Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja leukocytów naciekających mózg
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy metodę przygotowania leukocytów naciekających mózg (BILs) u myszy. Demonstrujemy, jak zinfekować myszy wirusem encephalomyelitis mysiej Theilera (TMEV) za pomocą techniki szybkiego wstrzyknięcia doczaszkowego oraz jak oczyścić populację komórek naciekających wzbogaconą w leukocyty z całego mózgu. W skrócie, myszy są znieczulane izofluranem w zamkniętej komorze, a następnie wykonuje się wolnoręczne wstrzyknięcie do kory czołowej za pomocą strzykawki Hamiltona. Myszy są następnie uśmiercane w różnych odstępach czasu po infekcji poprzez przedawkowanie izofluranu, a całe mózgi są pobierane i homogenizowane w medium RPMI przy użyciu homogenizatora tkankowego Tenbroeck. Homogenaty mózgowe są wirowane przez ciągły gradient 30% Percoll w celu usunięcia mieliny i innych odłamków komórkowych. Zawiesina komórkowa jest następnie filtrowana przez sito 40 μm, płukana i wirowana na nieciągłym gradiencie Ficoll-Paque Plus w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia leukocytów. Następnie leukocyty są płukane i resuspenderowane w odpowiednich buforach do immunofenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa wykazuje obecność populacji wrodzonych komórek odpornościowych we wczesnych stadiach infekcji u myszy C57BL/6. 24 godziny po infekcji w BILs obecnych jest wiele podzbiorów komórek odpornościowych, z wzbogaconą populacją komórek Gr1+, CD11b+ i F4/80+. Zatem metoda ta jest użyteczna w charakteryzacji odpowiedzi odpornościowej na ostrą infekcję w mózgu.
Protokół
1. Wewnątrzczaszkowa injekcja wirusa:
Poniższa technika została zmodyfikowana i szeroko wykorzystywana przez nasze laboratorium oraz współpracowników. W skrócie, u młodych myszy (preferencyjnie w wieku 5-6 tygodni) przeprowadza się wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie wirusa zapalenia mózgu i rdzenia myszy (TMEV) szczepu Daniel's lub infekcję pozorowaną (1, 10), aby wywołać naciek leukocytów do mózgu (BILs). Należy zauważyć, że wyniki będą się różnić w zależności od zastosowania szczepu Daniel's, szczepu BeAN oraz szczepu GDVII. W celu pozyskania BILs myszy otrzymują 2x105 PFU TMEV i są infekowane przez 24 godziny.
- Przymocu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową w celu określenia zarówno jakości preparatu komórek naciekających mózg, jak i rozróżnienia różnych populacji komórek odpornościowych 2, 9. W ostrych punktach czasowych nasza metoda BILs pozwala na uzyskanie wysokich odsetków monocytów zapalnych w populacji CD45hi, a także wysokich odsetków makrofagów w populacji CD45lo. Wskazuje to, że powtarzalna odpowiedź immunologiczna w obrębie mózgu może być w sposób wiarygodny charakteryzowana za pomocą naszej metody.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NS64571 z NINDS (CLH), stypendium rozwojowe dla młodych naukowców z Mayo Clinic (CLH) oraz hojną darowiznę od Donalda i Frances Herdrich (CLH). Chcielibyśmy podziękować Mayo Clinic Flow Cytometry Core za pomoc.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| szczep Daniel’a | Invitrogen | 21063-029 | |
| izofluran | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| probówki wirówkowe Oak Ridge z okrągłym dnem | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| błękit trypanu 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| probówki stożkowe 15 ml | BD Biosciences | 352097 | |
| szklany homogenizator tkanek Tenbr–ck marki Pyrex 7 mL | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| sito do komórek 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| probówki stożkowe 50 mL | BD Biosciences | 352070 | |
| albumina surowicy wołowej | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| azotek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| probówki do FACS | BD Biosciences | 352054 | |
| płodowa surowica wołowa | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| hybridoma 2.4G2 | ATCC | HB-197 | |
| płytka Costar z dnem w kształcie litery V | Corning | 3894 | |
| wirówka Allegra X-22R lub równoważna | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| koszyk i rotor do płytek 96-dołkowych | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| rotor z kątem stałym | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | klon: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | klon: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | klon: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | klon: BM8 |
Bibliografia
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
