Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komary są wektorami wielu patogenów wywołujących choroby, takich jak wirus żółtej febry, pasożyty malarii i nicienie filariozy. Laboratoria badają antypatogenne komponenty wrodzonego układu odpornościowego u gatunków wektorów chorób w nadziei na stworzenie transgenicznych komarów opornych na takie patogeny1, 2. Wrodzony układ odpornościowy komarów składa się z kilku linii obrony 3. Patogeny, którym udaje się pokonać barierę tworzoną przez wyścielone nabłonkiem jelito środkowe komara 4, przedostają się do hemolimfy i napotykają krążące hemocyty – istotne komponenty komórkowe, które otaczają i pochłaniają patogeny 5, 6. Badacze nie znaleźli dowodów na istnienie tkanek krwiotwórczych u komarów, a obecne dane sugerują, że liczba hemocytów jest stała w momencie pojawienia się postaci dorosłej i może wręcz spadać wraz z wiekiem komara 7. Zdolność do prawidłowego pobierania i identyfikacji hemocytów z owadów o znaczeniu medycznym jest kluczowym etapem badań nad odpornością komórkową. Jednak niewielki rozmiar komarów i ograniczona objętość hemolimfy stanowią wyzwanie w procesie pozyskiwania komórek odpornościowych.
Dwie uznane metody pobierania hemocytów komarów obejmują wypychanie hemolimfy z przeciętego proboscis 8 oraz przemieszczanie objętościowe (perfuzję), w której roztwór soli fizjologicznej wstrzykuje się w błoniasty obszar szyjny między głową a klatką piersiową (tj. cervix), a perfundowaną hemolimfę zbiera się z nacięcia w dystalnym regionie odwłoka 9, 10. Techniki te są jednak ograniczone odpowiednio przez niską wydajność odzysku hemocytów oraz możliwe zanieczyszczenie komórkami ciała tłuszczowego 11. W ostatnim czasie metoda określana jako high injection/recovery poprawiła odzysk immunocytów dzięki zastosowaniu buforów przeciwzakrzepowych, przy jednoczesnym zmniejszeniu poziomu zanieczyszczeń w postaci łusek i tkanek wewnętrznych 11. Choć metoda ta pozwala na lepsze pobieranie i utrzymywanie hemocytów do hodowli pierwotnych, wiąże się z szeregiem etapów wstrzykiwania i zbierania, które nie są konieczne, jeśli celem końcowym jest pobranie, utrwalenie i barwienie hemocytów do celów diagnostycznych. W niniejszej pracy prezentujemy naszą metodę pobierania hemolimfy komarów, która łączy prostotę perfuzji, z wykorzystaniem buforów przeciwzakrzepowych zamiast roztworu soli fizjologicznej, z dokładnością technik high injection w celu izolacji czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes.
Protokół
1. Przygotowanie przed pobraniem hemocytów
- Przygotować roztwór rozcieńczający hemolimfę, składający się z 60% pożywki Schneidera, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 30% buforu cytrynianowego (przeciwzakrzepowy; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4.5) 11. Przygotować alikwoty o objętości 1.0 mL, które można przechowywać w temperaturze -20°C. Każdą alikwot należy wykorzystać tylko raz (patrz Materials).
- Przygotować szklane lamie (75 x 25 x 1 mm), nacinając na jednym końcu okrąg o średnicy 1 cm za pomocą narzędzia do trawienia szkła. Alternatywnie można zakupić lamie z dwoma wstępnie wytrawionymi okręgami (np. z oferty Fisher Scientific lub EMS). Niezbędna będzie jedna lamelka na każdego komara.
- Przygotować zestaw szklanych igieł (patrz Materials), wyciągając je zgodnie z następującymi sugerowanymi ustawieniami (Sutter Instruments, Model P-87):
Heat Ramp+5 Pull: 45 Vel: 75 Time: 175 Pressure 580
Stosując sugerowane ustawienia tego wyciągacza, otrzymujemy igły o całkowitej długości około 500 mm z długością trzonia około 3 mm. Można również zakupić igły wstępnie wyciągnięte (np. Tritech Research).
