Określanie profili ekspresji genetycznej u C. elegans za pomocą mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Summary

Analiza mikromacierzy została przeprowadzona w celu określenia profili ekspresji genetycznej u C. elegans, a do walidacji i ilościowego określenia danych z mikromacierzy użyto PCR w czasie rzeczywistym.

Abstract

Synapsy składają się z presynaptycznej strefy aktywnej w komórce sygnalizacyjnej i postsynaptycznego terminalu w komórce docelowej. W przypadku synaps chemicznych wiadomości są przenoszone przez neuroprzekaźniki uwalniane z zakończeń presynaptycznych i odbierane przez receptory na komórkach postsynaptycznych. Nasze poprzednie badania nad Caenorhabditis elegans wykazały, że VSM-1 negatywnie reguluje egzocytozę. Ponadto analiza synaps w mutantach vsm-1 wykazała, że zwierzęta pozbawione w pełni funkcjonalnego VSM-1 mają zwiększoną łączność synaptyczną. Opierając się na tych wstępnych ustaleniach, postawiliśmy hipotezę, że C. elegans VSM-1 może odgrywać kluczową rolę w synaptogenezie. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadzono podwójnie znakowaną analizę mikromacierzy i określono profile ekspresji genów. Najpierw wyizolowano całkowite RNA, odwrócono transkrypcję do cDNA i zhybrydyzowano z mikromacierzami DNA. Następnie, analiza in-silico hybrydyzacji sondy fluorescencyjnej ujawniła znaczącą indukcję wielu genów kodujących członków głównej rodziny białek plemników (MSP) u mutantów ze zwiększoną synaptogenezą. MSP są głównym składnikiem plemników C. elegans i wydają się sygnalizować dojrzewanie oocytów i owulację nicieni . U muszek owocowych Chai ^{i współpracownicy} wykazali, że cząsteczki podobne do MSP regulują liczbę i rozmiar presynaptycznych guzów w połączeniu nerwowo-mięśniowym. Co więcej, analiza przeprowadzona przez Tsudę i współpracowników ² sugerowała, że MSP mogą działać jako ligandy dla receptorów Eph i wyzwalać kaskady sygnalizacyjne kinazy tyrozynowej receptora. Wreszcie, analiza PCR w czasie rzeczywistym potwierdziła, że gen kodujący MSP-32 jest indukowany w mutantach vsm-1 (ok1468). Podsumowując, badania przeprowadzone przez nasze laboratorium wykazały, że mutanty vsm-1 mają znaczny wzrost gęstości synaptycznej, w której może pośredniczyć sygnalizacja MSP-32.

Protocol

1. Izolacja całkowitego RNA

1. Zdrowe zsynchronizowane nicienie zbierano myjąc płytki pożywką M9 o temperaturze pokojowej, używając 2-3 ml na płytkę. Zawieszone nicienie przeniesiono do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i granulowano przez odwirowanie, 3200 g w temperaturze 4 ° C przez 4 minuty. Zebrane nicienie oczyszczono z pływających bakterii poprzez ponowne zawieszenie osadu z 7 ml 0,1 M NaCl i 7 ml lodowatej sacharozy o sile 60% w/v. Zawieszoną mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut, a czyste nicienie, które przepływały przez roztwór sacharozy, zbierano po odwirowaniu mieszaniny w temperaturze 3200 g w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Wolne od bakterii robaki przeniesiono do nowej stożkowej probówki za pomocą sterylnych pipet i dwukrotnie przemyto do 15 ml wody wolnej od RNaz, a następnie odwirowano 3200 g w temperaturze 4°C przez 2 minuty. Czysty, luźno zagęszczony osad przeniesiono do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirowywano z maksymalną prędkością (około 10 000 g) przez 30 sekund. Na koniec usunięto większość wody wolnej od RNaz, a 10 objętości RNAlater dodano do osadu i przechowywano w temperaturze 4°C do momentu przygotowania do kontynuowania.
2. Aby przygotować całkowite próbki RNA, zebrane nicienie odwirowywano z maksymalną prędkością (około 10 000 g) przez 4 minuty, a następnie RNAlater odrzucano. Następnie do granulki dodano szczyptę żywicy do mielenia molekularnego (G bioscience) i mieszaninę zamrożono przy użyciu ciekłego azotu. Zamrożoną zawiesinę robaka mielono na drobny proszek za pomocą tłuczka, a w razie potrzeby dodawano ciekły azot, aby proszek był zimny. Po zmieleniu ekstrakt trzymano na lodzie przez 5 minut, a następnie zmieszano z 700 μl RLT/BME (stosunek 100 objętości RLT do 1 objętości BME) (Qiagen) i 472 μl 100% etanolu.
3. Całkowite RNA wyizolowano przy użyciu RNeasy Mini Kit (Qiagen) i zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Ostateczna objętość wyizolowanego RNA wynosiła 60 μl na próbkę biologiczną.

