Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Synapsy składają się z presynaptycznej strefy aktywnej w komórce sygnałowej oraz terminala postsynaptycznego w komórce docelowej. W przypadku synaps chemicznych sygnały są przenoszone przez neuroprzekaźniki uwalniane z terminali presynaptycznych i odbierane przez receptory w komórkach postsynaptycznych. Nasze poprzednie badania na Caenorhabditis elegans wykazały, że VSM-1 negatywnie reguluje egzocytozę. Ponadto analiza synaps u mutantów vsm-1 wykazała, że zwierzęta pozbawione w pełni funkcjonalnego VSM-1 wykazują zwiększoną łączność synaptyczną. Na podstawie tych wstępnych wyników wysunęliśmy hipotezę, że VSM-1 u C. elegans może odgrywać kluczową rolę w synaptogenezie. Aby sprawdzić tę hipotezę, przeprowadzono analizę mikromacierzy z podwójnym znakowaniem i określono profile ekspresji genów. Najpierw wyizolowano całkowite RNA, poddano je odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie zhybrydyzowano z mikromacierzami DNA. Następnie analiza in-silico hybrydyzacji sond fluorescencyjnych ujawniła istotną indukcję wielu genów kodujących białka z rodziny głównych białek plemników (MSP) u mutantów ze wzmocnioną synaptogenezą. Białka MSP są głównym składnikiem plemników u C. elegans i wydają się sygnalizować dojrzewanie oocytów oraz owulację u nicieni. U muszek owocówek Chai i współpracownicy ¹ wykazali, że cząsteczki podobne do MSP regulują liczbę i rozmiar wypustek (boutonów) presynaptycznych w złączu nerwowomięśniowym. Co więcej, analiza przeprowadzona przez Tsudę i współpracowników ² zasugerowała, że białka MSP mogą działać jako ligandy dla receptorów Eph i uruchamiać kaskady sygnalizacyjne kinaz tyrozynowych receptorowych. Na koniec analiza PCR w czasie rzeczywistym potwierdziła, że gen kodujący MSP-32 jest indukowany u mutantów vsm-1(ok1468). Podsumowując, badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że mutanty vsm-1 wykazują znaczny wzrost gęstości synaptycznej, co może być pośredniczone przez sygnalizację MSP-32.

Protokół

1. Izolacja całkowitego RNA

1. Zdrowe, zsynchronizowane nicienie zebrano poprzez przemycie płytek pożywką M9 w temperaturze pokojowej, używając 2-3 ml na płytkę. Resuspendowane nicienie przeniesiono do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirowano w wirowarce przy 3200 g w temperaturze 4° C przez 4 minuty. Zebrane nicienie oczyszczono z pływających bakterii poprzez resuspensję osadu w 7 ml 0.1M NaCl i 7 ml lodowatej 60% w/v sacharozy. Resuspendowaną mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut, a następnie zebrano oczyszczone nicienie, które wypłynęły przez roztwór sacharozy, po odwirowaniu mieszaniny przy 3200 g w temperaturze 4° C przez 4 minuty. Robaki wolne od bakterii przeniesiono do nowej probówki stożkowej za pomocą sterylnych pipet i przemyto dwukrotnie ilością do 15 ml wody wolnej od RNaz, a następnie odwirowano przy 3200 g w temperaturze 4° C przez 2 minuty. Czysty, luźno skompaktowany osad przeniesiono do probówki do mikrowirowarki o pojemności 1.5 ml i odwirowano z maksymalną prędkością (około 10 000 g) przez 30 sekund. Na koniec usunięto większość wody wolnej od RNaz, do osadu dodano 10 objętości RNAlater i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu rozpoczęcia dalszych prac.
2. W celu przygotowania próbek całkowitego RNA, zebrane nicienie odwirowano z maksymalną prędkością (około 10 000 g) przez 4 minuty i usunięto RNAlater. Następnie do osadu dodano szczyptę żywicy do rozcierania molekularnego Molecular Grinding Resin (G bioscience) i zamrożono mieszaninę przy użyciu ciekłego azotu. Zamrożoną zawiesinę robaków utarto na drobny proszek za pomocą tłuczka, dodając w razie potrzeby ciekły azot, aby utrzymać niską temperaturę proszku. Po rozcieraniu ekstrakt utrzymywano na lodzie przez 5 minut, a następnie zmieszano z 700 μl RLT/BME (stosunek 100 objętości RLT: 1 objętość BME) (Qiagen) oraz 472 μl 100% etanolu.
3. Całkowite RNA wyizolowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen) zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Końcowa objętość wyizolowanego RNA wynosiła 60 μl na próbkę biologiczną.

