Elektrolityczna indukcja aktywacji śródbłonka wewnętrznej powierzchni żyły głównej dolnej prowadzi do powstania zakrzepu typu żylnego w wyniku aktywacji śródbłonka oraz częściowej stagnacji krwi, które są dwoma komponentami triady Virchowa.
Artykuł metodologiczny
Elektrolityczny model żyły głównej dolnej (EIM) zakrzepicy żylnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w badaniach nad zakrzepicą żył głębokich (DVT), umożliwiając badanie tworzenia się i rozpuszczania zakrzepów oraz testowanie potencjalnych związków terapeutycznych (1). Obecnie opracowywane są nowe związki, które mogłyby zostać wykorzystane w leczeniu i zapobieganiu DVT. Problematyczne okazało się dostarczanie potencjalnych terapeutycznych związków antagonistycznych do zajętej zakrzepem żyły. W kontekście zastosowań terapeutycznych opracowano niedawno model wykorzystujący częściową stazę, który w sposób powtarzalny generuje zakrzepy w obrębie głównej żyły. Elektrolityczny model żyły głównej dolnej (EIM) to mysi model DVT, który umożliwia formowanie się zakrzepów przy zachowaniu ciągłego przepływu krwi. Model ten pozwala na dynamiczny kontakt środków terapeutycznych z zakrzepem i jest bardziej czuły niż inne modele DVT (1). Ponadto model ten ściśle symuluje kliniczne sytuacje powstawania zakrzepów i jest idealny do badania aktywacji komórek śródbłonka żylnego, migracji leukocytów, trombogenezy żylnej oraz do testowania zastosowań terapeutycznych (1). Model EIM jest prosty technicznie, łatwo reprodukowalny, tworzy zakrzepy o powtarzalnych rozmiarach i pozwala na pobranie dużej próbki (np. zakrzepu i ściany żyły), co jest niezbędne do celów analitycznych.
Protokół
1. Procedury znieczulania myszy
- Zwierzęta zostają wyjęte z klatki i umieszczone w komorze indukcyjnej do znieczulenia przedoperacyjnego w celu indukcji gazowej przy użyciu 2% izofluranu i 100% tlenu przy przepływie 0,5 litra na minutę (kontrolowanym przez parownik).
- Myszy zostają uspokojone w komorze indukcyjnej, po czym są z niej wyjmowane, a brzuchna strona brzucha zostaje ogolona strzygarką elektryczną; w przypadku zastosowania depilatora zwierzęta pozostają w komorze (1 min).
- Podczas gdy zwierzęta nadal znajdują się pod wpływem sedacji, zostają zważone, a ich oczy zostają nasmarowane sterylną maścią oftalmiczną; następnie zostają umieszczone w pozycji grzbietowej na urządzeniu grzewczym z obiegiem ciepłej wody w znieczuleniu ogólnym z maską nosową z użyciem izofluranu i tlenu. W tym momencie przepływ tlenu zostaje zmniejszony do 0,2 litra na minutę.
- Brzuch zostaje spryskany roztworem chlorheksydyny (diacetat chlorheksydyny wykazuje szybkie działanie bakteriobójcze i trwałe) i przetarty sterylną gazą trzykrotnie lub do momentu oczyszczenia pola operacyjnego.
2. Procedury mikrochirurgiczne i rekonwalescencyjne u myszy
- Wykonuje się nacięcie w linii środkowej brzucha (2 cm) nożyczkami irydologicznymi przez skórę i ścianę brzuszną, odsłaniając jamę brzuszną. Nasączoną sterylną solą fizjologiczną gazę 2x2 stosuje się do odsunięcia jelit na lewą stronę zwierzęcia. Stosuje się stabilizator dla myszy, umożliwiający wizualizację żyły głównej dolnej (IVC).
- W tym momencie stężenie izofluranu zostaje zmniejszone do poziomu podtrzymującego 2%, a przepływ tlenu pozostaje na poziomie 0,2 litrów na minutę przez resztę procedury chirurgicznej.