2. Trawienie DNA i oczyszczanie RNA

1. 50 μg całkowitego RNA potencjalnie zanieczyszczonego genomowym DNA zostało strawione za pomocą DNazy I (Qiagen). Reakcje trawienia zawierające 0,1 U DNazy/1 μg RNA i 1X bufor RDP inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Próbki RNA poddane działaniu DNazy I oczyszczono za pomocą zestawu RNeasy MinElute Clean-Up Kit (Qiagen). Postępowano zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta i uzyskano 60 μl końcowej objętości elucji.

3. Analiza jakościowa i ilościowa RNA

1. Stężenie RNA oznaczono za pomocą spektrofotometru UV Nanodrop (Thermo Scientific).
2. Integralność próbek RNA oceniano za pomocą elektroforezy agarozowej. Krótko mówiąc, 1% żele agarozowe wolne od RNaz przygotowano przy użyciu 1X Northern Max Gly Gel Prep/Running Buffer (Ambion), 1% Agarozy LE (Ambion) i 0,5 μg/ml bromku etydyny. Podczas polimeryzacji żelu próbki RNA poddano glioksylacji poprzez dodanie 5 μl barwnika do ładowania próbki glioksylu / próbkę i inkubację próbek w temperaturze 50°C przez 30 minut. Drabinka RNA została również glioksylowana i załadowana w celu porównania rozmiarów.

4. Synteza cDNA

1. Dla każdej reakcji syntezy próbkę RNA o wielkości 8,4 μg zmieszano z 1 μl startera RT (1 pmol/μl). Jedna próbka (WT lub mutant) otrzymała starter RT do wychwytywania Cy5; druga próbka otrzymała starter Cy3 capture RT (dostarczony z zestawem Array 350 Labeling -Detection Kit, Genisphere). Mieszaniny próbek podgrzewano w temperaturze 75-80°C przez 10 minut i przenoszono do lodu na 2-3 minuty.
2. Podczas inkubacji próbek RNA, MasterMix (Genisphere) został przygotowany w następujący sposób: dla każdej reakcji RT połączyliśmy 4 μl 5X bufora reakcyjnego dla RT, 1 μl dNTP (po 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μl inhibitora RNazy Superase-In (dostarczonego z zestawem Array 350 Labeling-Detection Kit, Genisphere), 1 μl enzymu RT (200 u/μl). Na koniec do każdej próbki RNA dodano 7 μl MasterMixu, delikatnie wymieszano (nie używać wiru) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 42°C.

5. Degradacja i oczyszczanie RNA próbek cDNA

1. Syntezę cDNA zatrzymano przez dodanie 3,5 μl 0,5 M NaOH/50 mM EDTA (stężenie końcowe) i inkubowano w temperaturze 65°C przez 15 minut. Następnie reakcje neutralizowano przy użyciu 1M Tris-HCl, pH 8,0, aby osiągnąć końcowe stężenie 850 mM Tris-HCl. Na koniec WT i zmutowane cDNA połączono w jedną probówkę do mikrowirówki. Pustą probówkę przepłukano 73 μl buforem 1X TE i dodano do probówki zawierającej cDNA; końcowa objętość połączonej probówki cDNA wynosiła 130 μl.
2. Zmieszane cDNA oczyszczono zgodnie z protokołem producenta i zestawem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Uzyskana w ten sposób eluowana objętość oczyszczonego cDNA wynosiła 60 μl.

