Artykuł metodologiczny

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

80.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2761

⸱

13 lutego 2011

 ,  , 
1Department of Neurology, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco, 2Department of Biological Sciences, Kent State University

W tym artykule

Podsumowanie

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Streszczenie

Udar mózgu jest najczęstszą śmiertelną chorobą neurologiczną w Stanach Zjednoczonych 1. Większość udarów (88%) wynika z zablokowania naczyń krwionośnych w mózgu (udar niedokrwienny) 2. Ponieważ większość udarów niedokrwiennych (~80%) występuje w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA) 3, wiele opracowanych zwierzęcych modeli udaru koncentrowało się na tej tętnicy. Wewnątrznaczyniowy model okluzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO) z użyciem monofilamentu polega na wprowadzeniu chirurgicznego filamentu do tętnicy szyjnej zewnętrznej i przesunięciu go do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), aż jego końcówka zablokuje ujście MCA, co prowadzi do zatrzymania przepływu krwi i następczego zawału mózgu w obszarze MCA 4. Technikę tę można stosować do modelowania okluzji trwałej lub przejściowej 5. Jeśli szew zostanie usunięty po określonym czasie (30 min, 1 h lub 2 h), następuje reperfuzja (przejściowy MCAO); jeśli filament pozostanie na miejscu (24 h), procedura ta służy jako model trwałego MCAO. Technika ta nie wymaga kraniektomii, czyli neurochirurgicznego zabiegu usunięcia części czaszki, co mogłoby wpłynąć na ciśnienie wewnątrzczaszkowe i temperaturę 6. Stała się ona najczęściej stosowaną metodą naśladownia trwałego i przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u szczurów i myszy 7,8. Aby ocenić zakres zawału mózgu, barwimy skrawki mózgu chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC) w celu zidentyfikowania niedokrwionej tkanki mózgowej 9. W tym filmie prezentujemy metodę MCAO oraz określanie wielkości zawału za pomocą barwienia TTC.

Protokół

1. Metoda MCAO

Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committees) na UCSF oraz Kent State University i jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych.

  1. Potnij jednowłóknistą nić chirurgiczną 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) na odcinki o długości 20 mm. Zaokrąglij końcówkę każdego odcinka, podgrzewając ją w pobliżu kauteryzatora (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA). Zmierz średnicę końcówki za pomocą mikrometru (Applied Image Inc., Rochester, NY). Dla myszy o masie ciała 25-30 g stosujemy nić o końcowej średnicy końcówki 0,21-0,22 mm.
  2. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie (minimum 121 °C, 15 PSI przez 15 min). Zdezynfekuj stół operacyjny i powiązany sprzęt za pomocą 70% etanolu.
  3. Zanurz mysz w wieku 8-12 tygodni (25-30 g) w narkozie przy użyciu 5% izofluranu (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) w mieszance 30% O2 / 70% N2O z wykorzystaniem systemu anestezjologicznego V-10 (VetEquip, Inc., Pleasanton, CA). Po indukcji znieczulenia zmniejsz stężenie izofluranu i utrzymuj je na poziomie 1,5%.
  4. Umieść mysz w pozycji grzbietnej na macie grzewczej. Wprowadź sondę rektalną oraz monitoruj i utrzymuj temperaturę ciała w zakresie 36,5-37,5 °C za pomocą homeotermicznego systemu regulacji temperatury TR-200 (Fine Science Tools Inc., Foster City, CA).
  5. Wygol sierść w brzusznej części szyi za pomocą strzyżarki elektrycznej (Braintree Scientific), aby odsłonić skórę. Zdezynfekuj miejsce operacyjne, aplikując trzykrotnie 70% etanol.
  6. Pod stereo-mikroskopem sekcyjnym (Nikon, Japonia) wykonaj 1 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi. Użyj rozwieraczy (Braintree Scientific), aby odsłonić pole operacyjne i zidentyfikować prawą wspólną tętnicę szyjną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) oraz tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Ostrożnie odseparuj tętnice od otaczających je nerwów i powięzi.
  7. Przeprowadź dalszą sekcję ECA w kierunku dystalnym i koaguluj ECA oraz jej odgałęzienie – tętnicę tarczową górną (STA) – za pomocą koagulatora bipolarnego (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Przetnij ECA i STA w miejscu koagulacji.
  8. Luźno zawiąż dwie jedwabne nici 8-0 wokół kikutu ECA. Nałóż zacisk naczyniowy (Fine Science Tools) w miejscu rozwidlenia CCA na ECA i ICA.
  9. Wykonaj małe nacięcie na końcu kikutu ECA za pomocą sprężynowych nożyczek typu Vannas (Fine Science Tools). Zmierz i zanotuj długość jednowłóknistej nici 5-0 z zaokrągloną końcówką. Wprowadź nić do nacięcia i przesuń ją w stronę zacisku. Zaciśnij dwie jedwabne nici wokół światła naczynia na tyle, aby unieruchomić, lecz zachować mobilność wprowadzonej nici jednowłóknistej.
  10. Zdejmij zacisk z rozwidlenia. Ostrożnie przesuń nić jednowłóknistą ze światła ECA do ICA na odległość 9-10 mm poza rozwidlenie CCA, aby zamknąć ujście tętnicy środkowej mózgu (MCA). Czas trwania operacji wynosi około 30-45 min.
  11. Zszyj nacięcie na szyi i umieść mysz w inkubatorze w temperaturze 35 °C w celu wybudzenia z narkozy, a następnie przenieś ją do klatki. Wybudzenie myszy z narkozy trwa zazwyczaj 5-10 min. Aby przeprowadzić przejściowe MCAO, badacz może ponownie znieczulić mysz i wycofać nić z powrotem do kikutu ECA po określonym czasie, zazwyczaj między 0,5 a 2 h.
  12. Dwadzieścia cztery godziny po indukcji MCAO znieczul mysz 5% izofluranem i uśmierć ją poprzez zwichnięcie stawów obręczy szyjnej. Wykonaj gilotynowanie myszy i pobierz mózg. Przetnij mózg w przekrojach koronacyjnych na cztery plastry o grubości 2 mm za pomocą matrycy do mózgu (Braintree Scientific) na lodzie. Inkubuj plastry mózgu w 2% chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC) (Sigma-Aldrich) w 1X PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej, aby określić wielkość i zakres zawału. Utrwal plastry mózgu w 10% neutralnym roztworze formaliny buforowanej (Sigma-Aldrich) w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania. Zakres zawału można określić ilościowo zgodnie z opisem w protokole JoVE 955 (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955) 9.