- Rozwarstwianie tępe ułatwia zastosowanie sterylnego aplikatora w formie patyczka oraz bardzo delikatnych półzakrzywionych pęset tkankowych irydologicznych. Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulacji tkankami myszy, ponieważ są one niezwykle delikatne.
- Wszystkie odgałęzienia IVC, od żył nerkowych do bifurkacji biodrowej, zostają podwiązane nieaktywnymi szwami z prolenu 7-0. Gałęzie tylne pozostają drożne.
- W modelu elektrolitycznym IVC (EIM) igłę ze stali nierdzewnej 25G, przytwierdzoną do miedzianego drutu powlekanego srebrem (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ), wprowadza się do odsłoniętego odcinka końcowego IVC (Rysunek 1) i ustawia przy ścianie przedniej (anoda).
- Kolejny drut implantuje się podskórnie, domykając obwód (katoda).
- Przez 15 minut przykładano prąd o natężeniu 250 μAmps, używając stymulatora fal prostokątnych Grass S48 oraz jednostki prądu stałego (Grass Technologies, An Astro-Med, Inc.,West Warwick, RI). Prąd stały prowadzi do powstania toksycznych produktów elektrolizy, które niszczą powierzchnię śródbłonka IVC, sprzyjając środowisku trombogenicznemu i późniejszemu tworzeniu się zakrzepu.
- Po 15 minutach igłę się usuwa, a w miejscu wkłucia delikatnie przytrzymuje się patyczek bawełniany, aby zapobiec krwawieniu.
- W zwierzętach grupy kontrolnej (sham) igłę wprowadza się do IVC, a następnie usuwa, bez przykładania prądu.
- Miejsce laparotomii zamyka się dwuwarstwowo. W naszym laboratorium do zamknięcia ściany brzusznej stosujemy syntetyczny szew Vicryl 5-0 w szwie ciągłym. Do zamknięcia skóry używa się kleju tkankowego. Brak jest zewnętrznych szwów wymagających usunięcia.
- Myszy są następnie wybudzane w indywidualnych klatkach pod ścisłą obserwacją pooperacyjną (od 45 minut do 2 godzin) pod lampą grzewczą (minimalna odległość 24 cale od klatki), a następnie powracają do swoich pierwotnych jednostek mieszkalnych. Można stosować leki przeciwbólowe i przeciwzapalne, o ile nie zakłócają one celu badania. Wymagane jest naukowe uzasadnienie zaniechania podawania leków przeciwbólowych oraz zgoda weterynaryjna i komisji ICUCA. W naszym laboratorium stwierdzono, że Buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg s.c. jest doskonałym środkiem przeciwbólowym przed- i pooperacyjnym dla myszy. Dodatkowo w miejscu nacięcia można podać Lidokainę w dawce 4mg/kg (0,4 ml/kg roztworu 1%), gdy systemowe środki przeciwbólowe mogłyby zaburzyć wyniki eksperymentalne.
- Zazwyczaj nie obserwujemy pooperacyjnych skutków niepożądanych wynikających z zakrzepicy żył głębokich (DVT). Jednakże pooperacyjne powikłania mogą obejmować nagłą śmierć anestezjologiczną, utratę krwi podczas operacji oraz częściczny niedowład w wyniku urazu nerwów. Zwierzętom o spowolnionym powrocie do zdrowia można podawać żel Nutria Gel lub umieścić wilgotną karmę na dnie klatki, aby ułatwić rekonwalescencję. Zwierzęta z ciężkimi powikłaniami pooperacyjnymi powinny zostać humanitarnie uśpione.
- W wyznaczonym punkcie czasowym przeprowadza się humanitarną eutanazję zgodnie z zaleceniami zawartymi w wytycznych American Veterinary Medical Association Guidelines on Euthanasia dla gryzoni.
