Prosta i skuteczna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby

Summary

Opisano nowatorską metodę pozyskiwania makrofagów z pierwotnej hodowli komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje namnażanie makrofagów w kulturze, a następnie wstrząsanie kolbami hodowlanymi i oczyszczanie poprzez selektywne dołączanie do plastikowych naczyń. Ta technika skutecznie dostarcza makrofagi wątrobowe bez skomplikowanego sprzętu i umiejętności.

Abstract

Komórki Kupffera są specyficznymi dla wątroby makrofagami rezydującymi i odgrywają ważną rolę w fizjologicznych i patologicznych funkcjach wątroby^1-3. Chociaż metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane^4-6, większość z tych metod wymaga wyrafinowanego sprzętu, takiego jak elutriator odśrodkowy i umiejętności techniczne. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę uzyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych pierwotnych kultur dorosłych komórek wątroby szczura, jak schematycznie zilustrowano na rysunku 1.

Po dysocjacji komórek wątroby za pomocą dwuetapowej metody perfuzji^7,8, przygotowuje się frakcję składającą się głównie z hepatocytów miąższowych i wysiewa się ją do kolb do hodowli tkankowych T75 z pożywką składającą się z DMEM i 10% FCS. Hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonka w ciągu kilku dni w hodowli, degenerują się lub przekształcają w komórki podobne do fibroblastów (ryc. 2). W miarę postępu hodowli, około 6 dnia, fazowe, jasne, okrągłe komórki podobne do makrofagów zaczynają się namnażać na arkuszu komórek fibroblastycznych (ryc. 2). Wzrost komórek podobnych do makrofagów trwa i osiąga maksymalny poziom około 12 dnia, pokrywając arkusz komórek na powierzchni kolby. Poprzez wytrząsanie kolb hodowlanych, makrofagi są łatwo zawieszane w pożywce hodowlanej. Późniejszy transfer i krótka inkubacja w plastikowych naczyniach powodują selektywną adhezję makrofagów (ryc. 3), gdzie podobnie jak inne zanieczyszczające komórki pozostają zawieszone. Po kilku płukaniach PBS zbiera się dołączone makrofagi. Więcej niż 10⁶ komórek można wielokrotnie pobierać z tej samej kolby do hodowli tkankowej T75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie (ryc. 3). Czystość izolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 99%, co oceniano za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z przeciwciałami specyficznymi dla makrofagów szczurów (ryc. 4). Izolowane komórki wykazują aktywną fagocytozę kulek polistylenowych (ryc. 5), odpowiedź proliferacyjną na rekombinowany GM-CSF, wydzielanie cytokin zapalnych / przeciwzapalnych po stymulacji LPS i tworzenie wielojądrowych komórek olbrzymich⁹.

Podsumowując, oferujemy prostą i efektywną metodę uzyskania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości bez skomplikowanego sprzętu i umiejętności. Metoda ta może mieć zastosowanie do innych gatunków ssaków.

Protocol

1. Perfuzja wątroby

1. Znieczulić dorosłego samca szczura Sprague-Dawley (w wieku od 10 do 15 tygodni; masa ciała 150-200 g) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu pentobarbitalu sodu (50 mg pentobarbitalu sodu / kg masy ciała).
2. Umieść zwierzę na patelni ze stali nierdzewnej i spryskaj jego brzuch i klatkę piersiową 70% etanolem.
3. Zrób małe nacięcie i oderwij skórę. Otwórz brzuch przez nacięcie nożyczkami.
4. Potwierdź położenie żyły wrotnej, przełóż nić chirurgiczną pod żyłą wrotną i luźno zbij.
5. Zgrupuj dystalną część żyły głównej dolnej i żyły krezkowej, aby zapobiec refluksowi krwi do wątroby. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę nożyczkami i odsłoń serce.
6. Wprowadzić plastikowy cewnik (o średnicy 2 mm) do żyły wrotnej i mocno dokręcić gwint wokół cewnika.
7. Podłączyć cewnik do systemu perfuzyjnego, który jest wypełniony roztworem płuczącym (Ca²⁺-Mg^{2 +} wolny HBSS zawierający 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO3; pH 7,2) wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C.
8. Rozpocząć perfuzję in situ z szybkością 10 ml/min. W tym samym czasie wykonaj nacięcie w prawej ścianie atrium. Kontynuuj perfuzję przez 10 minut.
9. Zamień roztwór perfuzyjny na roztwór kolagenazy [HBSS zawierający 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO₃ uzupełniony kolagenazą typu I (0,05%) i inhibitorem trypsyny (50 μg/ml); pH 7,5] i uzyskuj perfuzję przez 10 - 20 minut z szybkością 10 ml / min, aż wątroba lekko puchnie i wykazuje oznaki rozpadu struktury wątroby pod błoną surowiczą.