2. Trawienie DNA i oczyszczanie RNA

1. 50 μg całkowitego RNA, potencjalnie zanieczyszczonego DNA genomicznym, poddano trawieniu za pomocą DNase I (Qiagen). Reakcje trawienia zawierające 0,1 U DNase/1 μg RNA oraz 1X Buffer RDP inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Próbki RNA traktowane DNase I oczyszczono przy użyciu zestawu RNeasy MinElute Clean-Up Kit (Qiagen). Postępowano zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta, uzyskując końcową objętość elucji 60 μl.

3. Analiza jakościowa i ilościowa RNA

1. Stężenie RNA określono za pomocą spektrofotometru UV Nanodrop (Thermo Scientific).
2. Integralność próbek RNA oceniono za pomocą elektroforezy w agarozy. W skrócie, przygotowano 1% żele agarozowe wolne od RNaz, wykorzystując 1X Northern Max Gly Gel Prep/Running Buffer (Ambion), 1% RNase-free Agarose LE (Ambion) oraz 0,5 μg/ml bromku etydyny. Podczas polimeryzacji żelu próbki RNA poddano gliksolowaniu poprzez dodanie 5 μl Glyoxyl Sample Loading Dye na próbkę i inkubację w temperaturze 50°C przez 30 minut. Marker wielkości RNA również został poddany gliksolowaniu i naniesiony na żel w celu porównania wielkości cząsteczek.

4. Synteza cDNA

1. Dla każdej reakcji syntezy 8,4 μg próbki RNA zmieszano z 1 μl primera RT (1 pmole/μl). Jedna próbka (WT lub mutant) otrzymała primer RT do przechwytywania Cy5; druga próbka otrzymała primer RT do przechwytywania Cy3 (dostarczony w zestawie Array 350 Labeling -Detection Kit, Genisphere). Mieszaniny próbek podgrzewano w temperaturze 75-80°C przez 10 minut, a następnie przeniesiono na lód na 2-3 minuty.
2. Podczas inkubacji próbek RNA przygotowano MasterMix (Genisphere) w następujący sposób: do każdej reakcji RT dodano 4 μl 5X Reaction Buffer for RT, 1 μl dNTP (po 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μl Superase-In RNase Inhibitor (dostarczony w zestawie Array 350 Labeling-Detection Kit, Genisphere) oraz 1 μl enzymu RT (200 u/μl). Na koniec do każdej próbki RNA dodano 7 μl MasterMix, delikatnie wymieszano (nie używać vortexa) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 42° C.

5. Degradacja RNA i oczyszczanie próbek cDNA

1. Syntezę cDNA przerwano poprzez dodanie 3,5 μl 0,5M NaOH/50mM EDTA (stężenie końcowe) i inkubowano w temperaturze 65°C przez 15 minut. Następnie reakcje zneutralizowano za pomocą 1M Tris-HCl, pH 8,0, aby osiągnąć stężenie końcowe 850 mM Tris-HCl. Na koniec cDNA typu dzikiego (WT) oraz mutanty połączono w jednej probówce do mikrocentryfugi. Pustą probówkę wypłukano 73 μl buforu 1X TE i zawartość dodano do probówki z cDNA; końcowa objętość połączonego cDNA wynosiła 130 μl.
2. Mieszaninę cDNA oczyszczono zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Uzyskana objętość eluatego oczyszczonego cDNA wyniosła 60 μl.