3. Reprezentatywne wyniki
EIM to model, w którym tworzy się zakrzep w warunkach ciągłego przepływu krwi. Poniższe rysunki przedstawiają parametry badane w tym nowatorskim modelu.
Rycina 1 określa obszar anatomiczny, w który wprowadzana jest igła ze stali nierdzewnej 25G, przymocowana do miedzianego drutu powlekanego srebrem (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ). Należy zauważyć, że w pobliżu znajduje się węzeł chłonny, który służy jako punkt orientacyjny do zlokalizowania ogonowej części żyły głównej dolnej.
Rycina 2: Masa zakrzepu 2 dni po EIM u różnych szczepów. Zgodnie z oczekiwaniami, masa zakrzepu była mniejsza u myszy PAI-1 KO i większa u myszy Delta CT o zwiększonej krzepliwości (^CT).
Rysunek 3: Poziom rozpuszczalnej P-selektyny, markera zakrzepicy żył głębokich, zmierzono u różnych szczepów. Najniższe poziomy odnotowano u myszy PAI-1 KO, natomiast najwyższe u myszy delta CT z nadkrzepliwością.
Rycina 4 W różnych szczepach stwierdzono korelację między masą skrzepu a rozpuszczalną P-selektyną. Warto zauważyć, że w grupie, w której powstały skrzepy o najmniejszej wielkości, poziom wykrytej rozpuszczalnej P-selektyny był najniższy (myszy PAI-1 KO). W grupie, w której powstały skrzepy o największej wielkości, poziom wykrytej rozpuszczalnej P-selektyny był najwyższy (hiperkrzepliwe delta CT).
Rycina 5: W celu wykazania obecności przepływu krwi u myszy poddanych EIM wykonano badanie ultradźwiękowe. Rycina 5 przedstawia badanie ultradźwiękowe wykonane u myszy 2 dni po EIM. Następnie pobrano preparat. Należy zauważyć, że kształt zakrzepu sugeruje jego powstanie w obecności przepływu
Dyskusja
Mysz jest doskonałym narzędziem badawczym do eksperymentów in vivo. W związku z tym konieczne jest opracowywanie modeli mysich, które ściśle naśladują choroby lub stany patologiczne. Do badania zakrzepicy żył głębokich (DVT) wykorzystywano kilka modeli mysich, w tym: fotochemiczny (2), zastoinowy (3-4) oraz model urazu mechanicznego (5-6). Żaden z tych modeli nie wykorzystuje jednak wewnętrznego bodźca śródbłonkowego do generowania zakrzepu przy zachowaniu ciągłego przepływu krwi. Model EIM, wykorzystujący bodziec elektrolityczny w obrębie żyły głównej dolnej (IVC), promuje trombogenezę żylną poprzez aktywację śródbłonka w obecności przepływu krwi (1). Jest on technicznie prosty, łatwo powtarzalny i charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem przeżywalności (99%). Pomimo zastosowania prądu elektrycznego do wywołania elektrolizy, nie dochodzi do generowania ciepła (1). Model EIM ściśle symuluje kliniczną zakrzepicę żył głębokich i tym samym stanowi cenny instrument do badania wewnętrznych mechanizmów powstawania i rozpuszczania zakrzepów. Model EIM jest również użyteczny w opracowywaniu nowych podejść terapeutycznych w leczeniu chorób zakrzepowych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Wspierane przez NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal Core A, NIH 1 K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
Bibliografia
- Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
- Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
- Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
- Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
- Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Myszy w modelu zakrzepicy żylnejprzepływ krwi podczas formowania zakrzepupodwiązanie żyły głównej dolnejelektrolityczna indukcja zakrzepuporównanie zakrzepów w zależności od szczepu myszykorelacja zakrzepów z rozpuszczalną pektynądetekcja zakrzepów za pomocą ultradźwiękówzakrzepica przy ciągłym przepływie krwimodel testowania środków terapeutycznych