6. Pierwsza hybrydyzacja mikromacierzy

1. Preparaty mikromacierzy C. elegans uzyskane za pomocą GCAT (Genome Consortium for Active Teaching) zablokowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy użyciu 0,1 mg/ml sonikowanego DNA plemników łososia w 3X SSC, 0,1% SDS. Zablokowane szkiełka przepłukano przez zanurzenie w ddH2O i odwirowano przez wirowanie przez 1 minutę przy 2 000 g w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml z KimWipe na dnie.
2. Następnie bufor hybrydyzacyjny 2X na bazie formamidu (Genisphere) inkubowano w temperaturze 55°C przez 10 minut, dobrze wymieszano w celu rozpuszczenia kryształów i odwirowywano przez 1 minutę w temperaturze 10 000 g. Następnie próbkę cDNA o objętości 25 μl delikatnie wymieszano przez strzepnięcie z 25 μl buforu hybrydyzacyjnego na bazie formamidu 2X. Rozcieńczoną próbkę cDNA pobierano przez błyskawiczne wirowanie przez 15 sekund i inkubowano w temperaturze 80°C przez 10 minut.
3. Na koniec cDNA zhybrydyzowano ze szkiełkiem mikromacierzowym poprzez ostrożne pipetowanie całej podgrzanej próbki cDNA bez dotykania szkiełka. Próbkę równomiernie rozprowadzono na mikromacierzy poprzez delikatne obniżenie szkiełka nakrywkowego za pomocą igły strzykawkowej. Zanim szkiełko nakrywkowe zostało całkowicie opuszczone, szkiełko nakrywkowe zostało ponownie podciągnięte, a następnie ponownie opuszczone za pomocą igły i pozostawione do delikatnego opadnięcia na miejsce, minimalizując tworzenie się pęcherzyków powietrza. Pierwszym punktem kulminacyjnym hybrydyzacji było poziome umieszczenie szkiełka w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 50 μl ddH₂O poniżej szkiełka i inkubacja przez noc w temperaturze 37°C.

