Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.
Artykuł metodologiczny
Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki Kupffera są rezydentnymi makrofagami specyficznymi dla wątroby i odgrywają istotną rolę w funkcjach fizjologicznych i patologicznych tego organu1-3. Chociaż metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane4-6, większość z nich wymaga zaawansowanego sprzętu, takiego jak elutriator wirówkowy, oraz specjalistycznych umiejętności technicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodę uzyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych pierwotnych kultur komórek wątroby dorosłego szczura, co zostanie schematycznie przedstawione na Rysunku 1.
Po dysocjacji komórek wątroby metodą dwuetapowej perfuzji7,8, przygotowuje się frakcję składającą się głównie z hepatocytów miąższowych, które wysiewa się do kolbek hodowlanych T75 z pożywką składającą się z DMEM i 10% FCS. Hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonkowych w ciągu kilku dni hodowli, degenerują się lub przekształcają w komórki fibroblastopodobne (Rycina 2). W miarę trwania hodowli, około 6. dnia, na warstwie komórek fibroblastycznych zaczynają namnażać się jasne w kontraście fazowym, okrągłe komórki makrofagopodobne (Rycina 2). Wzrost komórek makrofagopodobnych trwa nadal i osiąga maksymalny poziom około 12. dnia, pokrywając warstwę komórek na powierzchni kolby. Poprzez wstrząsanie kolb hodowlanych makrofagi łatwo przechodzą w zawiesinę w pożywce hodowlanej. Następujący po tym transfer i krótka inkubacja w naczyniach plastikowych prowadzą do selektywnej adhezji makrofagów (Rycina 3), podczas gdy pozostałe komórki zanieczyszczające pozostają w zawiesinie. Po kilkukrotnym przemyciu PBS-em zbiera się przytwierdzone makrofagi. Ponad 106 komórek można zebrać wielokrotnie z tej samej kolby hodowlanej T75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie (Rycina 3). Czystość wyizolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 99%, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z zastosowaniem przeciwciał specyficznych dla makrofagów szczura (Rycina 4). Wyizolowane komórki wykazują aktywną fagocytozę kulek polistyrenowych (Rycina 5), odpowiedź proliferacyjną na rekombinowany GM-CSF, wydzielanie cytokin zapalnych/przecwzapalnych po stymulacji LPS oraz tworzenie wielojądrowych komórek olbrzymich9.
Podsumowując, przedstawiamy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości, bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności. Metoda ta może znaleźć zastosowanie u innych gatunków ssaków.
Protokół
1. Perfuzja wątroby
- Zpodaj dorosłemu samcowi szczura linii Sprague-Dawley (w wieku od 10 do 15 tygodni; masa ciała 150–20 g) znieczulenie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie roztworu pentobarbalku sodu (50 mg pentobarbitalu sodu / kg masy ciała).
- Umieść zwierzę w stalowej kuwecie i spryskaj jego brzuch oraz klatkę piersiową 70% etanolem.
- Należy wykonać niewielkie nacięcie i odsunąć skórę. Następnie, za pomocą nożyczek, należy rozciąć jamę brzuszną wzdłuż wykonanego nacięcia.
- Potwierdź położenie żyły wrotnej, przełóż nitkę chirurgiczną pod żyłę wrotną i zawiąż ją luźnym węzłem.
- Zaciśnij dystalną część żyły głównej dolnej oraz żyły krezkowej, aby zapobiec cofaniu się krwi do wątroby. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając przeponę nożyczkami, i odsłoń serce.
- Wprowadź plastikowy cewnik (o średnicy 2 mm) do żyły wrotnej i mocno zaciśnij nić wokół cewnika.
- Podłącz cewnik do systemu perfuzyjnego wypełnionego roztworem płuczącym (Ca2+-Mg2+wolny od wapnia i magnezu HBSS zawierający 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO33 ; pH 7,2) uprzednio ogrzany do 37 °C.
- Rozpocząć perfuzję in situ z szybkością 10 ml/min. Jednocześnie należy naciąć ścianę prawego przedsionka. Perfuzję kontynuować przez 10 min.
- Zmień roztwór perfuzyjny na roztwór kolagenazy [HBSS zawierający 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO3]3 uzupełnione kolagenazą typu I (0,05%) i inhibitorem trypsyny (50 μg/ml); pH 7,5], a następnie perfundować przez 10–20 min z przepływem 10 ml/min, aż wątroba lekko opuchnie i pojawi się oznaka rozpadu struktury wątroby pod błoną surowiczą.
2. Przygotowanie frakcji komórkowej wzbogaconej w hepatocyty parenchymalne
- Wyjąć i ostrożnie przenieść wątrobę do sterylnego zlewki zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy. Rozdrobić na małe kawałki za pomocą nożyczek.