2. Przygotowanie frakcji komórek bogatych w hepatocyty miąższowe

1. Wyjąć wątrobę i ostrożnie przenieść ją do sterylnej zlewki zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy. Zmiel na małe kawałki nożyczkami.
2. Dodać 75 ml zimnego MEM do otrzymanej zawiesiny komórek. Po delikatnym pipetowaniu przesączyć przez sitko komórkowe (100 μm) w celu usunięcia tkanki łącznej i niestrawionych fragmentów tkanek.
3. Przenieść filtrat do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 50 x g przez 1 minutę w temperaturze 4°C (hamulec wyłączony).
4. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą zimnego MEM.
5. Powtórz 2.4) trzy razy.

3. Mieszana pierwotna hodowla komórek wątroby

1. Zawiesić komórki otrzymane w ppkt 2.5) w pożywce wzrostowej złożonej z DMEM zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FCS, uzupełnionego 100 μM β-merkaptoetanolem, 10 μg/ml insuliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny, a następnie wysiać nasiona do pięciu do dziesięciu kolb do kultur tkankowych (powierzchnia: 75 cm²) o gęstości 6,7 x 10⁴ komórki / cm² (5 x 10⁶ komórek / kolba / 12 -15 ml średni).
2. Inkubować kolby hodowlane w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO 2-95% powietrza.
3. Wymieniaj pożywkę co 2 do 3 dni w odstępach.

4. Selektywna izolacja makrofagów

1. Po 12 dniach hodowli makrofagi namnażają się na arkuszu komórkowym. Komórki te są zawieszane przez wzajemne wytrząsanie kolb hodowlanych z prędkością 80-120 uderzeń na minutę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
2. Przenieść pożywkę hodowlaną do 100 mm plastikowych naczyń bez posiewów tkankowych. Zebrać pożywkę z dwóch kolb T75 w jednym plastikowym naczyniu. Napełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i włóż je z powrotem do inkubatora.
3. Inkubować plastikowe naczynia przez 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO 2-95% powietrza. Makrofagi łatwo przyczepiają się do plastikowych naczyń nieprzeznaczonych do hodowli tkankowych w tym procesie inkubacji, podczas gdy inne komórki zanieczyszczające tego nie robią.
4. Zassać pożywkę i delikatnie opłukać plastikowe naczynie PBS. Powtórz ten krok trzy razy.
5. Dodać 1 ml roztworu TrypLE Express do naczynia i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_2-95% powietrza.
6. Dodać 9 ml pożywki wzrostowej. Delikatnie zeskrob przyczepione makrofagi za pomocą skrobaka do komórek.
7. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 180 x g przez 5 minut w temperaturze 25°C (hamulec włączony).
8. Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml pożywki wzrostowej. Dysocjuj na pojedyncze komórki przez energiczne pipetowanie. Wylicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
9. Etapy izolacji można powtarzać z tymi samymi kolbami hodowlanymi w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie.
10. Wyizolowane makrofagi mogą być hodowane w pożywce wzrostowej opisanej w ppkt 3.1.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład mieszanej pierwotnej hodowli komórek wątroby dorosłego szczura jest pokazany na rysunku 2. Hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonka w ciągu kilku dni w hodowli, degenerują się lub przekształcają w komórki podobne do fibroblastów. Następnie, około 6 do 12 dnia, okrągłe komórki podobne do makrofagów o jasnym kontraście dynamicznie namnażają się na arkuszu komórek fibroblastycznych. Poprzez wytrząsanie kolb hodowlanych, makrofagi są łatwo zawieszane w pożywce hodowlanej, a następnie przenoszenie i inkubacja w plastikowych naczyniach powodują selektywną adhezję makrofagów (ryc. 3). Komórki podobne do makrofagów można zebrać już w 8 dniu, a ich liczba osiągnęła maksymalny poziom w dniach od 12 do 14. Z kolby hodowlanej T75 można wielokrotnie pobierać więcej niż 10⁶ komórek w odstępach od 2 do 3 dni przez ponad dwa tygodnie, co pozwala na uzyskanie całkowitej wydajności komórek z kolby wynoszącej 10-7 na kolbę hodowlaną T75 (ryc. 3). Czystość izolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 99%, co oceniano za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z przeciwciałami specyficznymi dla makrofagów szczurów, takimi jak ED-1 (ryc. 4), ED-3, OX-41 (ryc. 4) i Iba1⁹. Izolowane komórki wykazują typowe cechy makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza kulek polistylenowych (ryc. 5), odpowiedź proliferacyjna na rekombinowany GM-CSF, wydzielanie cytokin zapalnych / przeciwzapalnych po stymulacji LPS oraz tworzenie wielojądrowych komórek olbrzymich⁹.

