sześciodołkowej. Inkubować przez 24 godziny (po inkubacji komórki powinny osiągnąć około 60% zbieżności).
  3. Zmień pożywkę w płytce 6-dołkowej na pożywkę OPTI-MEM. Dla każdej studzienki wymieszaj 96 μl OPTI-MEM z 4 μl odczynnika do transfekcji FuGENE 6 (Roche Biochemicals) w probówce do mikrofuge i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut. Dodać 1 μg plazmidowego DNA aequorin/pcDNA 1 do każdej probówki, a następnie delikatnie wstrząsać próbką przez 1 minutę, inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut. Dodaj każdą mieszaninę do każdej studzienki kroplami, delikatnie potrząsając płytką dołka. Inkubować płytki przez 6 godzin i zmienić pożywkę na pożywkę F12K zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej bez antybiotyku.
  4. Po inkubacji komórek na płytce sześciodołkowej przez 24 godziny, trypsynizować, odwirować i ponownie zawiesić komórki zgodnie z krokiem 1.3. Policz liczbę komórek do 400 000 komórek/ml w kroku 2.1 i przenieś 100 μl (łącznie 40 000 komórek/100 μl) do każdego dołka 96-dołkowej białej płytki do mikromiareczkowania z cienkim dnem (Costar 3610). Inkubuj przez kolejne 24 godziny, aż do około 80% zbiegu komórek. Jest to optymalne stężenie komórek do testu bioluminescencyjnego.
  5. Przygotować 90 μl/basenik bezwapniowej pożywki DMEM (Invitrogen) zawierającej 5 μM koelenterazyny (Invitrogen) w ciemności (koelenterazyna jest wrażliwa na światło). Weź płytkę z 2,4, usuń stare podłoże i dodaj te 90 μl do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 3 godziny w ciemności w temperaturze 37°C i 5% CO2 , po czym komórki na płytce są gotowe do badania.

3. Obsługa urządzenia i analiza danych

  1. Każdy czytnik płytek bioluminescencyjnych jest inny. Nasz test wykonujemy za pomocą czytnika płytek NOVOstar (BMG Labtechnologies) w trybie bioluminescencji. Jeśli używasz innego instrumentu, musisz dostosować protokół.
  2. Przed użyciem należy oczyścić pompy czytnika płytek (lub POMPY ZALEWOWE). Wyłącz światło w pomieszczeniu przed umieszczeniem tabliczki na uchwycie talerzy. Po zamknięciu uchwytu na talerz włącz światła.
  3. Rozpuszczaj peptydy (w 1,5 ml probówce Eppendorfa) w bezwapniowym pożywce DMEM. Ustaw "Głębokość aspiracji" i "Określenie pozycji" roztworu peptydu przed użyciem. Rzuć wyzwanie komórkom za pomocą 10 μl (10x) o różnych stężeniach peptydów (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3 lub inny pożądany peptyd) i natychmiast rozpocznij rejestrowanie emisji światła. Ustawiliśmy instrument tak, aby rejestrował emisję światła (465 nm) dla każdej studni co 2 sekundy przez łączny czas 50 sekund.
  4. Upewnij się, że uwzględniłeś kontrolę pozytywną, taką jak aktywny analog (zastosowano analogowy FFFSWGa, Taneja-Bageshwar i wsp., 2009) oraz kontrolę negatywną, taką jak transfekowane komórki tylko wektorowe. Kontrola ujemna będzie konieczna podczas analizy danych w celu ustalenia progu wyjściowego (zob. reprezentatywne wyniki). Niepowiązany, nieaktywny peptyd może być również dodany jako kontrola ujemna.
  5. Po zakończeniu pracy umyj pompę instrumentalną (lub POMPY PRIME), a następnie umieść następną próbkę peptydu. Zapisz swoje dane i ponownie umyj pompy.
  6. Obsługa danych: Przenieś dane dotyczące emisji światła z każdej studni do arkusza danych programu Microsoft Excel.
  7. Wklej dane z Excela do oprogramowania Prism 4.0 z GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Różne stężenia peptydów to oś X, a jednostki bioluminescencji to oś Y. Aby znormalizować dane, należy wykreślić krzywą logarytm-odpowiedź. Wybierz analizę dopasowania krzywej regresji nieliniowej (sigmoidalne równanie dawka-odpowiedź ze zmiennym nachyleniem), aby uzyskać krzywe stężenie-odpowiedź dla każdego peptydu. Program wykreśla wartości na końcu i podaje EC50.
  8. Każdy eksperyment należy powtórzyć trzy razy w celu analizy danych.

