„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Podsumowanie

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

Streszczenie

Yersinia pestis i Bacillus anthracis to bakteryjne patogeny kategorii A, które są odpowiednio czynnikami etiologicznymi dżumy i wąglika ¹. Choć naturalne występowanie obu tych chorób jest obecnie stosunkowo rzadkie, realna jest możliwość wykorzystania tych patogenów jako broni biologicznej przez grupy terrorystyczne. Ze względu na immanentną zakaźność chorób, gwałtowny przebieg kliniczny oraz wysoką śmiertelność, kluczowe jest szybkie wykrycie ogniska epidemicznego. W związku z tym niezbędne są metodologie zapewniające szybką detekcję i diagnostykę, aby zagwarantować natychmiastowe wdrożenie środków zdrowia publicznego oraz aktywację zarządzania kryzysowego.

Rekombinowane fagi reporterowe mogą stanowić szybką i specyficzną metodę wykrywania Y. pestis oraz B. anthracis. Centers for Disease Control and Prevention obecnie stosują klasyczne testy lizy fagowej w celu potwierdzonej identyfikacji tych patogenów bakteryjnych ^2-4. Testy te wykorzystują naturalnie występujące fagi, które są specyficzne i lityczne dla swoich gospodarzy bakteryjnych. Po nocnym wzrostu hodowli bakterii w obecności specyficznego faga, powstanie placków (liza bakterii) stanowi pozytywną identyfikację celu bakteryjnego. Choć testy te są wiarygodne, obarczone są trzema wadami: 1) są one prowadzone w warunkach laboratoryjnych; 2) wymagają izolacji i hodowli bakterii z podejrzanej próbki oraz 3) ich wykonanie zajmuje od 24 do 36 h. Aby rozwiązać te problemy, zaprojektowano genetycznie rekombinowane fagi reporterowe z „znacznikiem świetlnym” poprzez integrację genów Vibrio harveyi luxAB z genomem fagów specyficznych dla Y. pestis i B. anthracis ^5-8. Powstałe fagi reporterowe luxAB były w stanie wykryć swój specyficzny cel poprzez szybkie (w ciągu kilku minut) i czułe nadanie fenotypu bioluminescencyjnego komórkom biorcy. Co ważne, detekcję uzyskano zarówno w przypadku hodowlanych komórek biorcy, jak i w pozorowanych zakażonych próbkach klinicznych ⁷.

W celach demonstracyjnych opisujemy tutaj metodę detekcji znanego izolatu Y. pestis za pomocą fagów, z wykorzystaniem faga reporterowego luxAB skonstruowanego na bazie diagnostycznego faga dżumy CDC ΦA1122 ^6,7 (Rysunek 1). Podobną metodę, z niewielkimi modyfikacjami (np. zmiana temperatury hodowli i pożywek), można zastosować do detekcji izolatów B. anthracis przy użyciu faga reporterowego B. anthracis Wβ::luxAB ⁸. Metoda ta polega na transdukcji fenotypu bioluminescencyjnego za pośrednictwem fagów do hodowanych komórek Y. pestis, które następnie są mierzone za pomocą luminometru do mikropłytek. Głównymi zaletami tej metody w porównaniu do tradycyjnych testów lizy fagowej są łatwość użycia, szybkie uzyskanie wyników oraz możliwość jednoczesnego badania wielu próbek w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej.

Rycina 1. Schemat detekcji. Fagidmieszane są z próbką, fagi infekują komórkę, dochodzi do ekspresji luxAB, a komórka emituje bioluminescencję. Obróbka próbki nie jest konieczna; fagi i komórki są mieszane, a następnie mierzy się emitowane przez nie światło.

Protokół

1. Inokulacja płytek Y. pestis

1. Wysiać kultury stokowe Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) na agar Luria-Bertani (LB) (Miller). Należy stosować techniki sterylne, a wszystkie manipulacje z Y. pestis wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A. Y. pestis A1122 jest szczepem wykluczonym z listy czynników selektywnych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2. Brakuje w nim zarówno plazmidu wirulencji Lcr (low-calcium response) o wielkości 75 kb, jak i locus pgm, które są niezbędne do wywołania choroby. Hodować Y. pestis w temperaturze 28°C przez 48 h w statycznym inkubatorze z kontrolowaną temperaturą powietrza. Tempo wzrostu Y. pestis jest powolne, a czas generacji wynosi 1,25 h ⁹.

2. Inokulacja Y. pestis w pożywkach płynnych

1. Za pomocą sterylnej metalowej pętli szczepiającej przenieś pojedynczą kolonię Y. pestis do sterylnej probówki do hodowli o wymiarach 17 x 100 mm zawierającej 2 mL bulionu LB. Wybierz kolonię o jednolitym rozmiarze, reprezentatywną dla pozostałych kolonii i wyraźnie oddzieloną od innych kolonii na płytce. Krótko wymieszaj probówkę w wirówce laboratoryjnej (vortex) i inkubuj kulturę w temperaturze 28°C przez około 20 h w inkubatorze z wytrząsaniem (225 rpm).