6. Pierwsza hybrydyzacja mikromacierzy

1. C. elegans szkiełka do mikromacierzy uzyskane z GCAT (Genome Consortium for Active Teaching) blokowano w temperaturze pokojowej przez 1 h, używając 0,1 mg/ml sonikowanego DNA nasienia łososia w 3X SSC, 0,1% SDS. Zablokowane szkiełka płukano poprzez zanurzenie w ddH2O, a następnie osuszano przez wirowanie przez 1 min przy 2 000 g w 50 ml probówkach stożkowych z włożoną na dno chusteczką KimWipe.
>
2. Następnie bufor do hybrydyzacji na bazie 2X formamidu (Genisphere) inkubowano w temperaturze 55°C przez 10 min, dokładnie wymieszano w celu rozpuszczenia kryształków i wirowano przez 1 min przy 10 000 g. Następnie 25 μl próbki cDNA delikatnie wymieszano poprzez potrząsanie z 25 μl 2X buforu do hybrydyzacji na bazie formamidu. Rozcieńczoną próbkę cDNA zebrano za pomocą krótkiego wirowania (flash spin) przez 15 s i inkubowano w temperaturze 80°C przez 10 min.
3. Na koniec cDNA hybrydyzowano ze szkiełkiem do mikromacierzy, ostrożnie pipetując całą podgrzaną próbkę cDNA, nie dotykając szkiełka. Próbkę równomiernie rozprowadzono na mikromacierzy, delikatnie opuszczając szkiełko nakrywkowe za pomocą igły strzykawki. Zanim nakrywka została całkowicie opuszczona, podniesiono ją ponownie, a następnie ponownie opuszczono igłą i pozwolono jej łagodnie opaść na miejsce, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. Pierwszy etap hybrydyzacji zakończono, umieszczając szkiełko poziomo w 50 ml probówce stożkowej z 50 μl ddH₂O pod szkiełkiem i inkubując przez noc w temperaturze 37°C.

7. Druga hybrydyzacja

1. Zhybrydyzowane macierze mikroarray przemyto 2X SSC w różnych temperaturach. Najpierw szkiełka z mikroarray przeniesiono do probótek stożkowych zawierających 2X SSC i 0,2% SDS w temperaturze pokojowej i delikatnie wstrząśnięto, aby usunąć szkiełka zakrywkowe. Następnie szkiełka z mikroarray przeniesiono do probótek stożkowych zawierających 2X SSC i 0,2% SDS w temperaturze 55°C i inkubowano w 55°C przez 15 minut. Kolejno szkiełka przeniesiono do 2X SSC i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, okresowo delikatnie wstrząsając. Na koniec szkiełka przeniesiono do 0,2X SSC i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, okresowo delikatnie wstrząsając. Przemyte szkiełka osuszono wirowo, umieszczając je stroną z etykietą skierowaną w dół w probótkach stożkowych o pojemności 50 ml z chusteczką KimWipe na dnie, a następnie wirowano przez 1 minutę przy 2 000 g.
2. Następnie przygotowano drugą mieszaninę do hybrydyzacji, używając 2X buforu do hybrydyzacji na bazie formamidowej (Genisphere). Bufor do hybrydyzacji inkubowano w 55°C przez 10 minut i wirowano przez 1 minutę przy 10 000 g. Fluorescencyjne odczynniki do wychwytu (Cy3 i Cy5) oraz odczynnik anti-fade rozmrożono w temperaturze pokojowej i przykryto folią, aby chronić odczynniki przed fotoblaknięciem. Kolejne etapy hybrydyzacji przeprowadzono w ciemności, aby zminimalizować ekspozycję na światło. 150 μl 2X buforu do hybrydyzacji na bazie formamidowej połączono z 1,5 μl odczynnika anti-fade, tworząc mieszaninę do hybrydyzacji z dodatkiem anti-fade.
3. Odczynniki do wychwytu Cy3 i Cy5 wymieszano w wortexie przez 3 sekundy i wirowano przez 15 sekund przy 10 000 g. Drugą mieszaninę do hybrydyzacji przygotowano, łącząc 75 μl mieszaniny do hybrydyzacji z anti-fade, 60 μl wody wolnej od nukleaz, 7,5 μl odczynnika do wychwytu Cy3 oraz 7,5 μl odczynnika do wychwytu Cy5. Drugą mieszaninę do hybrydyzacji inkubowano przez 10 minut w 75°C, a następnie 50 μl podgrzanej mieszaniny naniessiono bardzo ostrożnie pipetą na przemyte i osuszone szkiełko z mikroarray. Aby równomiernie rozprowadzić próbkę na mikroarray, delikatnie opuszczono szkiełko zakrywkowe za pomocą igły strzykawki. Zanim szkiełko zakrywkowe zostało całkowicie opuszczone, uniesiono je z powrotem, a następnie ponownie opuszczono igłą, pozwalając mu delikatnie opaść na miejsce, co zminimalizowało powstawanie pęcherzyków powietrza. Szkiełko z mikroarray podlegające hybrydyzacji umieszczono poziomo w probótce stożkowej o pojemności 50 ml przykrytej folią i pod szkiełko dodano 50 μl ddH₂O w celu stworzenia komory wilgotnościowej. Drugą hybrydyzację inkubowano w 37°C przez 2-5 godzin.
4. Drugą hybrydyzowaną macierz mikroarray przemyto w ciemności, używając 2X SSC, 0,2% SDS, 1 mM DTT w temperaturze pokojowej, i delikatnie wstrząśnięto, aby usunąć szkiełko zakrywkowe. Następnie mikroarray przeniesiono do przykrytej probótki stożkowej zawierającej 2X SSC, 0,2% SDS, 1 mM DTT w 55°C i inkubowano przez 15 minut w 55°C. Kolejno szkiełko przeniesiono do przykrytej probótki stożkowej zawierającej 2X SSC i 1 mM DTT i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, okresowo delikatnie wstrząsając. Na koniec szkiełko przeniesiono do 0,2X SSC i 1 mM DTT i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, okresowo delikatnie wstrząsając. Szkiełko z mikroarray osuszono przez wirowanie przez 1 minutę przy 2 000 g, ze szkiełkiem stroną z etykietą skierowaną w dół w przykrytej probótce stożkowej o pojemności 50 ml z chusteczką KimWipe na dnie. Suche szkiełka z mikroarray zeskanowano przy użyciu skanera GenePix Personal Scanner model 4100A w Davidson College.

