Izolacja leukocytów naciekających mózg

Podsumowanie

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Streszczenie

Opisujemy metodę przygotowania leukocytów naciekających mózg (BILs) u myszy. Demonstrujemy, jak zinfekować myszy wirusem encephalomyelitis mysiej Theilera (TMEV) za pomocą techniki szybkiego wstrzyknięcia doczaszkowego oraz jak oczyścić populację komórek naciekających wzbogaconą w leukocyty z całego mózgu. W skrócie, myszy są znieczulane izofluranem w zamkniętej komorze, a następnie wykonuje się wolnoręczne wstrzyknięcie do kory czołowej za pomocą strzykawki Hamiltona. Myszy są następnie uśmiercane w różnych odstępach czasu po infekcji poprzez przedawkowanie izofluranu, a całe mózgi są pobierane i homogenizowane w medium RPMI przy użyciu homogenizatora tkankowego Tenbroeck. Homogenaty mózgowe są wirowane przez ciągły gradient 30% Percoll w celu usunięcia mieliny i innych odłamków komórkowych. Zawiesina komórkowa jest następnie filtrowana przez sito 40 μm, płukana i wirowana na nieciągłym gradiencie Ficoll-Paque Plus w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia leukocytów. Następnie leukocyty są płukane i resuspenderowane w odpowiednich buforach do immunofenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa wykazuje obecność populacji wrodzonych komórek odpornościowych we wczesnych stadiach infekcji u myszy C57BL/6. 24 godziny po infekcji w BILs obecnych jest wiele podzbiorów komórek odpornościowych, z wzbogaconą populacją komórek Gr1⁺, CD11b⁺ i F4/80⁺. Zatem metoda ta jest użyteczna w charakteryzacji odpowiedzi odpornościowej na ostrą infekcję w mózgu.

Protokół

1. Wewnątrzczaszkowa injekcja wirusa:

Poniższa technika została zmodyfikowana i szeroko wykorzystywana przez nasze laboratorium oraz współpracowników. W skrócie, u młodych myszy (preferencyjnie w wieku 5-6 tygodni) przeprowadza się wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie wirusa zapalenia mózgu i rdzenia myszy (TMEV) szczepu Daniel's lub infekcję pozorowaną (1, 10), aby wywołać naciek leukocytów do mózgu (BILs). Należy zauważyć, że wyniki będą się różnić w zależności od zastosowania szczepu Daniel's, szczepu BeAN oraz szczepu GDVII. W celu pozyskania BILs myszy otrzymują 2x10⁵ PFU TMEV i są infekowane przez 24 godziny.