7. Druga hybrydyzacja

1. Hybrydyzowane mikromacierze przemyto 2X SSC w różnych temperaturach. Najpierw szkiełka z mikromacierzy przeniesiono do stożkowych probówek zawierających 2X SSC o temperaturze pokojowej i 0,2% SDS, a następnie delikatnie rozpylono w celu usunięcia szkiełek nakrywkowych. Następnie szkiełka z mikromacierzy przeniesiono do stożkowych probówek zawierających 55°C 2X SSC i 0,2% SDS i inkubowano w temperaturze 55°C przez 15 minut. Następnie szkiełka przeniesiono do 2X SSC i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. Na koniec szkiełka przeniesiono do 0,2X SSC i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. Umyte szkiełka suszono wirująco, wprowadzając szkiełka do dołu w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml z KimWipe na dnie i odwirowywano przez 1 minutę przy 2 000 g.
2. Następnie przygotowano drugą mieszaninę hybrydyzacyjną z użyciem buforu hybrydyzacyjnego 2X na bazie formamidu (Genisphere). Bufor hybrydyzacyjny inkubowano w temperaturze 55°C przez 10 minut i odwirowywano przez 1 minutę przy 10 000 g. Wychwytywane odczynniki fluorescencyjne (Cy3 i Cy5) oraz odczynnik zapobiegający blaknięciu rozmrażano w temperaturze pokojowej i przykrywano folią w celu ochrony odczynników przed fotowybielaniem. Następujące etapy hybrydyzacji przeprowadzono w ciemności, aby zminimalizować ekspozycję na światło. 150 μl buforu hybrydyzacyjnego na bazie formamidu 2X połączono z 1,5 μl odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu, aby uzyskać mieszaninę hybrydyzacyjną poddaną działaniu środka zapobiegającego blaknięciu.
3. Wychwytywane odczynniki Cy3 i Cy5 wirowano przez 3 sekundy i odwirowywano przez 15 sekund, 10 000 g. Drugą mieszaninę hybrydyzacyjną przygotowano składając się z 75 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej poddanej działaniu środka zapobiegającego blaknięciu, 60 μl wody wolnej od nukleaz, 7,5 μl odczynnika do wychwytywania Cy3 i 7,5 μl odczynnika do wychwytywania Cy5. Drugą mieszaninę hybrydyzacyjną inkubowano przez 10 minut w temperaturze 75°C, a 50 μl podgrzanej mieszaniny odpipetowano bardzo ostrożnie na umyte/wysuszone szkiełko do mikromacierzy. Aby równomiernie rozprowadzić próbkę na mikromacierzy, szkiełko nakrywkowe zostało delikatnie obniżone za pomocą igły strzykawki. Zanim szkiełko nakrywkowe zostało całkowicie opuszczone, szkiełko nakrywkowe zostało ponownie podciągnięte, a następnie ponownie opuszczone za pomocą igły i pozostawione do delikatnego opadnięcia na miejsce, minimalizując tworzenie się pęcherzyków powietrza. Szkiełko hybrydyzujące z mikromacierzą umieszczono poziomo w stożkowej probówce o pojemności 50 ml pokrytej folią, a pod szkiełko dodano 50 μl ddH₂O, aby utworzyć wilgotną komorę. Drugą hybrydyzację inkubowano w temperaturze 37°C przez 2-5 godzin.
4. Drugą mikromacierz hybrydyzującą umyto w ciemności przy użyciu 2X SSC, 0,2% SDS, 1 mM DTT i delikatnie rozlano w celu usunięcia szkiełka nakrywkowego. Następnie mikromacierz przeniesiono do zakrytej stożkowej probówki zawierającej 55°C 2X SSC, 0,2% SDS, 1 mM DTT i inkubowano przez 15 minut w temperaturze 55°C. Następnie szkiełko przeniesiono do zakrytej stożkowej probówki zawierającej 2X SSC, 1 mM DTT i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając od czasu do czasu. Na koniec szkiełko przeniesiono do 0,2X SSC, 1 mM DTT i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie wstrząsając od czasu do czasu. Szkiełko Microarray suszono przez odwirowywanie przez 1 minutę, 2 000 g, wsunąć etykietą do dołu w zakrytej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z KimWipe na dnie. Suche szkiełka mikromacierzy zostały zeskanowane za pomocą osobistego skanera GenePix model 4100A w Davidson College.

