Artykuł metodologiczny

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2772

⸱

16 maja 2011

 , 
1Department of Biology, University of Richmond

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Streszczenie

Komary są wektorami wielu patogenów wywołujących choroby, takich jak wirus żółtej febry, pasożyty malarii i nicienie filariozy. Laboratoria badają antypatogenne komponenty wrodzonego układu odpornościowego u gatunków wektorów chorób w nadziei na stworzenie transgenicznych komarów opornych na takie patogeny1, 2. Wrodzony układ odpornościowy komarów składa się z kilku linii obrony 3. Patogeny, którym udaje się pokonać barierę tworzoną przez wyścielone nabłonkiem jelito środkowe komara 4, przedostają się do hemolimfy i napotykają krążące hemocyty – istotne komponenty komórkowe, które otaczają i pochłaniają patogeny 5, 6. Badacze nie znaleźli dowodów na istnienie tkanek krwiotwórczych u komarów, a obecne dane sugerują, że liczba hemocytów jest stała w momencie pojawienia się postaci dorosłej i może wręcz spadać wraz z wiekiem komara 7. Zdolność do prawidłowego pobierania i identyfikacji hemocytów z owadów o znaczeniu medycznym jest kluczowym etapem badań nad odpornością komórkową. Jednak niewielki rozmiar komarów i ograniczona objętość hemolimfy stanowią wyzwanie w procesie pozyskiwania komórek odpornościowych.

Dwie uznane metody pobierania hemocytów komarów obejmują wypychanie hemolimfy z przeciętego proboscis 8 oraz przemieszczanie objętościowe (perfuzję), w której roztwór soli fizjologicznej wstrzykuje się w błoniasty obszar szyjny między głową a klatką piersiową (tj. cervix), a perfundowaną hemolimfę zbiera się z nacięcia w dystalnym regionie odwłoka 9, 10. Techniki te są jednak ograniczone odpowiednio przez niską wydajność odzysku hemocytów oraz możliwe zanieczyszczenie komórkami ciała tłuszczowego 11. W ostatnim czasie metoda określana jako high injection/recovery poprawiła odzysk immunocytów dzięki zastosowaniu buforów przeciwzakrzepowych, przy jednoczesnym zmniejszeniu poziomu zanieczyszczeń w postaci łusek i tkanek wewnętrznych 11. Choć metoda ta pozwala na lepsze pobieranie i utrzymywanie hemocytów do hodowli pierwotnych, wiąże się z szeregiem etapów wstrzykiwania i zbierania, które nie są konieczne, jeśli celem końcowym jest pobranie, utrwalenie i barwienie hemocytów do celów diagnostycznych. W niniejszej pracy prezentujemy naszą metodę pobierania hemolimfy komarów, która łączy prostotę perfuzji, z wykorzystaniem buforów przeciwzakrzepowych zamiast roztworu soli fizjologicznej, z dokładnością technik high injection w celu izolacji czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes.

Protokół

1. Przygotowania przed pobraniem hemocytów

  1. Przygotować roztwór rozcieńczający hemolimfę składający się z 60% pożywki Schneidera (Schneider's Medium), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 30% buforu cytrynianowego (antykoagulanta; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5) 11. Przygotować aliquoty o objętości 1,0 mL, które można przechowywać w temperaturze -20°C. Każdą aliquotę należy wykorzystać tylko raz (patrz Materiały).
  2. Przygotować szklane przedmioty szkiełka (75 x 25 x 1 mm), nacinając na jednym końcu okrąg o średnicy 1 cm za pomocą narzędzia do trawienia szkła. Alternatywnie można zakupić szkiełka z dwoma wcześniej wytrawionymi okręgami (np. od dostawców Fisher Scientific lub EMS). Niezbędne będzie jedno szkiełko na każdego komara.
  3. Przygotować zestaw szklanych igieł (patrz Materiały) wyciągniętych zgodnie z poniższymi sugerowanymi ustawieniami (Sutter Instruments, Model P-87):
    Heat Ramp: +5
    Pull: 45
    Vel: 75
    Time: 175
    Pressure: 580

    Stosując sugerowane ustawienia tego wyciągacza, otrzymujemy igły o całkowitej długości około 500 mm i długości trzonka około 3 mm. Można również zakupić gotowe igły (np. Tritech Research).