1. Przymocuj igłę do wstrzykiwania (27 gauge, ¼ in, Kendall) do automatycznej strzykawki Hamiltona o pojemności 1 ml i ustaw ją na podanie 10 μl wirusa.
2. Naciągnij TMEV w 10 μL DMEM do strzykawki, zwracając szczególną uwagę na pęcherzyki powietrza. W odpowiednich przypadkach myszy w grupie pozorowanej otrzymują 10 μl DMEM bez wirusa.
3. Tuż przed wstrzyknięciem wlej około 1 mL izofluranu do klosza zawierającego drucianą kratkę z podłożem z bawełny.
4. Umieść myszy bezpośrednio na drucianej kratce w kloszu, aż zostaną lekko znieczulone, staną się niewrażliwe na uciśnięcie palca i zostaną unieruchomione przez anestetyk wziewny, co trwa około 10-15 sekund. Myszy nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z izofluranem, ponieważ substancja ta może działać drażniąco i żrąco.
5. Podczas znieczulenia przygotuj myszy do wstrzyknięcia, szybko lokalizując odpowiednie współrzędne w regionie kory przedczołowej na czaszce za pomocą golenia i znakowania tuszem. Ogólna lokalizacja wstrzyknięcia znajduje się 1 mm przed bregma i 1 mm bocznie od szwu strzałkowego po prawej stronie (Rysunek 1). Chociaż wstrzykiwanie stereotaktyczne może być odpowiednie w niektórych sytuacjach eksperymentalnych, ustaliliśmy, że wstrzykiwanie ręczne bez golenia lub znakowania jest odpowiednie dla większości eksperymentów. Do wstrzyknięcia wystarczające jest rozdzielenie futra końcem igły wzdłuż obu osi.
6. Aby wykonać wstrzyknięcie, skieruj igłę prostopadle do czaszki i przebij kość do głębokości około 3 mm.
7. Wprowadź wirusa do mózgu, naciskając przycisk strzykawki Hamiltona i odczekując 2 sekundy przed wycofaniem igły, aby wirus mógł przeniknąć do mózgu.
8. Ostrożnie wyjmij igłę i umieść mysz w czystej, suchej klatce. Myszy szybko budzą się z znieczulenia i w ciągu kilku minut wracają do normalnego funkcjonowania. Zwróć szczególną uwagę na myszy wykazujące nieprawidłowe objawy, takie jak nadmierne krwawienie z miejsca wstrzyknięcia, w których przypadku może być konieczna eutanazja zwierzęcia. Należy przestrzegać zasad prawidłowego obchodzenia się ze zwierzętami ⁶ oraz wytycznych National Institutes of Health i Institutional Animal Care and Use Committee.

2. Przygotowanie leukocytów naciekających mózg:

1. Przygotować okrągłodennych probówki wirówkowe Oak Ridge o pojemności 30 ml, wypełniając je 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll oraz 1 ml 10X PBS; probówki powinny stać w temperaturze pokojowej (RT) na blacie podczas procesu usuwania mózgu.
2. Doprowadzić Ficoll-Paque Plus do temperatury pokojowej (RT).
3. Uśmiercić zwierzę poprzez zmodyfikowaną przedawkowną dawkę izofluranu ⁵, następnie szybko usunąć mózg za pomocą stalowej szpatułki do tkanek i umieścić go w probówce stożkowej 15 ml zawierającej 5 ml RPMI na lodzie. W niektórych przypadkach może być wskazana perfuzja PBS w celu usunięcia krążących obwodowych komórek krwi z preparatu BILs. Myszy powinny być w pełni i prawidłowo znieczulone przed perfuzją PBS.
4. Przenieść mózg i roztwór RPMI do szklanego homogenizatora do tkanek Tenbroeck marki Pyrex o pojemności 7 ml i delikatnie zhomogenizować, wykonując 10-15 ruchów.
5. Dodać pipetą kolejne 5 ml RPMI do homogenizatora i dwukrotnie pipetować w górę i w dół. Przenieść homogenizat mózgu (ok. 10 ml) do wcześniej przygotowanej okrągłodennej probówki i delikatnie odwrócić 2-3 razy w celu wymieszania.
6. Wirować homogenizat mózgu przy 7800g_ave przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) w rotorze stałokątnym F0360 w wirówce klinicznej Beckman Allegra X-22R.
7. Po wirowaniu usunąć resztki mieliny, które wypłynęły na górę gradientu. Zebrać warstwę leukocytów unoszącą się nad osadem erytrocytów (Rysunek 2).
8. Przefiltrować warstwę leukocytów przez sito komórkowe 40 μm do probówki stożkowej 50 ml. Uzupełnić objętość roztworu do 50 ml za pomocą RPMI.
9. Wirować probówki zawierające rozcieńczoną zawiesinę komórkową w wirówce klinicznej przy 1500 rpm (600g_ave) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
10. Odssać nadsącz i zebrać osad komórkowy. Resuspendować osad w 1 ml buforu FACS (1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,02% azotku sodu w PBS bez wapnia i magnezu) i przenieść zawiesinę komórkową do okrągłodennych probówek FACS 5 ml.
11. Ostrożnie podłożyć pod zawiesinę 1 ml Ficoll-Paque Plus.
12. Wirować probówkę przy 2500 rpm (1400 gave) w wirówce klinicznej przez 25 min w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania.
13. Usunąć białą, puszystą warstwę na granicy faz (Rysunek 2) za pomocą pipety 1 ml i przenieść do nowej probówki FACS 5 ml. Przemyć komórki 4 ml buforu FACS.
14. Wirować probówkę przy 1500 rpm (600g_ave) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT) w wirówce klinicznej, aby wytrącić komórki w osad.
15. Odssać nadsącz i zebrać osad komórkowy. Resuspendować osad leukocytów w odpowiednim buforze i przechowywać na lodzie w nowej probówce FACS.
16. Policzyć komórki, ocenić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Generalnie badacze mogą spodziewać się uzyskania około 5 x 10⁵ komórek/zwierzę.

3. Immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej

1. Po wyizolowaniu i policzeniu leukocytów, wirować komórki przez 3 minuty przy 1500 rpm (600 _gave) w wirówce klinicznej.
2. Resuspendować osad w buforze blokującym zawierającym: bufor FACS, nadsącz z hybridomy 2.4G2 (blokada Fc; anty-CD16/32) oraz płodową surowicę bydlęcą w stosunku 10:5:1 i inkubować przez 30 minut w 4°C.
3. Przygotować i dodać przeciwciała koniugowane przeciwko antygenom zewnątrzkomórkowym do zblokowanych komórek w stężeniu 1:200 i inkubować przez 30 minut w 4°C w ciemności. Barwić i inkubować komórki w objętości 200 μl w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Odpowiednie kontrole obejmują niebarwione komórki oraz próbki do kompensacji fluorochromów, w zależności od potrzeb.
4. Wirować zabarwione komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 1500 rpm (600_gave) w wirówce klinicznej, używając rotora odpowiedniego dla płytek 96-dołkowych.
5. Odssać nadsącz i przemyć komórki 200 μl buforu FACS, delikatnie pipetując w górę i w dół 3 razy.
6. Powtórzyć powyższą technikę przemywania dwukrotnie.
7. Po przemyciu resuspendować komórki w 2% paraformaldehydzie i przenieść do probówek FACS. Fixacja jest wymagana do analizy cytometrycznej komórek zakażonych odczynnikami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (Biosafety Level 2).
8. Uruchomić analizę ufiksowanych komórek na BD FACS Calibur zgodnie z zmodyfikowaną metodą cytometrii przepływowej ⁸ i analizować pliki offline przy użyciu FlowJo, WinMDI lub innego dostępnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
9. Do odpowiedniego immunofenotypowania zazwyczaj wymagana jest analiza 50-100 000 zdarzeń na próbkę.

Przeciwciała bezpośrednio koniugowane użyte w tym eksperymencie:

CD45 wykryto za pomocą klonu 30-F11. Ly6C/G wykryto za pomocą klonów Gr1 i RB6-8C5. CD11b wykryto za pomocą klonu M1/70. F4/80 wykryto za pomocą klonu BM8.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiamy wyniki fenotypowania komórek z BIL myszy 24 godziny po zakażeniu (Rysunek 3). Leukocyty barwiono przeciwciałem anty-mysim CD45 sprzężonym z PerCP w celu wykrycia komórek odpornościowych, przeciwciałem anty-mysim Ly6C/G sprzężonym z PE w celu wykrycia monocytów zapalnych oraz przeciwciałami anty-mysimi CD11b sprzężonym z APC i F4/80 sprzężonym z APC w celu wykrycia komórek linii monocytarnej. Analizę przeprowadzono przy użyciu urządzenia BD FACS Calibur.

Rycina 1. Lokalizacja anatomiczna miejsca iniekcji. Miejsce iniekcji znajduje się 1 mm przed Bregma i 1 mm bocznie od szwu strzałkowego po prawej stronie.