8. Analiza mikromacierzy

1. Obrazy uzyskane po zeskanowaniu zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania MAGICTool opracowanego w Davidson College przez Laurie Heyer i jej studentów studiów licencjackich. Krótko mówiąc, w zakładce "Projekt" został utworzony i zapisany "Nowy projekt". Na karcie "Profil wyrażenia kompilacji" wybrano opcję "Załaduj parę obrazów", a czerwony plik obrazu (_635.tif) został przekazany jako "Czerwony", a zielony plik obrazu (_532.tif) został przekazany jako "Zielony". Następnie, korzystając z zakładki "Build Expression Profile" i "Load Gene List", przesłano plik z listą genów C. elegans uzyskany ze strony internetowej GCAT.
2. Obraz mikromacierzy został rozwiązany i umieszczony w siatce za pomocą zakładki "Build Expression Profile" i opcji "Create/Edit Grid". Okno dialogowe "Ustawienia siatki" było edytowane przy użyciu "48" dla liczby siatek, "22 wierszy" i "22 kolumn" dla każdej siatki, miejsc ponumerowanych "od lewej do prawej" i "od góry do dołu". "Procentowa zmiana kontrastu" została zwiększona i przybliżona na siatce, aż poszczególne punkty były łatwe do odróżnienia. Siatki zostały utworzone poprzez wybranie najpierw opcji "Ustaw lewe górne miejsce" w panelu po lewej stronie. Następnie środek lewego górnego miejsca, prawego górnego punktu i dolnego rzędu został kliknięty na "Siatka 1". Ta procedura siatkowania została powtórzona dla każdej z 48 siatek, przechodząc od lewej do prawej i od góry do dołu. Po zakończeniu tworzenia siatki bieżąca siatka została zapisana w folderze "Plik" "Zapisz bieżącą siatkę jako". Po pomyślnym zapisaniu siatki wybrano zakładkę "Zakończone".
3. W celu wyeliminowania wszelkich niepowiązanych miejsc z analizy została otwarta zakładka "Build Expression Profile". W opcji "Adresowanie siatki" wybrano opcję "Flagowanie punktowe". Smugi lub fluorescencja tła zostały oznaczone i zapisane poprzez wybranie opcji "Zapisz bieżące flagi jako" w zakładce "Plik".
4. Oflagowane pliki zostały podzielone na segmenty przy użyciu karty "Build Expression Profile" i wybraniu opcji "Fixed Radius" jako wybranej metody segmentacji. Promień został ustawiony na żądany rozmiar i kliknięto "Aktualizuj dane". Aby upewnić się, że okrąg pozostaje w obszarze siatki (żółty kwadrat), przewinęliśmy od góry do dołu i od lewej do prawej, a po zaznaczeniu wybrano opcję "Utwórz profil wyrażenia".
5. Podczas segmentacji oprogramowanie obliczyło współczynniki fluorescencji czerwono-zielonej dla każdego z punktów, które pozostały po oflagowaniu. Za pomocą zakładki "Wyrażenie" wybrano "Manipuluj danymi", "Przekształć". Pojawiło się okno dialogowe "Przekształć dane", w którym wprowadzono opcję "logb(x)" i b=2. "Plik wyrażenia roboczego" został zbadany z zakładki "Wyrażenie". W eksperymencie, w którym dziki typ otrzymał sekwencję wychwytywania Cy3 (zieloną), a mutant otrzymał sekwencję wychwytywania Cy5 (czerwoną), wartość współczynników transformacji logarytmicznej była dodatnia dla genów, które zostały indukowane i ujemna dla genów stłumionych.
6. Na koniec przeanalizowano geny indukowane lub tłumione przez określony czynnik, wybierając opcję "Eksploruj" w zakładce "Ekspresja". W oknie dialogowym "Odkrywanie", "Znajdź kryteria dopasowania genów" zostało ustawione na geny o "Maksymalnej wartości > X (liczba dodatnia dla genów indukowanych)" lub "Min. wartość < X (liczba ujemna dla genów stłumionych)" w eksperymentach jak ta opisana w #5. Wyrażenie składania było równe 2x, gdzie "x" jest wartością liczby wprowadzonej w kryteriach wyboru.

9. Synteza cDNA i PCR w czasie rzeczywistym

1. Całkowity RNA wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem. Po określeniu jakości i ilości wyizolowanego RNA, cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu do syntezy cDNA iScript (BioRad), całkowitego RNA 500 ng/μl wyizolowanego z typu dzikiego i zmutowanego oraz zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta.
2. Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu iQ SYBR Green Supermix (BioRad), starterów specyficznych dla genu 100-500 nmoli (tabela 1) i 4 μl cDNA wytworzonych w poprzednim etapie. Reakcje 10 μl przeprowadzono przy użyciu termocyklera CFX96 Real-Time System (BioRad).
3. Termocykler został najpierw podgrzany do 95°C przez 3 minuty. Następnie następował skok w temperaturze 95°C przez 5 sekund i 58°C przez 30 sekund. Pętla ta została ukończona w sumie czterdzieści razy, a także wstawiono krzywą topnienia 65-95°C o nachyleniu 0,5 stopnia. Wartości ΔΔCT obliczono przy użyciu trzech genów porządkowych (act-1, cdc-42 i pmp-3) jako kontroli.