3. Namnażanie Y. pestis, dodanie faga reporterowego i detekcja bioluminescencyjna

1. Rozcieńczyć nocną kulturę Y. pestis w stosunku 1:20 w świeżej pożywce LB w probówce typu Falcon 50 mL (np. 500 μL komórek w 9,5 mL pożywki) i hodować w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (225 rpm). Hodować do momentu osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (A₆₀₀) wynoszącej 0,2 (około 5 h). Do detekcji preferowane są komórki w fazie aktywnego wzrostu, ponieważ zdolność faga do transdukcji odpowiedzi bioluminescencyjnej jest skorelowana z żywotnością i kondycją bakterii gospodarza. Niemniej jednak wykazano, że system detekcji jest kompatybilny z komórkami pobranymi na wszystkich etapach cyklu wzrostu ⁷.
2. Przygotować substrat niezbędny do reakcji bioluminescencyjnej, sporządzając 2% roztwór n-dekanalu. Wymieszać 200 μL n-dekanalu z 9,8 mL pożywki LB. Wigorystycznie wierzgać na vortexie przez 5 s. Napełnić wtryskiwacz luminometru do mikropłytek 2 mL 2% roztworu n-dekanalu. Zaprogramować luminometr tak, aby automatycznie wstrzykiwał 67 μL roztworu dekanalu do każdej studzienki mikropłytki, a następnie natychmiast odczytać próbkę przez 10 s.
3. Rozdzielić aliquoty 1 mL pożywki LB do 3 probówek hodowlanych. Do każdej probówki dodać 20 μL roztworu zapasu faga reporterowego (zapas o stężeniu 5 x 10⁹ jednostek tworzących plaki [PFU]/mL); próbki zawierające sam faga i samą pożywkę służą jako kontrola negatywna. W przypadku braku komórek Y. pestis , dodanie faga reporterowego nie powinno wywołać odpowiedzi bioluminescencyjnej.
4. Rozdzielić aliquoty 1 mL kultury Y. pestis (z kroku 3.1) do 6 probówek hodowlanych. Do 3 z kultur dodać 20 μL zapasu faga reporterowego (kultury testowe). Pozostałe 3 kultury służą jako kontrola negatywna „same komórki” (autobioluminescencja tła). Wymieszać kultury, krótko wierzgając na vortexie, pobrać 200 μL z każdej próbki (do odczytu w czasie 0) i rozdzielić do białej mikropłytki 96-dołkowej. Inkubować pozostałą kulturę w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (225 rpm).
5. Zmierzyć bioluminescencję próbek z czasu 0 (relatywne jednostki światła, RLU) przy użyciu luminometru do mikropłytek.
6. Pobrać 200 μL z każdej próbki po 10, 20, 30, 40, 50 i 60 min od dodania faga reporterowego i zmierzyć bioluminescencję próbki. Jeśli komórki Y. pestis są obecne, fag reporterowy specyficznie zwiąże się z komórką, wstrzyknie swoje DNA i wykorzysta aparat transkrypcyjny i translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji genów reporterowych luxAB (Rysunek 1).
7. Siła sygnału i czas odpowiedzi sygnałowej są proporcjonalne do liczby obecnych komórek. Przy wysokich stężeniach komórek (10⁵-10⁸ CFU/mL) znaczny wzrost RLU w porównaniu z kontrolami powinien być widoczny w ciągu 20 min. Przy niższych stężeniach komórek (10²-10⁴ CFU/mL) znaczny wzrost RLU powinien być widoczny w ciągu 40-60 min.
8. Alternatywnie, aby przyspieszyć proces detekcji bez konieczności namnażania Y. pestis, kolonię ze świeżo wyhodowanej płytki można wymieszać (na vortexie) bezpośrednio w probówce eppendorf 1,5 mL z 200 μL pożywki LB zawierającej faga reporterowego. Przenieść mieszaninę komórek i faga do studzienki mikropłytki. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 28°C i odczytać bioluminescencję próbki po 60 min (tylko jeden punkt czasowy).

4. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny przebieg czasowy eksperymentu z wykorzystaniem detekcji Y. pestis za pomocą fagów reporterowych przedstawiono na Rysunku 2. Kontrole negatywne obejmujące 1) same fagi (brak komórek) lub 2) same komórki (brak fagów) wykazują podstawowe poziomy bioluminescencji wynoszące około 20 RLU przez cały 60 min okres inkubacji (poziomy podstawowe są zależne od luminometru). W przeciwieństwie do nich, w próbkach testowych (fagi reporterowe i komórki) wzrost bioluminescencji jest widoczny 15 min po dodaniu fagów. Natężenie sygnału powinno stale rosnąć przez 60 min. Inkubacja przez dłuższy czas (powyżej 80 min) spowoduje spadek sygnału względem wartości szczytowej z powodu lizy komórek gospodarza indukowanej przez fagi. Podobne wyniki uzyskuje się w temperaturze inkubacji 37°C, mimo że optymalna temperatura wzrostu Y. pestis wynosi 28°C ⁹.

Rycina 2. Bioluminescencyjna detekcja Y. pestis za pośrednictwem fagów. W czasie 0 zmieszano fagi reporterowe z komórkami, inkubowano w 28°C i monitorowano bioluminescencję (RLU) w czasie. Znaczący wzrost RLU (* test t Studenta, p<0.05) jest widoczny w ciągu 15 min.

Dyskusja

Metoda ta demonstruje zdolność faga reporterowego do szybkiego wykrywania Y. pestis, ponieważ fag reporterowy może transdukować odpowiedź w postaci sygnału bioluminescencyjnego w hodowlach komórek Y. pestis w ciągu 20 min od dodania faga. Fag reporterowy jest również zdolny do bezpośredniego wykrywania Y. pestis w matrycach klinicznych, bez konieczności uprzedniej izolacji i późniejszej hodowli ⁷. W porównaniu do standardowych testów lizy fagowej, które zazwyczaj wymagają 48 h do zak...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar LB Difco, Miller	VWR international	90003-346
Pożywka LB Difco, Miller	VWR international	90003-350
Probówki hodowlane 17 x 100 mm	USA Scientific, Inc.	1485-0810
n-Decanal	Sigma-Aldrich	D7384
Luminometr do mikropłytek Veritas	Turner Biosystems	9100-001
Mikropłytka Microlite z 96 dołkami	VWR international	62402-984