- Do otrzymanej zawiesiny komórkowej dodać 75 ml zimnego MEM. Po delikatnym pipetowaniu przefiltrować przez sitko komórkowe (10 μm), aby usunąć tkanki łączną oraz niestrawione fragmenty tkanek.
- Przenieść filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i odwirować przy 50 x g przez 1 min w temperaturze 4°C (bez hamowania).
- Ostrożnie odlać supernatant. Resuspender osad w zimnym MEM.
- Powtórzyć kroki 2.4) trzykrotnie.
3. Mieszana pierwotna hodowla komórek wątroby
- Komórki uzyskane w punkcie 2.5) zawiesić w pożywce wzrostowej DMEM zawierającej 10% inaktywowanej ciepłem FCS, uzupełnionej o 10 μM β-merkaptoetanolu, 10 μg/ml insuliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 U/ml penicyliny, a następnie zasiać do od pięciu do dziesięciu flasks do hodowli tkanek (powierzchnia: 75 cm2) z gęstością 6.7 x 104 komórek / cm2 (5 x 106 komórek / flask / 12-15 ml pożywki).
- Inkubować flasks z hodowlą w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza.
- Wymieniać pożywkę wzrostową co 2 do 3 dni.
4. Selektywna izolacja makrofagów
- Po 12 dniach hodowli makrofagi proliferują na arkuszu komórkowym. Komórki te są zawieszane poprzez wzajemne potrząsanie kolb kultur z częstotliwością 80 - 120 ruchów na minutę przez 30 min w temperaturze 37 °C.
- Przenieś pożywkę hodowlaną do plastikowych naczyń o średnicy 10 mm, które nie są przeznaczone do hodowli tkanek. Połącz pożywkę z dwóch kolb T75 w jednym naczyniu plastikowym. Uzupełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i zwróć je do inkubatora.
- Inkubuj naczynia plastikowe przez 30 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza. Podczas tego procesu inkubacji makrofagi łatwo przywierają do naczyń plastikowych nieprzeznaczonych do hodowli tkanek, podczas gdy inne zanieczyszczające komórki tego nie robią.
- Odsuń pożywkę i delikatnie wypłucz naczynie plastikowe za pomocą PBS. Powtórz ten krok trzykrotnie.
- Dodaj 1 ml roztworu TrypLE Express do naczynia i inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza.
- Dodaj 9 ml pożywki wzrostowej. Delikatnie zeskrob przywierające makrofagi za pomocą skrobaka do komórek.
- Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 180 x g przez 5 min w temperaturze 25°C (z włączonym hamulcem).
- Odlej supernatant i dodaj 1 ml pożywki wzrostowej. Rozdziel komórki na pojedyncze poprzez energiczne pipetowanie. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Kroki izolacji można powtarzać z tymi samymi kolbami hodowlanymi w odstępach dwu- lub trzymilodniowych przez ponad dwa tygodnie.
- Izolowane makrofagi można hodować w pożywce wzrostowej opisanej w punkcie 3.1.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład mieszanej hodowli pierwotnej dorosłych komórek wątroby szczura przedstawiono na rysunku 2. Hepatocyty miąższowe w ciągu kilku dni hodowli tracą morfologię komórek nabłonkowych, degenerują się lub przekształcają w komórki fibroblastopodobne. Następnie, około 6. do 12. dnia, na warstwie komórek fibroblastopodobnych gwałtownie proliferują jasne w kontraście fazowym, okrągłe komórki makrofagopodobne. Poprzez wstrząsanie kolb hodowlanych makrofagi są łatwo zawieszone w medium hodowlanym, a późniejszy przenies i inkubacja w naczyniach plastikowych prowadzą do selektywnej adhezji makrofagów (rysunek 3). Komórki makrofagopodobne można zebrać już w 8. dniu, a ich liczba osiąga poziom maksymalny między 12. a 14. dniem. Ponad 106 komórki mogą być wielokrotnie zbierane z kolby hodowlanej T75 w odstępach od 2 do 3 dni przez ponad dwa tygodnie, co pozwala na uzyskanie całkowitego plonu komórek z jednej kolby na poziomie 107 na kolbę hodowlaną T75 (Rysunek 3). Czystość wyizolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 9%, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla makrofagów szczura, takich jak ED-1 (Rysunek 4), ED-3, OX-41 (Rysunek 4) oraz Iba19Wyizolowane komórki wykazują typowe cechy makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza kulek polistyrenowych (Rysunek 5), odpowiedź proliferacyjna na rekombinowany GM-CSF, sekrecja cytokin zapalnych i przeciwzapalnych po stymulacji LPS oraz tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich.9.