2. Przygotowanie mikroinjektora przed pobraniem hemocytów
- Wprowadzić dociągniętą igłę do uchwytu igły mikroinjektora zgodnie z instrukcjami producenta. Wypełnić wstecznie przewody mikroinjektora (patrz Materiały), strzykawkę oraz dociągniętą szklaną igłę olejem mineralnym zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Przygotowanie samic komarów przed pobraniem hemocytów
- Przenieś 15 dorosłych samic do małych, sztywnych pojemników-klatek, które można stykać z lodem. Zanurz klatkę z komarami w lodzie na taką głębokość, aby cała wysokość klatki i wszystkie jej boki miały kontakt z lodem. Zapewni to ekspozycję wszystkich komarów na zimno.
Znieczul komary zimnem przez około 8 minut lub do momentu, gdy przestaną być mobilne. - Umieść jednego komara na szkiełku z wgłębieniem. Szkiełko to będzie służyło jako miejsce do wykonywania wstrzyknięć.
4. Pobieranie hemocytów
- Ustaw mikrowstrzykiwacz tak, aby pobrać 12 μl rozcieńczalnika hemolimfy do wyciągniętej szklanej igły, a następnie wstrzyknąć roztwór do komara pomiędzy siódmy a ósmy segment odwłoka. Z całkowitej pobranej objętości 12 μl można wstrzyknąć 3-3,5 μl do około 3 komarów. Podczas wstrzykiwania komara należy delikatnie przytrzymać pęsetą. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika, aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Po wstrzyknięciu odwłok powinien wyglądać na „pełny” lub nabrzmiały.
- Umieść wstrzyknięte komary w osobnym, czystym pojemniku na lodzie na 5 min w celu regeneracji. Inkubacja roztworu rozcieńczalnika przeciwkrzepliwego wewnątrz komara pomoże oderwać hemocyty przylegające do tkanek wewnętrznych. Średnio podczas każdego 5-minutowego okresu regeneracji można wstrzyknąć 3 do 5 świeżych komarów.
- Po 5 minutach regeneracji, odetnij nogi, skrzydła i koniec odwłoka (na poziomie ósmego segmentu) każdego komara, jeden po drugim, używając mikronozyczek. Należy to zrobić w kubku regeneracyjnym umieszczonym na lodzie. Odcięcie nóg i skrzydeł zmniejsza prawdopodobieństwo przeniesienia łusek na szkiełka do zbierania próbek. Uwaga: nie odcinaj nóg i skrzydeł zbyt blisko miejsc przyczepu do klatki piersiowej, aby uniknąć powstania innych otworów, przez które mogłaby wyciec hemolimfa. Hemolimfę należy zbierać wyłącznie przez otwór utworzony na końcówce odwłoka.
- Umyj jedno trawione szklane szkiełko mikroskopowe 70% Ethanolem i osusz je chusteczką kimwipe. Umieść jednego wstrzykniętego i zregenerowanego komara na szkiełku, na zewnętrznej krawędzi trawionego okręgu. Ustaw mikrowstrzykiwacz, aby pobrać 12 μl świeżego rozcieńczalnika hemolimfy i wstrzyknąć tę objętość do komara w boczną stronę jego mezotoraksu. Podaj większość, ale nie całą objętość rozcieńczalnika (około 8 – 10 μl), aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika.
- Ustaw komara tak, aby odcięty otwór odwłoka znajdował się na krawędzi okręgu o średnicy 1 cm. Po wstrzyknięciu rozcieńczona hemolimfa powinna zostać zebrana wewnątrz zaznaczonego obszaru. Po wyjęciu igły z miejsca wstrzyknięcia w mezotoraksie, ponownie przytrzymaj komara ramionami pęsety i delikatnie ściśnij odwłok, aby skierować hemolimfę na obszar trawionego okręgu.
- Pozostaw rozcieńczoną hemolimfę do wyschnięcia na szkiełku przez około 10 minut lub do momentu, aż będzie widocznie sucha.