gen PODKŁAD DO PRZODU PODKŁAD ODWROTNY Certyfikat GST-5 CTGCTCCATTCGGACAACTT powiedział: TCCGTTGAGCTTGAACTCAC Certyfikat GST-9 GGAAGACAACTGGCACAATC powiedział: ACCGAGAGCATCAACTTGAG powiedział: KCNL-1 powiedział: TACGCTCGGCATGTGTTGTATC powiedział: CCAATCATCGGCTCCACTATCT powiedział: KSR-2 CGAACTGCTGCTGGAATGCT powiedział: GTGCTGCGTCTCTCTCTCTCTT Lim-9 powiedział: CTCATCGAGTGGCTCAATCT powiedział: CACCTTGCTCCATCTTCAAC powiedział: Aparat fotograficzny LPR-6 CAGCAGTCACTTCTGTTCAC powiedział: TCTCCAATAGCGGTACTCC powiedział: MES-6 powiedział: TTGTTCCGTTGGCTCACGTACAGAG powiedział: CGACAGACGCAGATACACGATCA Przekaźnik MSP-32 GCCGCACAGGTATGATCCAG powiedział: ATCCAATACGGCGAGCCGAG powiedział: Zobacz materiał MSP-142 GATCCACCATGTGGAGTTCT powiedział: GATTCTTGCGACGGACCATA powiedział: Zobacz materiał MSP-38 GCCTTCGGACAAGAGGATACC powiedział: CCATACCGTCTCCTTGGAACC powiedział: Przekaźnik MSP-45 TCACCGTTGAGTGGACCAAT ACGAACCAACCGTCTCCTT powiedział: Przekaźnik MSP-49 CGACGACAAGCACACCTACCACATCAA powiedział: TCGAGGACTCCACATGGTGGATCAACT Przekaźnik MSP-56 CGAAGATCGTCTTCAATGCGCCATAC powiedział: TCCACATGGTGGATCAACTCCAAGTC

Tabela 1. Sekwencje starterów do przodu i do tyłu dla PCR w czasie rzeczywistym

10. Reprezentatywne wyniki:

Izolacja i analiza RNA

Fuzja pęcherzyków prekursorowych strefy aktywnej w miejscach presynaptycznych jest obowiązkowym krokiem podczas synaptogenezy (3). Zaproponowano VSM-1, niedawno zidentyfikowane białko główne v-SNARE, w celu zahamowania fuzji pęcherzyków u drożdży i synaptogenezy u nicieni (patrz ryc. 1) za pomocą nieokreślonego mechanizmu (4 i nasza nieopublikowana praca). Aby lepiej zrozumieć szlak molekularny leżący u podstaw regulacji VSM-1 u nicieni i wnieść trochę światła do pola synaptogenezy, rozpoczęliśmy badanie przesiewowe całego genomu i ustaliliśmy, że główne geny białek plemników (msp) są indukowane przy braku w pełni funkcjonalnego VSM-1.

Aby zbadać geny indukowane w zmutowanym szczepie vsm-1 (ok1468) C. elegans, przeprowadziliśmy analizę genów mikromacierzowych. Dokonano tego poprzez przetestowanie transkryptów wyizolowanych z typu dzikiego i zmutowanego szczepu vsm-1 oraz określenie ich wzbogacenia. W szczególności najpierw wyizolowaliśmy całkowite RNA z synchronicznych nicieni L4 i L3 typu dzikiego i zmutowanych larw vsm-1. Następnie potraktowaliśmy całkowity RNA uzyskany za pomocą DNazy I i zbadaliśmy jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. W eksperymencie pokazanym na rysunku 2 drabina została użyta na pierwszym pasie, aby przedstawić liczbę par zasad dla wzorców. Próbki typu dzikiego poddane wstępnej obróbce i potraktowane po obróbce DNazą I załadowano na tory 2 i 4, a próbki zmutowanych vsm-1 wstępnie poddane obróbce i potraktowane po obróbce DNazą I załadowano odpowiednio na tory 3 i 5. Analiza elektroforezy w żelu RNA wykazała, że próbki RNA typu dzikiego i zmutowane vsm-1 były nienaruszone i dobrej jakości. Ustalono to, obserwując dwa prążki, które reprezentowały dwie podjednostki rybosomalnego RNA.