2. Przygotowanie mikroinjektora przed pobraniem hemocytów

  1. Wprowadź wyciągniętą igłę do uchwytu igły mikroinjektora zgodnie z instrukcjami producenta. Wypełnij wstecznie przewód mikroinjektora (patrz Materiały), strzykawkę oraz wyciągniętą igłę szklaną olejem mineralnym zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Przygotowanie samic komarów przed pobraniem hemocytów

  1. Przenieś 15 dorosłych samic do małych, sztywnych klatek, które można bezpośrednio stykać z lodem. Zanurz klatkę z komarami w lodzie na tyle głęboko, aby cała wysokość klatki oraz wszystkie jej boki miały kontakt z lodem. Zapewni to ekspozycję wszystkich komarów na niską temperaturę.
    Poddaj komary anestezji zimnem przez około 8 minut lub do momentu, aż przestaną być ruchliwe.
  2. Umieść jednego komara na szkiełku wgłębnym. Szkiełko to będzie służyć jako miejsce wykonywania iniekcji.

4. Pobieranie hemocytów

  1. Ustaw mikrowstrzykiwacz tak, aby pobrać 12 μl rozcieńczalnika hemolimfy do wyciągniętej szklanej igły, a następnie wstrzyknij roztwór do komara pomiędzy siódmy a ósmy segment odwłoka. Z całkowitej pobranej objętości 12 μl można wstrzyknąć roztwór do około 3 komarów, zużywając na każdego 3-3,5 μl. Podczas wstrzykiwania komara należy delikatnie przytrzymać pęsetą. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika, aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Po wstrzyknięciu odwłok powinien wyglądać na „pełny” lub nabrzmiały.
  2. Umieść wstrzyknięte komary w oddzielnym, czystym pojemniku na lodzie, aby regenerowały się przez 5 min. Inkubacja roztworu rozcieńczalnika przeciwzakrzepowego wewnątrz komara pomoże odłączyć hemocyty przylegające do tkanek wewnętrznych. Średnio w każdym 5-minutowym okresie regeneracji można wstrzyknąć roztwór do 3-5 świeżych komarów.
  3. Po 5 minutach regeneracji odetnij jedną po drugiej nogi, skrzydła oraz końcówkę odwłoka (na poziomie ósmego segmentu) każdego komara za pomocą mikronozyczek. Czynność tę należy wykonać w kubku regeneracyjnym umieszczonym na lodzie. Odcięcie nóg i skrzydeł zmniejsza prawdopodobieństwo przeniesienia łusek na slajdy do zbierania próbek. Uwaga: nie odcinaj nóg i skrzydeł zbyt blisko miejsc przyczepu do klatki piersiowej, aby nie stworzyć dodatkowych otworów, przez które mogłaby wyciec hemolimfa. Hemolimfę należy zbierać wyłącznie przez otwór utworzony na końcówce odwłoka.
  4. Umyj jeden szklany trawiony slajd mikroskopowy 70% etanolem i osusz go chusteczką typu kimwipe. Umieść jednego wstrzykniętego i zregenerowanego komara na slajdzie, na zewnętrznej krawędzi trawionego okręgu. Ustaw mikrowstrzykiwacz na pobranie 12 μl świeżego rozcieńczalnika hemolimfy i wstrzyknij tę objętość do bocznej strony mezotoraksu komara. Podaj większość, ale nie całą objętość rozcieńczalnika (około 8–10 μl), aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika.
  5. Ustaw komara tak, aby odcięty otwór odwłoka znajdował się przy krawędzi okręgu o średnicy 1 cm. Po wstrzyknięciu rozcieńczona hemolimfa powinna zostać zebrana wewnątrz zaznaczonego obszaru. Po usunięciu igły z miejsca wstrzykiwania w mezotoraksie, ponownie przytrzymaj komara ramionami pęsety i delikatnie ściśnij odwłok, aby skierować hemolimfę na obszar trawionego okręgu.
  6. Pozostaw rozcieńczoną hemolimfę do wyschnięcia na slajdzie przez około 10 minut lub do czasu, aż będzie widocznie sucha.