8. Analiza mikromacierzy

1. Obrazy uzyskane po skanowaniu przeanalizowano przy użyciu oprogramowania MAGICTool opracowanego w Davidson College przez Laurie Heyer oraz jej studentów studiów licencjackich. W skrócie, w zakładce „Project” utworzono i zapisano „New Project”. W zakładce „Build Expression Profile” wybrano opcję „Load Image Pair”, a następnie przesłano plik obrazu czerwonego (_635.tif) jako „Red” oraz plik obrazu zielonego (_532.tif) jako „Green”. Następnie, korzystając z zakładki „Build Expression Profile” i opcji „Load Gene List”, przesłano plik z listą genów C. elegans pobrany ze strony internetowej GCAT.
2. Obraz mikromacierzy zaadresowano i podzielono na siatkę za pomocą zakładki „Build Expression Profile” i opcji „Create/Edit Grid”. W oknie dialogowym „Grid Setup” ustawiono liczbę siatek na „48”, „22 rows” i „22 columns” dla każdej siatki, a numerację plamek określono jako „Left to Right” oraz „Top to Bottom”. Zwiększono parametr „Percent Contrast Change” i przybliżono widok siatki, aż poszczególne plamki stały się łatwo rozróżnialne. Siatki tworzono, wybierając najpierw „Set Top Left Spot” w panelu lewym. Następnie kliknięto w środek lewej górnej plamki, prawej górnej plamki oraz w dolny rząd w „Grid 1”. Procedurę tworzenia siatki powtórzono dla każdej z 48 siatek, postępując od lewej do prawej i od góry do dołu. Po zakończeniu tworzenia siatki aktualną siatkę zapisano za pomocą „File” „Save Current Grid As”. Po pomyślnym zapisaniu siatki wybrano zakładkę „Finished”.
3. Aby wyeliminować z analizy wszelkie niepowiązane plamki, otwarto zakładkę „Build Expression Profile”. W opcjach „Addressing Gridding” wybrano „Spot Flagging”. Plamki z smugami lub fluorescencję tła oznaczono i zapisano, wybierając „Save Current Flags As” w zakładce „File”.
4. Pliki z oznaczeniami poddano segmentacji, korzystając z zakładki „Build Expression Profile” i wybierając „Fixed Radius” jako preferowaną metodę segmentacji. Promień ustawiono na pożądaną wielkość i kliknięto „Update Data”. Aby upewnić się, że okrąg pozostaje w obszarze siatki (żółty kwadrat), przesunięto widok od góry do dołu i od lewej do prawej, a po sprawdzeniu wybrano „Create Expression Profile”.
5. Podczas segmentacji oprogramowanie obliczyło stosunki fluorescencji Red:Green dla każdej z plamek, które pozostały po oznaczaniu. W zakładce „Expression” wybrano „Manipulate Data” „Transform”. Pojawiło się okno dialogowe „Transform Data”, w którym wprowadzono opcję „logb(x)” oraz b=2. Z zakładki „Expression” przeanalizowano „Working Expression File”. W przypadku eksperymentu, w którym typ dziki otrzymał sekwencję wychwytującą Cy3 (zieloną), a mutant otrzymał sekwencję wychwytującą Cy5 (czerwoną), wartości logarytmicznie przekształconych stosunków były dodatnie dla genów indukowanych i ujemne dla genów represowanych.
6. Na koniec przeanalizowano geny indukowane lub represowane przez określony czynnik, wybierając „Explore” w zakładce „Expression”. W oknie dialogowym „Exploring” opcję „Find Genes Matching Criteria” ustawiono na geny o wartości „Max. value > X (liczba dodatnia dla genów indukowanych)” lub „Min. value < X (liczba ujemna dla genów represowanych)” w eksperymentach takich jak opisany w punkcie 5. Poziom nadekspresji (fold-expression) był równy 2x, gdzie „x” jest wartością liczby wprowadzonej w kryteriach wyboru.