4. Reprezentatywne wyniki:

Gdy wyrażony w komórkach CHO-K1, receptor kininowy komara Aedes aegypti zachowywał się jak receptor wieloligandowy i funkcjonalnie reagował na stężenia tak niskie jak 1 nM trzech endogenorów Aedes kinin, Aedae kinins 1-3, testowane pojedynczo za pomocą testu płytki bioluminescencji wapnia. Rysunek 1 pokazuje, że uzyskana kolejność rang mocy była następująca: Aedae-K-3 > Aedae-K-2 > Aedae-K-1, w oparciu o odpowiednie wartości EC50 Aedae-K-3, 16,04 nM; Aedae-K-2, 26,6 nM i Aedae-K-1, 48,85 nM, które różniły się statystycznie istotnie (P < 0,05) (Pietrantonio i wsp., 2005).

Użyliśmy również tego testu, aby określić, które reszty kininy są kluczowe dla interakcji peptyd kinina z receptorem. Peptydy kininowe owadów mają wspólny C-końcowy pentapeptyd, który reprezentuje minimalną sekwencję wymaganą do aktywności biologicznej, znaną również jako rdzeń. W Tabeli 1 analogi rdzenia peptydu kininowego zsyntetyzowano jako serię zastępczą alaniny rdzeniowego pentapeptydu kininowego FFSWGa i przetestowano za pomocą testu bioluminescencji wapnia na płytkach (Taneja-Bageshwar i wsp., 2006). Odkryliśmy, że aminokwasy Phe1 i Trp4 były niezbędne do aktywności kinin owadów dla obu receptorów.

Test może być również używany do testowania peptydów zaprojektowanych w celu zwiększenia biostabilności. Tabela 2 przedstawia zaprojektowane analogi kininy zawierające kwas aminoizomasłowy (Aib) testowane na rekombinowanym receptorze kininowym kleszcza, a rysunek 2 przedstawia porównanie aktywności sześciu analogów kwasu alfa-aminoizomasłowego na linii komórkowej receptora kininy kleszcza eksprymującego CHO-K1 za pomocą testu bioluminescencji płytki wapniowej (Taneja-Bageshwar i wsp., 2009). Analog heksapeptydu FFFSWGa dodaje się w celu pozytywnej kontroli aktywności receptora. Analogowy FF[Aib]WGa okazał się bardziej aktywny niż ten analog kontroli heksapeptydu. Analog z dwoma zamiennikami kwasu aminoizomasłowego, [Aib]FF[Aib]WGa, był najsilniejszym z testowanych analogów podwójnej wymiany (Tabela 2 i Rysunek 2).

Więcej przykładów zastosowania tego testu można znaleźć w Nachman i Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar i wsp. (2008a) oraz Taneja-Bageshwar i wsp. (2008b).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Oszacowanie efektywnego stężenia kinin Aedes (EC50) na komórkach CHO-K1 E10 za pomocą testu na płytce wapienno-bioluminescencyjnej. Oś y w krzywych stężenie-odpowiedź uzyskano z jednostek bioluminescencji wyrażonych jako procent maksymalnej odpowiedzi obserwowanej dla każdego peptydu. Punkty danych reprezentują średnią z sześciu powtórzeń uzyskanych podczas trzech niezależnych eksperymentów. Słupki reprezentują błąd standardowy. a) Oszacowanie Aedae-K1 EC50 = 48 nM. b) Oszacowanie Aedae-K2 EC50 = 26 nM. c) Oszacowanie Aedae-K3 EC50 = 16 nM. EC50 Aedae-K3 < EC50 Aedae-K2 < EC50 Aedae-K1; P < 0,05. Analiza statystyczna i wykresy zostały wykonane za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 4.0.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Porównanie aktywności sześciu analogów kwasu alfa-aminoizomasłowego na linii komórkowej receptora kininy kleszcza wykazującego ekspresję CHO-K1 za pomocą testu na płytce bioluminescencji wapnia. Oś y reprezentuje procent maksymalnych jednostek bioluminescencji dla każdego analogu wyrażony jako procent bioluminescencji obserwowanej przy stężeniu w porównaniu z maksymalną odpowiedzią obserwowaną wśród wszystkich stężeń badanych dla każdego analogu. Analizę statystyczną i wykresy wykonano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 4.0.

  Linia komórkowa receptora kleszcza Linia komórkowa receptora komara peptydy EC50 (nM) Maksymalna odpowiedź bioluminescencyjna przy 1 mM EC50 (nM) Maksymalna odpowiedź bioluminescencyjna przy 1 mM AFSWGa (Federacja AFSWGa) ja ja ja ja FASWGa (Międzynarodowa Organizacja Pracy) Okręg wyborczy 586 TGL 5 600 szt. b.d. 400 szt. FFAWGa powiedział: Rozdział 64 12 800 osób Okręg wyborczy 621 TGL 3 050 szt. FFSAGa powiedział: ja ja ja ja FFSWAa powiedział: Z numerem 417 10 600 osób 2 800 szt. 1 830 szt. FFSWGa powiedział: 590 szt. 10 800 TGL b.d. 525 szt. Międzynarodowa Grupa Robocza (FSWGa) ja ja ja ja FFSWa powiedział: ja ja ja ja FFSWG-OH ja ja ja ja FFFSWGa powiedział: 259 szt. 13 000 osób 562 JEZDNE 10 000 szt. FF[Aib]WGa 29 12 700 szt. 445 szt. 9 300 osób

Tabela 1. Szacowane potencje (EC50) i maksymalna odpowiedź bioluminescencyjna wszystkich peptydów badanych na liniach komórkowych transfekowanych receptorami kleszczy i komarów*.