5. Fixacja i barwienie hemocytów

  1. Każdy preparat należy zabarwić osobno za pomocą HEMA3 7 (patrz Materiały): zanurzyć preparat w utrwalaczu 5 razy po 1 sekundzie; zanurzyć preparat w roztworze I 3 razy po 1 sekundzie; i na koniec zanurzyć preparat w roztworze II 3 razy po 1 sekundzie. Przemyć tył preparatu wodą DI. Przodu preparatu nie należy przemywać. Osuszyć za pomocą bibuły przód preparatu poza wytrawionym okręgiem zawierającym zabarwoną tkankę.
  2. Nanieść medium montażowe (np. Shur/Mount lub Polymount) wokół wytrawionego centrum i nałożyć na nie szkiełko przykrywne. Delikatnie nacisnąć szkiełko przykrywne (25 x 25 mm), aby medium montażowe rozprowadziło się na cały obszar pokryty szkiełkiem (w tym w obrębie wytrawionego okręgu zawierającego zabarwoną tkankę). Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez minimum 3 godziny lub przez noc. Hemocyty należy oglądać w ciągu 2 tygodni od momentu pobrania w celu uzyskania optymalnej wizualizacji i obrazowania.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady unieruchomionych i barwionych HEMA3 hemocytów pobranych od dorosłej samicy Aedes aegypti przedstawiono na Rysunku 1A-C. Rysunek 1A przedstawia hemocyt, który zidentyfikowano jako prohemocyt na podstawie jego niewielkiego rozmiaru, kształtu sferyczno-sferoidalnego oraz wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy (powiększenie 550x) 11. Rysunek 1B przedstawia hemocyt sklasyfikowany jako oenocytoid na podstawie jego sferoidalnego kształtu i wysokiego stosunku cytoplazmy do jądra (powiększenie 550x). Na koniec, Rysunek 1C przedstawia hemocyt typu granulocyt (powiększenie 550x). Granulocyty charakteryzują się bardziej ziarnistą strukturą i mają tendencję do przyjmowania bardziej ameboidalnego kształtu i zachowania podczas przylegania do szklanych powierzchni. Stosując wcześniej opublikowane kryteria typowania i odzyskiwania hemocytów 11, nasza metoda pobierania pozwoliła uzyskać podobną całkowitą liczbę hemocytów; stwierdziliśmy również, że granulocyty stanowią największy procent całkowitej liczby hemocytów 11 (Rys. 2).

figure-protocol-1
Rycina 1. Zdjęcia mikroskopowe wykonane za pomocą mikroskopu świetlnego przedstawiające reprezentatywny prohemocyt (A), oenocyt (B) oraz granulocyt (C) utrwalone HEMA3 i barwione, pobrane od dorosłej samicy Ae. aegypti. C = cytoplazma, N = jądro, G = ziarnistości.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Całkowita liczba ± SE wszystkich hemocytów i granulocytów uzyskanych od jednej samicy komara przy zastosowaniu naszej metody rozcieńczania i pobierania hemolimfy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pobierania hemocytów stanowi modyfikację wcześniej opublikowanych metod i pozwala na wyizolowanie czystych preparatów hemocytów z komarów z rodzaju Aedes przy mniejszej liczbie etapów. Choć naszym głównym celem jest charakterystyka populacji hemocytów u komarów Aedes, uważamy, że technikę tę można zastosować do innych grup komarów po przeprowadzeniu wstępnych prób w celu ustalenia odpowiednich objętości iniekcji. Nasz protokół wykorzystuje bufory przeciwzakrzepowe zamiast roztworu s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Johnowi Freyowi i Benowi Petersonowi za hodowlę komarów. Dziękujemy również Christine Davis i Gary'emu Radice za pomoc w przygotowaniu mikrografii hemocytów. Badania te były finansowane ze stypendium letniego University of Richmond Arts & Science przyznanego A. A. Qayumowi oraz grantu wydziałowego dla A. Telanga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyUwagi (opcjonalnie)
Pożywka Schneidera’Sigma-AldrichS0146
Płódkowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF0643
Zestaw barwiący Hema3Fisher Scientific123-869
Igły szklane (borokrzemowe z włóknem)Sutter Instrument Co.BF100-78-101.0mm O.D. i 0.78mm I.D.
Wytciągacz do igiełSutter Instrument Co.Model P-87
MikroinkubatorTritech Research, Inc.MINJ-PD
Uchwyt do igiełTritech Research, Inc.MINJ-4

Bibliografia

  1. Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
  2. Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
  3. Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
  4. Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
  5. Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
  6. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
  7. Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
  8. Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
  9. Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
  10. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
  11. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pozyskiwanie hemocyt whemolimfa komaratechnika perfuzjirozcie czalnik przeciwzakrzepowyprzygotowanie preparatu na szkie kubarwienie hemocyt wmetoda mikroiniekcjiperfuzja hemolimfywizualizacja kom rek

Powiązane artykuły