9. Synteza cDNA i PCR w czasie rzeczywistym

1. Całkowite RNA wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem. Po określeniu jakości i ilości wyizolowanego RNA zsyntetyzowano cDNA przy użyciu zestawu iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad), 500 ng/μl całkowitego RNA wyizolowanego z typu dzikiego oraz mutanta, zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta.
2. Reakcje Real-time PCR przeprowadzono z użyciem iQ SYBR Green Supermix (BioRad), 100-500 nmoli starterów specyficznych dla genów (tabela 1) oraz 4 μl cDNA otrzymanego w poprzednim etapie. Reakcje o objętości 10 μl przeprowadzono w termocyklerze CFX96 Real-Time System (BioRad).
3. Termocykler podgrzano najpierw do 95°C na 3 min. Następnie przeprowadzono etap w 95°C przez 5 sekund i w 58°C przez 30 sekund. Cykl ten powtórzono czterdzieści razy, a następnie wykonano krzywą topnienia w zakresie 65-95°C z gradientem 0,5 stopnia. Wartości ΔΔCT obliczono z wykorzystaniem trzech genów referencyjnych (act-1, cdc-42 oraz pmp-3) jako kontroli.

GEN	STARTER PRZÓD (FORWARD)	STARTER TYŁ (REVERSE)
gst-5	CTGCTCCATTCGGACAACTT	TCCGTTGAGCTTGAACTCAC
gst-9	GGAAGACAACTGGCACAATC	ACCGAGAGCATCAACTTGAG
kcnl-1	TACGCTCGGCATGTGTTGTATC	CCAATCATCGGCTCCACTATCT
ksr-2	CGAACTGCTGCTGGAATGCT	GTGCTGCGTCTCTTCTGCTT
lim-9	CTCATCGAGTGGCTCAATCT	CACCTTGCTCCATCTTCAAC
lpr-6	CAGCAGTCACTTCTGTTCAC	TCTCCAATAGCGGTACTCC
mes-6	TTGTTCCGTTGGCTCACGTACAG	CGACAGACGCAGATACACGATCA
msp-32	GCCGCACAGGTATGATCCAG	ATCCAATACGGCGAGCCGAG
msp-142	GATCCACCATGTGGAGTTCT	GATTCTTGCGACGGACCATA
msp-38	GCCTTCGGACAAGAGGATACC	CCATACCGTCTCCTTGGAACC
msp-45	TCACCGTTGAGTGGACCAAT	ACGAACCAACCGTCTCCTT
msp-49	CGACGACAAGCACACCTACCACATCAA	TCGAGGACTCCACATGGTGGATCAACT
msp-56	CGAAGATCGTCTTCAATGCGCCATAC	TCCACATGGTGGATCAACTCCAAGTC