*EC50 szacuje stężenie wymagane do wywołania odpowiedzi o połowie maksymalnej. I: Nieaktywny, jeśli odpowiedź bioluminescencyjna jest mniejsza niż 300 jednostek (poziom komórek transfekowanych tylko wektorem). A: Pozycja, w której odpowiednia reszta w peptydzie FFSWGa została zastąpiona alaniną. N.D.: Analog był testowany, ale albo nie był zbyt aktywny, albo nie był aktywny w dolnych zębach trzonowych, więc nie można było określić EC50.

K-AIB-1 [Aib]FF[Aib]WGa K-AIB-2 [α MeF]FF[Aib]WGa K-AIB-3 Ac-R[Aib]FF[Aib]WGa K-AIB-4 Ac-R[β3F]FF[Aib]WGa K-AIB-5 [Aib]RFF[Aib]WGa K-AIB-6 [Aib-Aib-Aib-Aib]RFF[Aib]WGa

Tabela 2. Analogi kininy (K) zawierające kwas aminoizomasłowy (Aib) badane na rekombinowanym receptorze kininowym kleszcza. Ac: acetyl; α mnie: α metylo-fenyloalaniny; β3F: β3 -fenyloalanina; O: Amid.

Dyskusja

Dzięki zastosowaniu niniejszego protokołu udało nam się przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną pierwszego receptora neuropeptydowego odkrytego u Arachnida (kleszcze, roztocza i pająki) – receptora kininowego kleszcza. Metoda ta ma trzy główne zastosowania. Po pierwsze, technikę tę można wykorzystać do deoatfania receptorów poprzez pomiary aktywności ligandów. Po drugie, test ten pozwala na określenie zależności między strukturą a aktywnością (SAR) ligandu i receptora. Po trzecie, metody te mogą być wykorzystane w procesie poszukiwania nowych leków. Co więcej, protokół ten może służyć do badania aktywności agonistów lub antagonistów niemal każdego GPCR. Rozpoczynamy proces adaptacji tego protokołu do skriningu małych bibliotek związków. Wykorzystana przez nas linia komórkowa nie wykazuje ekspresji powszechnego białka G, G16. Nie było ono wymagane, ponieważ receptory kininowe stawonogów sygnalizują poprzez białko Gq i wewnątrzkomórkową kaskadę wapniową, a właściwości sygnalizacyjne te zostają zachowane w komórkach ssaków, co wykazano w niniejszej pracy.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Wyrażamy wdzięczność dr. C. J. P. Grimmelikhuijzenowi i dr. Michaelowi Williamsonowi z Uniwersytetu Kopenhaskiego (Dania) za udostępnienie plazmidu aequoriny. Dziękujemy naszemu współpracownikowi, dr. Ronaldowi J. Nachmanowi z ARS-USDA (TX, USA), za syntezę peptydów oraz udostępnienie czytnika płytek NOVOstar.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogenABCD1234
komórki CHO-K1ATCCCCL-61Manassas, VA, USA
pożywka F12KInvitrogen21127
płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF0643
Trypsyna-EDTA (10x)Invitrogen15400
antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczyInvitrogen15240
pożywka z obniżoną zawartością surowicy Opti-MEM IInvitrogen31985
odczynnik LipofectinInvitrogen18292-011
GENETICINInvitrogen10131035
MC1061/P3 UltracompInvitrogenC663-03
zestaw QIAprep spin miniprepQiagen19064
odczynnik do transfekcji FuGENE 6Roche Group11 814 443 001
biała mikropłytka 96-dołkowa z cienkim dnemCostar3610
pożywka DMEM bez wapniaInvitrogen21068
C–lenterazynaInvitrogenC-2944
Hemocytometr Bright-LineHausser ScientificHorsham, PA
NOVOstarBMG Labtechnologies
oprogramowanie Prism 4.0GraphPad Software Inc.San Diego, CA, USA
kolby T-25 i T-75BD Biosciences353014 i 353135

Bibliografia

  1. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).
  2. Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).
  3. Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).
  4. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs. General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).
  5. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus. Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.
  6. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti. Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.
  7. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).
  8. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).
  9. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).
  10. Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).
  11. Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor. Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja GPCRstabilne linie kom rkowereceptory kininaktywno strukturalna peptyd wreporter aekworynowytraktowanie coelenterazynkom rki CHO K1

Powiązane artykuły