Rycina 1. Schemat selektywnej izolacji i oczyszczania komórek macrophage-like z mieszanej hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura.
Rycina 2. Kultura pierwotna komórek wątroby szczura i proliferacja komórek podobnych do makrofagów. Strzałka wskazuje wielojądrową komórkę olbrzymią. Pasek skali = 100 μmPrzedruk z Journal of Immunological Methods, Vol. 360, 47-5 (2010) 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Rycina 3. Selektywna izolacja komórek przypominających makrofagi metodą wstrząsania i adhezji. Komórki zawieszono w pożywce hodowlanej poprzez wstrząsanie kolb, następnie przeniesiono do plastikowych naczyń nieratedowanych do hodowli tkankowej i inkubowano w 37 °CJuż 10 minut po wysianiu komórki macofagopodobne przytwierdziły się do powierzchni naczynia, podczas gdy pozostałe zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostały w zawiesinie. Po przemyciu roztworem PBS uzyskano wysoce oczyszczoną populację makrofagów. Komórki te nabyły typowej morfologii makrofagów po 40 minutach hodowli, a często obserwowano komórki w fazie mitozy (strzałki). Przedstawiono późniejsze zmiany w liczbie komórek odzyskanych z kolb w różnych okresach hodowli. Wartości stanowią średnią±SD z trzech do pięciu kolb. Eksperymenty powtórzono trzykrotnie, a dane oznaczono różnymi symbolami. Pasek skali =100 μmPrzedrukowano z Journal of Immunological Methods, t. 360, s. 47-5 (2010)9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Rycina 4. Barwienie immunocytochemiczne komórek przypominających makrofagi z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko makrofagom szczura.
Rycina 5. Fagocytoza mikrokulek znakowanych FITC przez komórki macrofagopodobne.
Dyskusja
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłego szczura. Nasza metoda opiera się najpierw na nowej aktywności proliferacyjnej makrofagów w mieszanej kulturze komórek wątroby szczura, a następnie na późniejszej izolacji i oczyszczaniu tych komórek na podstawie ich cech biologicznych właściwych dla makrofagów9. Możliwe jest, że makrofagi proliferujące w mieszanej kulturze pierwotnej komórek wątroby dorosłego osobnika pochodziły z komórek Kupffera lub komórek pokrewnych, które zanieczyściły frakcję hepatocytów miąższowych. Makrofagi mogły zareagować na specyficzne zmiany środowiskowe wywołane transformacją hepatocytów miąższowych10 oraz innych komórek fibroblastycznych w mieszanych kulturach pierwotnych.
Podsumowując, nasza metoda zapewnia izolację komórek macrofagopodobnych w wystarczającej liczbie i czystości z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura bez konieczności użycia zaawansowanego sprzętu i specjalistycznych umiejętności technicznych. Ponadto procedurę izolacji można powtarzać w tej samej kolbie hodowlanej przez ponad dwa tygodnie. Metoda ta może mieć zastosowanie również w przypadku innych gatunków ssaków.
Oświadczenia
Wszystkie zwierzęta były utrzymywane i operowane w zwierzęciu National Institute of Animal Health, zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komisję ds. doświadczeń na zwierzętach danej instytucji.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu badawczego oraz dotacji z Projektu Nanotechnologii Żywności Ministerstwa Rolnictwa, Leśnictwa i Rybołówstwa Japonii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór pentobarbitalu sodu | Kyoritsu Seiyaku | Wstrzykiwanie Somnopentylu | |
| Hank’zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Kollagenaza | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Stopień dysocjacji komórek (Wymagana kontrola partii) |
| Inhibitor trypsyny | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’podłoże minimalne niezbędne (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’modyfikowane pożywka Eagle'a’pożywka (DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | Typ z wysoką zawartością glukozy |
| płytkowa surowica cielęca (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Inaktywowany termicznie w 56°C przez 30 min. (Wymagana kontrola partii) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’bufor fosforanowy (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ wolny |
| β-merkapto–etanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Roztwór stokowy: 100 mM w wodzie destylowanej |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-5500 | Roztwór stokowy: 10 mg/ml w 0,1N HCl |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15070 | |
| Sito do komórek | BD Biosciences | 352360 | Rozmiar oczek: 100 μm |
| Kolba do hodowli tkankowych | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Powierzchnia: 75 cm²2 |
| Plastikowe szalki nieprzystosowane do hodowli tkankowej | BD Biosciences | 351005 | |
| Skrobacz do komórek | Corning | 3010 | |
| Inkubator z wytrząsarką poziomą | TAITEC | NR-1 |
Bibliografia
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell, Liver fibrosis: the hepatocyte revisited. Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).
Przedruki i uprawnienia