2. Reprezentatywne wyniki

Zawały wywołane przez MCAO są widoczne w prążkowiu oraz w grzbietowo-bocznej korze. Prążkowie jest bardziej wrażliwe na niedokrwienie niż kora mózgowa. Trzydziestominutowy MCAO spowoduje zawał wyłącznie w prążkowiu, natomiast MCAO trwający ponad godzinę uszkodzi zarówno prążkowie, jak i korę. Po 24 h trwałego MCAO całkowity procent zawału wynosi ~40±5% półkuli, a śmiertelność po operacji to ~10%. Myszy są wykluczane z dalszych badań w przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia podczas operacji, gdy czas operacji przekroczy 90 min, gdy myszy nie wybudzą się z narkozy w ciągu 15 min lub gdy podczas badania pośmiertnego stwierdzono krwotok w skrawkach mózgu lub u podstawy kręgu Willisa.

Schemat progresji niedokrwienia mózgu na czterech poziomach, ilustrujący gradienty uszkodzeń tkanki.
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy przekrojów mózgu barwionych TTC (poziomy koronalne 1-4) po 24 h permanentnego MCAO. W żywej tkance TTC jest enzymatycznie redukowane przez dehydrogenazy do 1,3,5-trifenyloformazanu (TPF), który ma czerwony kolor, natomiast w obszarach nekrotycznych pozostaje biały z powodu braku takiej aktywności enzymatycznej. Zatem obszar zawału można zidentyfikować po białym kolorze wynikającym z braku konwersji TTC do TPF. Uwaga: TTC jest w pewnym stopniu niestabilne pod wpływem ciepła i światła, dlatego należy w miarę możliwości chronić zabarwione preparaty przed ciepłem i światłem.

Dyskusja

Model MCAO u myszy jest powszechnie stosowany do modelowania ogniskowego niedokrwienia mózgu u ludzi. Wykorzystanie myszy w badaniach nad udarem stało się częstsze ze względu na dostępność szczepów transgenicznych i knockout. W protokole należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych szczegółów:

  1. Niezbędne jest utrzymanie temperatury ciała myszy podczas operacji oraz do momentu pełnego wybudzenia z anestezji. Temperatura ciała wpływa na zakres zawału; hipotermia zmniejsza, a hipertermia zwiększa wielkość obszaru zawału.
  2. Podczas odsłaniania i izolowania tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) oraz tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) należy unikać uszkodzenia pobliskiego nerwu błędnego i tchawicy, co mogłoby zwiększyć wielkość zawału i zmniejszyć przeżywalność.
  3. Nigdy nie należy wprowadzać nici monofilamentowej więcej niż 10 mm poza miejsce rozwidlenia. Nić wprowadzona zbyt głęboko może perforować przednią tętnicę mózgową i doprowadzić do krwotoku do mózgu. Opór jest wyczuwalny, gdy nić zostanie przesunięta o około 9-10 mm poza punkt rozwidlenia. W takim przypadku badacz powinien zaprzestać wprowadzania nici i potwierdzić odległość.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych potencjalnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsza praca była finansowana z grantu NIH nr NS057195, nagrody UCSF REAC oraz funduszy startowych Kent State University przyznanych W.H. Chou.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IzofluranOdczynnik chemicznyBaxter Internationl Inc.95045-588
System anestezjologiczny V-10SprzętVetEquip901807
Kontroler temperatury TR-200SprzętFine Science Tools21060
Trymer elektrycznySprzętBraintree Scientific, Inc.CLP-9931
MikroskopysekcyjnySprzętNikon InstrumentsSMZ745T
System retraktorówSprzętBraintree Scientific, Inc.ACD-014
Koagulator bipolarnySprzętHoward Instrument64000
Nici jedwabneMateriałHarvard Apparatus510479
Nici monofilamentoweMateriałHarvard Apparatus723351
Zacisk naczyniowySprzętFine Science Tools00396-01
Nożyczki VannasaSprzętFine Science Tools15000-08
Podkładka pod mózgSprzętBraintree Scientific, Inc.BS-2000C
Chlorek 2,3,5-trifenylo-tetrazoliuOdczynnik chemicznySigma-AldrichT8877
10% neutralny bufor formalinyOdczynnik chemicznySigma-AldrichHT5011

Bibliografia

  1. Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
  2. Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
  3. Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
  4. Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  5. Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
  6. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
  7. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
  9. Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model udaru u myszyudar niedokrwiennymodel z zastosowaniem filamentu wewn trznaczyniowegoprzygotowanie nicizawa m zgubarwienie TTCanaliza przekroj w m zguoperacja t tnicy szyjnej
Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.