Hybrydyzacja mikromacierzy

Po ustaleniu jakości RNA, przystąpiliśmy do syntezy cDNA. Aby to zrobić, odwróciliśmy transkrypcję mRNA i dodaliśmy sekwencję wychwytywania do ogona. Wytworzone cDNA zawierające sekwencje wychwytywania dla Cy3 i Cy5 zhybrydyzowano ze szkiełkami mikromacierzy i wysłano do skanowania. Obrazy mikromacierzy zostały następnie wprowadzone do programu komputerowego o nazwie open source o nazwie MAGICTool, opracowanego w Davidson College przez Laurie Heyer i jej studentów. Za pomocą tego oprogramowania nałożyliśmy na siebie obrazy Cy3 i Cy5, mikromacierze siatkowe i przeanalizowaliśmy profile fluorescencyjne (patrz rysunek 3). Po zakończeniu tworzenia siatki podzieliliśmy każdy pojedynczy kwadrat na segmenty, upewniając się, że badany jest cały wydrukowany oligonukleotyd. Następnie przeanalizowaliśmy indukowane proporcje i stworzyliśmy ekspresje profilu genetycznego pokazujące, że geny kodujące rodzinę MSP są indukowane w nicieniach ze zwiększoną synaptogenezą. (Tabela 3).

Walidacja i kwantyfikacja ekspresji genów za pomocą rzeczywistego PCR.

Aby lepiej zrozumieć profil genetyczny mutanta vsm-1, przeanalizowaliśmy kilka genów, które kodują członków rodziny MSP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, całkowite RNA wyizolowano ze zmutowanych szczepów typu dzikiego i vsm-1 (ok1468). Próbki RNA zostały następnie odwrotnie przepisane na cDNA i wykorzystane do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Oceny profili ekspresji PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że jeden z członków rodziny MSP wydaje się być indukowany w mutantach vsm-1 (ok1468). Co więcej, dane PCR w czasie rzeczywistym potwierdzają wyniki mikromacierzy i zawęziły poszukiwania do jednego kandydata na gen msp (Figura 4).

Rysunek 1. A. Barwienie immunologiczne UNC-17 ujawniło, że mutanty vsm-1 wykazują większą gęstość synaptyczną wzdłuż grzbietowego rdzenia nerwowego. Obrazy analizowano w 63-krotnym powiększeniu, z tyłu (po prawej) do sromu. B. Analiza zmutowanych synaps WT i vsm-1 (ok1468) wykazała statystycznie istotną zwiększoną gęstość synaptyczną w mutancie vsm-1 (**p<0,01). Dwadzieścia nicieni było obrazami dla każdego genotypu.

Rysunek 2. Jakość wyekstrahowanego RNA określono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Obecność dwóch nienaruszonych podjednostek rybosomalnych przed i po leczeniu DNazą I była widoczna w RNA wyekstrahowanym z próbek typu dzikiego i vsm-1 (ok1468).

Rysunek 3. A. Obraz mikromacierzy do eksperymentu, w którym kontrola była oznaczona na czerwono (Cy5), a mutant vsm-1 był oznaczony na zielono (Cy3). B. Reprezentatywny obraz przedstawiający 1 z 48 analizowanych siatek dla każdej mikromacierzy. Każdy mały kwadrat na siatce jest reprezentatywny dla pojedynczego wydrukowanego oligonukleotydu, a każda siatka składa się z 22 rzędów i 22 kolumn.