5. Fixacja i barwienie hemocytów
- Każny preparat należy barwić oddzielnie za pomocą HEMA3 7 (patrz Materiały): zanurzyć preparat w utrwalaczu 5 razy po 1 sekundzie; zanurzyć preparat w roztworze I 3 razy po 1 sekundzie; i na koniec zanurzyć preparat w roztworze II 3 razy po 1 sekundzie. Przepłukać tył preparatu wodą DI. Frontu preparatu nie należy płukać. Osuszyć za pomocą papieru filtracyjnego front preparatu poza wytrawionym okręgiem zawierającym zabarwioną tkankę.
- Nanieść medium montażowe (np. Shur/Mount lub Polymount) wokół wytrawionego centrum i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Lekko docisnąć szkiełko nakrywkowe (25 x 25 mm), aby medium montażowe rozprowadziło się na całej powierzchni objętej szkiełkiem (w tym w wytrawionym okręgu zawierającym zabarwioną tkankę). Pozostawić preparaty do wyschnięcia na minimum 3 godziny lub na całą noc. Hemocyty należy oglądać w ciągu 2 tygodni od momentu pobrania w celu uzyskania optymalnej wizualizacji i obrazowania.
6. Reprezentatywne wyniki
Przykłady utrwalonych i barwionych HEMA3 hemocytów pobranych od dorosłej samicy Aedes aegypti przedstawiono na rysunku 1A-C. Rysunek 1A przedstawia hemocyt, który zidentyfikowano jako prohemocyt na podstawie jego małego rozmiaru, kształtu kulistego lub sferoidalnego oraz wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy (powiększenie 550x) 11. Rysunek 1B przedstawia hemocyt sklasyfikowany jako oenocytoid na podstawie jego sferoidalnego kształtu i wysokiego stosunku cytoplazmy do jądra (powiększenie 550x). Na koniec, rysunek 1C przedstawia hemocyt typu granulocyt (powiększenie 550x). Granulocyty charakteryzują się większą ziarnistością i wykazują tendencję do przyjmowania kształtu oraz zachowania ameboidalnego podczas przylegania do szklanych powierzchni. Stosując wcześniej opublikowane kryteria typowania i odzyskiwania hemocytów 11, nasza metoda pobierania pozwoliła uzyskać podobną całkowitą liczbę hemocytów; podobnie stwierdzono, że granulocyty stanowią największy odsetek wszystkich hemocytów 11 (Rys. 2).
Rycina 1. Obrazy z mikroskopu świetlnego reprezentatywnego prohemocytu (A), oenocytu (B) oraz granulocytu (C) utrwalonego i barwionego metodą HEMA3, pobranych od dorosłej samicy Ae. aegypti. C = cytoplazma, N = jądro, G = ziarnistości.
Rycina 2. Całkowita liczba ± SE wszystkich hemocytów i granulocytów uzyskanych z jednej samicy komara za pomocą naszej metody rozcieńczania i pobierania hemolimfy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda pobierania hemocytów stanowi modyfikację wcześniej opublikowanych metod i pozwala na wyizolowanie czystych preparatów hemocytów z komarów z rodzaju Aedes przy mniejszej liczbie etapów. Choć naszym głównym celem jest charakterystyka populacji hemocytów u komarów Aedes, uważamy, że technikę tę można zastosować do innych grup komarów po przeprowadzeniu wstępnych prób w celu ustalenia odpowiednich objętości iniekcji. Nasz protokół wykorzystuje bufory przeciwzakrzepowe zamiast roztworu s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Johnowi Freyowi i Benowi Petersonowi za hodowlę komarów. Dziękujemy również Christine Davis i Gary'emu Radice za pomoc w przygotowaniu mikrografii hemocytów. Badania te były finansowane ze stypendium letniego University of Richmond Arts & Science przyznanego A. A. Qayumowi oraz grantu wydziałowego dla A. Telanga.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nazwa odczynnika | Firma | Numer katalogowy | Uwagi (opcjonalnie) |
| Pożywka Schneidera’ | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Płódkowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Zestaw barwiący Hema3 | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Igły szklane (borokrzemowe z włóknem) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. i 0.78mm I.D. |
| Wytciągacz do igieł | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| Mikroinkubator | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Uchwyt do igieł | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
Bibliografia
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