Tabela 1. Sekwencje starterów forward i reverse do real-time PCR

10. Reprezentatywne wyniki:

Izolacja i analiza RNA

Fuzja pęcherzyków prekursorowych strefy aktywnej w miejscach presynaptycznych jest obowiązkowym etapem podczas synaptogenezy (3). Zaproponowano, że VSM-1, niedawno zidentyfikowane główne białko v-SNARE, hamuje fuzję pęcherzyków u drożdży oraz synaptogenezę u nicieni (patrz Rycina 1) poprzez nieokreślony mechanizm (4 oraz nasze niepublikowane prace). Aby lepiej zrozumieć ścieżkę molekularną leżącą u podstaw regulacji VSM-1 u nicieni i rzucić nowe światło na dziedzinę synaptogenezy, rozpoczęliśmy przesiew genomowy, w wyniku którego ustalono, że geny głównych białek plemników (msp) ulegają indukcji w przypadku braku w pełni funkcjonalnego VSM-1.

Aby zbadać geny indukowane w szczepie mutantów vsm-1 (ok1468) nicieni C. elegans, przeprowadziliśmy analizę mikromacierzy genowych. Wykonano ją poprzez badanie transkryptów wyizolowanych z typu dzikiego oraz szczepu mutantów vsm-1 i określenie poziomu ich wzbogacenia. W pierwszej kolejności wyizolowano całkowite RNA z synchronizowanych larw nicieni typu dzikiego i mutantów vsm-1 w stadiach L4 i L3. Następnie otrzymane całkowite RNA poddano działaniu DNazy I, a jakość wyekstrahowanego RNA sprawdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. W eksperymencie przedstawionym na rysunku 2, w pierwszej ścieżce zastosowano drabinę w celu określenia liczby par zasad dla standardów. Próbki typu dzikiego przed i po traktowaniu DNazą I naniesiono odpowiednio na ścieżki 2 i 4, natomiast próbki mutantów vsm-1 przed i po traktowaniu DNazą I naniesiono na ścieżki 3 i 5. Analiza elektroforezy żelowej RNA wykazała, że próbki RNA typu dzikiego oraz mutantów vsm-1 były nienaruszone i wysokiej jakości. Stwierdzono to na podstawie obserwacji dwóch prążków reprezentujących dwie podjednostki rybosomalnego RNA.

Hybrydyzacja mikromacierzy

Po określeniu jakości RNA przystąpiono do syntezy cDNA. W tym celu przeprowadzono odwrotną transkrypcję mRNA i do końca nici dodano sekwencję wychwytującą. Otrzymane cDNA zawierające sekwencje wychwytujące dla Cy3 i Cy5 poddano hybrydyzacji z płytkami do mikromacierzy, które następnie przekazano do skanowania. Obrazy z mikromacierzy wprowadzono do otwartoźródłowego programu komputerowego MAGICTool, opracowanego w Davidson College przez Laurie Heyer i jej studentów studiów licencjackich. Przy użyciu tego oprogramowania nałożono na siebie obrazy Cy3 i Cy5, wykonano siatkowanie mikromacierzy oraz przeanalizowano profile fluorescencji (patrz Rysunek 3). Po zakończeniu siatkowania dokonano segmentacji każdego pojedynczego kwadratu, upewniając się, że analizowany jest cały wydrukowany oligonukleotyd. Następnie przeanalizowano stosunki indukcji i utworzono profile ekspresji genetycznej, wykazujące, że geny kodujące rodzinę MSP są indukowane u nicieni z nasiloną synaptogenezą (Tabela 3).

Walidacja i kwantyfikacja ekspresji genów przy użyciu techniki real-time PCR.