Rycina 2. Ilustracja separacji gradientowej leukocytów i BIL.** Leukocyty są początkowo zbierane bezpośrednio poniżej warstwy szczątków mieliny i powyżej osadu RBC w gradiencie Percoll. Biała, puszysta warstwa (BIL) na granicy faz jest zbierana z gradientu Ficoll.

Rycina 3. Immunofenotyp leukocytów infiltrujących mózg 24 h po infekcji. Leukocyty mysie wyizolowano z mózgu poprzez centryfugację gradientową homogenatów tkanek przygotowanych od zwierząt 24 h po infekcji wewnątrzczaszkowej. Komórki barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami przeciwko mysim CD45, Ly6C/G, CD11b i F4/80. Wstępne bramkowanie wykonano poprzez zestawienie CD45, markera komórek odpornościowych, z rozproszeniem przednim (FSC), będącym wskaźnikiem wielkości komórek (C). Następnie populacje CD45^hi (A, D), CD45^lo (B, E) i CD45^neg (F, G) analizowano pod kątem względnych poziomów ekspresji markerów monocytów i makrofagów: Ly6C/G, F4/80 (A, B, F) oraz CD11b (D, E, G). Zapalne monocyty Ly6C/G⁺F4/80⁺CD11b⁺ stwierdzono niemal wyłącznie w populacji CD45^hi (A, D), co jest zgodne z infiltracją tych komórek z obwodu. W przeciwieństwie do tego, makrofagi Ly6C/G-F4/80^loCD11b⁺ stwierdzono niemal wyłącznie w populacjach CD45^lo (B, E) i CD45^neg (G), co odpowiada fenotypowi rezydentnemu. W licznych eksperymentach nigdy nie zaobserwowano komórek CD45^hi ani zapalnych monocytów Ly6C/G⁺F4/80⁺CD11b⁺ w mózgach myszy niezakażonych lub poddanych infekcji pozorowanej (dane nie przedstawiono).

Dyskusja

Rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową w celu określenia zarówno jakości preparatu komórek naciekających mózg, jak i rozróżnienia różnych populacji komórek odpornościowych ^{2, 9}. W ostrych punktach czasowych nasza metoda BILs pozwala na uzyskanie wysokich odsetków monocytów zapalnych w populacji CD45hi, a także wysokich odsetków makrofagów w populacji CD45lo. Wskazuje to, że powtarzalna odpowiedź immunologiczna w obrębie mózgu może być w sposób wiarygodny charakteryzowana za pomocą naszej metody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TMEV	Howe Lab	N/A
szczep Daniel’a	Invitrogen	21063-029
izofluran	Novaplus	NDC 0409-3292-49
probówki wirówkowe Oak Ridge z okrągłym dnem	Nalge Nunc international	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
10X PBS	Roche Group	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
błękit trypanu 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
probówki stożkowe 15 ml	BD Biosciences	352097
szklany homogenizator tkanek Tenbr–ck marki Pyrex 7 mL	Fisher Scientific	08-414-10B
sito do komórek 40 μm	BD Biosciences	352340
probówki stożkowe 50 mL	BD Biosciences	352070
albumina surowicy wołowej	Sigma-Aldrich	A9647
azotek sodu	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
probówki do FACS	BD Biosciences	352054
płodowa surowica wołowa	Sigma-Aldrich	F4135
hybridoma 2.4G2	ATCC	HB-197
płytka Costar z dnem w kształcie litery V	Corning	3894
wirówka Allegra X-22R lub równoważna	Beckman Coulter Inc.	N/A
koszyk i rotor do płytek 96-dołkowych	Beckman Coulter Inc.	S2096
rotor z kątem stałym	Beckman Coulter Inc.	F0360
paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD Biosciences	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD Biosciences	557235	klon: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD Biosciences	553128	klon: RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	klon: M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	klon: BM8