Rysunek 1. Schemat selektywnej izolacji i oczyszczania komórek podobnych do makrofagów z mieszanej pierwotnej hodowli komórek wątroby szczura.

Rysunek 2. Pierwotna hodowla komórek wątroby szczura i proliferacja komórek podobnych do makrofagów. Strzałka wskazuje wielojądrową gigantyczną komórkę. Podziałka = 100 μm. Przedruk z Journal of Immunological Methods, Vol.360, 47-55 (2010) ⁹ za zgodą Elsevier.

Rysunek 3. Selektywna izolacja komórek podobnych do makrofagów metodą wytrząsania i przyłączania. Komórki zawieszono w pożywce hodowlanej poprzez wytrząsanie kolb, a następnie przeniesiono do plastikowych szalek nieprzeznaczonych do hodowli tkankowych i inkubowano w temperaturze 37 °C. Już po 10 minutach od posiewu komórki podobne do makrofagów przyczepiały się do powierzchni szalki, podczas gdy inne zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostawały zawieszone. Po przepłukaniu PBS uzyskano wysoce oczyszczoną populację makrofagów. Komórki te uzyskały typową morfologię makrofagów po 40 minutach hodowli, a komórki mitotyczne były często obserwowane (strzałki). Pokazane są późniejsze zmiany w liczbie komórek odzyskanych z kolb w różnych okresach hodowli. Wartości są średnią±SD od trzech do pięciu kolb. Eksperymenty powtórzono trzykrotnie, a dane są oznaczone różnymi symbolami. Podziałka =100 μm. Przedruk z Journal of Immunological Methods, Vol.360, 47-55 (2010)⁹ za zgodą Elsevier.

Rysunek 4. Barwienie immunocytochemiczne komórek makrofagopodobnych przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko makrofagom szczurów.

Rysunek 5. Fagocytoza mikrogranulek znakowanych FITC przez komórki podobne do makrofagów.

Discussion

Tutaj przedstawiamy prostą i skuteczną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych pierwotnych kultur dorosłych komórek wątroby szczura. Nasza metoda opiera się najpierw na nowej aktywności proliferacyjnej makrofagów w mieszanej kulturze komórek wątroby szczura, a następnie na izolacji i oczyszczaniu tych komórek na podstawie ich cech biologicznych jako makrofagów⁹. Możliwe, że makrofagi namnażające się w mieszanej pierwotnej hodowli dorosłych komórek wątroby mogły pochodzić z Kupffera lub komórek pokrewnych, które zanieczyściły frakcję hepatocytów miąższowych. Makrofagi mogły reagować na określone zmiany środowiskowe spowodowane transformacją hepatocytów miąższowych¹⁰ i innych komórek fibroblastycznych w mieszanych kulturach pierwotnych.

Podsumowując, nasza metoda zapewnia izolację komórek podobnych do makrofagów w wystarczającej liczbie i czystości z pierwotnej hodowli komórek wątroby szczura bez użycia wyrafinowanego sprzętu i umiejętności technicznych. Ponadto procedurę izolacji można powtarzać z tą samą kolbą hodowlaną przez ponad dwa tygodnie. Metoda ta może mieć zastosowanie do innych gatunków ssaków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór pentobarbitalu sodu	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl do wstrzykiwań
Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Invitrogen	14185-052
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
Kolagenaza	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	032-10534	Stopień dysocjacji komórek (wymagana kontrola partii)
Inhibitor trypsyny	Sigma-Aldrich	T-9128
Eagle' s minimum essential medium (MEM)	Sigma-Aldrich	M-4655
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D-6459
Płodowa surowica cielęca o wysokiej zawartości glukozy (FCS)	Hyklon	SH30070.03	Inaktywowany termicznie w temperaturze 56° C za 30 min. (Wymagana kontrola partii)
TrypLE Express	Invitrogen	12605
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Invitrogen	14190	Ca2+-Mg2+ free
β-mercapt– tanol	Sigma-Aldrich	M-7522	Zapas: 100 mM w wodzie destylowanej
Insulina	Sigma-Aldrich	I-5500	Zapas: 10 mg / ml w 0,1N HCl
Penicylina / streptomycyna	Invitrogen	15070
Sitko do komórek	BD Biosciences	352360	Rozmiar oczek: 100 μ m
Kolba do hodowli tkankowych	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-21250	Powierzchnia: 75 cm2
naczynia bez hodowli tkankowych	BD Biosciences	351005
Skrobak do komórek	Corning	3010
Wytrząsarka posuwisto-zwrotna	TAITEC	NR-1