Aby lepiej zrozumieć profil genetyczny mutanta vsm-1, przeanalizowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym szereg genów kodujących białka z rodziny MSP. Najpierw wyizolowano całkowite RNA z dzikiego szczepu oraz szczepów mutanta vsm-1(ok1468). Próbki RNA poddano następnie odwrotnej transkrypcji do cDNA, które wykorzystano w analizie PCR w czasie rzeczywistym. Ocena profili ekspresji w PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że jeden z członków rodziny MSP wydaje się być indukowany u mutantów vsm-1(ok1468). Co więcej, dane z PCR w czasie rzeczywistym potwierdziły wyniki uzyskane z mikromacierzy i pozwoliły zawęzić poszukiwania do jednego kandydata z genu msp (Rycina 4).

Rycina 1. A. Immunobarwienie UNC-17 wykazało, że mutanty vsm-1 wykazują wyższą gęstość synaptyczną wzdłuż grzbietowego sznura nerwowego. Obrazy analizowano przy powiększeniu 63x, tylnie (po prawej stronie) od vulvy. B. Analiza synaps WT i mutantów vsm-1 (ok1468) wykazała statystycznie istotne zwiększenie gęstości synaptycznej u mutanta vsm-1 (**p<0.01). Dla każdego genotypu wykonano obrazy dwudziestu nicieni.

Rycina 2. Jakość wyekstrahowanego RNA określono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Obecność dwóch nienaruszonych podjednostek rybosomalnych przed i po traktowaniu DNazą I była widoczna w RNA wyekstrahowanym z próbek typu dzikiego (Wild Type) oraz vsm-1(ok1468).

Rysunek 3. A. Obraz mikromacierzy z eksperymentu, w którym kontrolę znakowano kolorem czerwonym (Cy5), a mutanta vsm-1 kolorem zielonym (Cy3). B. Reprezentatywny obraz pokazujący 1 z 48 siatek analizowanych na jedną mikromacierz. Każdy mały kwadrat na siatce reprezentuje pojedynczy nadrukowany oligonukleotyd, a każda siatka składa się z 22 wierszy i 22 kolumn.

Tabela 2. Analiza mikromacierzy transkryptów wyizolowanych z larw 4 (A) i larw 3 (B) nicieni C. elegans wykazała, że geny kodujące główne białka plemników są indukowane u mutantów z nasiloną synaptogenezą. Wyróżnione geny oznaczają geny indukowane zarówno w larwach 3, jak i larwach 4.

Rycina 4. Analiza Real-Time PCR wykazała, że jeden z członków rodziny genów msp, msp-32, uległ indukcji u mutantów vsm-1(ok1468). Reprezentatywny wykres znormalizowanej krotności ekspresji pokazuje, że wartości ΔΔCT dla msp-32 w przypadku vms-1 (ok1468) różnią się znacząco w porównaniu z typem dzikim (WT), przy zastosowaniu trzech genów referencyjnych do normalizacji (act-1, cdc-42 i pmp-3). Wykreślono średnią z trzech powtórzeń +/- odchylenie standardowe.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opracowano prosty i intuicyjny protokół, który może być wykorzystywany do określania profili ekspresji genów leżących u podłoża różnych zjawisk biologicznych. W ramach tego protokołu w pierwszej kolejności wyizolowano całkowite RNA, a następnie poddano je działaniu DNazy I. Nasza metoda izolacji RNA została znacząco uproszczona poprzez pominięcie ekstrakcji fenolem i zastosowanie żywic powinowactwa do oczyszczania ^5,6. W skrócie, kutykula i błony komórkowe C. elegans zostały rozbite poprzez zamrożenie nicieni w ciekłym azocie i rozcieranie z żywicą molekularną. Następnie, przed syntezą cDNA, wyekstrahowane RNA poddano działaniu DNazy I. Ten ostatni etap dodano w celu zminimalizowania nieswoistych hybrydyzacji; próbki RNA zanieczyszczone DNA genomowym mogłyby wprowadzić zakłócenia i spowodować liczne wyniki fałszywie dodatnie. Następnie cDNA typu dzikiego oraz mutanta vsm-1(ok1468) oznakowano sekwencjami przechwytującymi Cy3 i Cy5, a następnie zhybrydyzowano na mikroarrays C. elegans otrzymanych w ramach programu GCAT. System ten jest bardziej czuły niż podobne produkty, a jego dwukolorowa konstrukcja zmniejsza liczbę potrzebnych macierzy, co przekłada się na większą oszczędność czasu i kosztów ^7,8. Ponadto system ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu charakterystycznego dla innych podobnych układów; w związku z tym procedurę tę można przeprowadzić w każdych standardowych warunkach laboratoryjnych ⁷. Po trzecie, obrazy fluorescencyjnych zhybrydyzowanych macierzy przeanalizowano przy użyciu oprogramowania open source MAGICTool, na podstawie czego stworzono profile ekspresji genów. MAGICTool to intuicyjny program, z którego mogą z łatwością korzystać osoby na każdym poziomie doświadczenia, od studentów studiów licencjackich po stażystów podoktorskich. Optymalna wydajność wymaga jednak dużej dostępnej pamięci operacyjnej. Na koniec, geny kandydackie wyłonione w analizie mikroarrays zwalidowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Chociaż podejście genomowe jest wydajną metodą badania zjawisk biologicznych, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, pomimo swoistości tego protokołu mikromacierzy, transkrypty w obrębie jednej rodziny są od siebie nieodróżnialne, jeśli wydrukowany oligonukleotyd pochodzi z sekwencji konserwowanych. PCR w czasie rzeczywistym kompensuje podobieństwa w obrębie rodziny genów, a nawet może rozróżniać konkretne izoformy tego samego genu. Jednakże w przypadku PCR w czasie rzeczywistym wyzwaniem jest znalezienie rzeczywistych kontroli, które są wyrażane równomiernie przez cały okres życia organizmu. Z tego powodu wyniki będą miały charakter relatywny. Alternatywą dla naszej techniki jest podejście proteomiczne. Poszczególne białka można wyizolować za pomocą elektroforezy żelowej 2D i zidentyfikować przy użyciu spektrometrii mas.

Nasze badania wykazują w szczególności, że wiele białek z rodziny Major Sperm Protein (MSP) ulega indukcji u mutantów nicieni vsm-1 o zwiększonej gęstości synaptycznej. Białka MSP występują wyłącznie u C. elegans i odpowiadają za dojrzewanie oocytów oraz owulację. Chai ¹ wykazał, że regulacja liczby i wielkości wypustek presynaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych u muszek owocówek jest prawdopodobnie kontrolowana przez cząsteczki zawierające domeny Major Sperm Protein. Badania przeprowadzone przez Tsudę i współpracowników ² wykazały, że domeny Major Sperm Protein mogą służyć jako ligandy dla receptorów efryny, wyzwalając kaskady sygnalizacyjne kinaz tyrozynowych. Ponadto analiza czasu rzeczywistego PCR potwierdziła i zawęziła wyniki mikroarray do jednego członka rodziny msp, mianowicie msp-32. Podsumowując, zaprezentowana tutaj praca stanowi analizę całego genomu w odniesieniu do kluczowego dylematu neuronauki, a także dowód na potencjał badań prowadzonych przez studentów w wysiłkach naukowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RNA Later	Ambion	AM7020
Żywica do rozcierania molekularnego	G-Biosciences	786-138
Zestaw RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Agaroza LE wolna od RNaz	Ambion	AM9040
Bufor do przygotowania i prowadzenia żelu NorthernMax Gly 10X	Ambion	8678
Marker RNA Millenium	Ambion	AM7150
Barwnik do nakładania próbek z gliksalem	Ambion	8551
Zestaw DNaza	Qiagen	79254
Zestaw RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204
Enzym RT i 5X bufor reakcyjny	Genisphere	RT300320
Array 350	Genisphere	W300180
Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick	Qiagen	28104
20X SSC	VWR international	82021-4846
Fragmentowane DNA sperm łososia	Ambion	AM9680
Roztwór SDS	Promega Corp.	V6551
DTT EM	VWR international	3860
Zestaw do syntezy cDNA iScript	Bio-Rad	170-8890
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad	170-8880