Tabela 2. Analiza mikromacierzy transkryptów wyizolowanych z larw 4 (A) i larw 3 (B) nicienia C. elegans wykazała, że geny kodujące główne białka plemników są indukowane w mutantach ze zwiększoną synaptogenezą. Wyróżnione geny wskazują na geny indukowane zarówno u larw 3, jak i larw 4.

Rysunek 4. Analiza PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że jeden z członków rodziny genów msp, msp-32, był indukowany w mutantach vsm-1 (ok1468). Reprezentatywny znormalizowany wykres ekspresji fałdowania pokazuje, że wartości ΔΔCT vms-1 (ok1468) dla msp-32 różnią się znacząco w porównaniu z typem dzikim (WT), a do normalizacji stosuje się trzy geny porządkowe (act-1, cdc-42 i pmp-3). Średnia z trzech replik jest wykreślana z odchyleniem standardowym +/- .

Discussion

W tym badaniu opracowaliśmy łatwy, przyjazny dla użytkownika protokół, który można wykorzystać do określenia profili ekspresji genów leżących u podstaw różnych zjawisk biologicznych. W tym protokole całkowite RNA zostało najpierw wyizolowane i poddane działaniu DNazy I. Nasza metoda izolacji RNA została znacznie uproszczona poprzez pominięcie ekstrakcji fenolowej i użycie żywic powinowactwa do oczyszczania ^5,6. Krótko mówiąc, naskórek i błony komórkowe C. elegans zostały popękane przez zamrożenie nicieni ciekłym azotem i zmielenie żywicą molekularną. Następnie wyekstrahowane RNA poddano działaniu DNazy I przed syntezą cDNA. Późniejszy krok został dodany w celu zminimalizowania niespecyficznych hybrydyzacji; Próbki RNA zanieczyszczone genomowym DNA mogą wprowadzać interferencję i dawać wiele wyników fałszywie dodatnich. Następnie zmutowane cDNA typu dzikiego i vsm-1 (ok1468) oznaczono sekwencjami wychwytu Cy3 i Cy5 i zhybrydyzowano z mikromacierzami C. elegans uzyskanymi za pomocą programu GCAT. System ten jest bardziej czuły niż podobne produkty, a jego dwukolorowa konstrukcja zmniejsza liczbę potrzebnych tablic, co skutkuje większą oszczędnością czasu i kosztów ^7,8. Dodatkowo system ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu innych podobnych systemów; W związku z tym procedurę tę można przeprowadzić w dowolnym standardowym środowisku laboratoryjnym ⁷. Po trzecie, fluorescencyjne obrazy hybrydyzowanych matryc przeanalizowano za pomocą oprogramowania open source MAGICTool i stworzono profile ekspresji genów. MAGICTool to przyjazny dla użytkownika program, z którego mogą łatwo korzystać osoby na wszystkich poziomach doświadczenia, od studiów licencjackich po podoktoranckie. Jednak optymalna wydajność wymaga dużej dostępności pamięci. Na koniec geny kandydujące uzyskane za pomocą analizy mikromacierzy poddano walidacji za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Chociaż podejście genomiczne jest skuteczną metodą badania zjawisk biologicznych, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, pomimo specyfiki tego protokołu mikromacierzy, transkrypty w rodzinie są nie do odróżnienia od siebie, jeśli wydrukowany oligonukleotyd jest pobierany z konserwatywnych sekwencji. PCR w czasie rzeczywistym kompensuje podobieństwa w obrębie rodziny genów, a nawet może rozróżniać określone izoformy tego samego genu. Jednak w przypadku PCR w czasie rzeczywistym wyzwaniem jest znalezienie prawdziwych kontroli, które są wyrażane równomiernie przez cały okres życia organizmu. Z tego powodu wyniki będą względne. Podejście proteomiczne jest jedną z alternatyw dla naszej techniki. Poszczególne białka mogą być izolowane za pomocą elektroforezy żelowej 2D i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas.

Nasze badania pokazują w szczególności, że wielu członków rodziny głównych białek plemników (MSP) jest indukowanych w zmutowanych nicieniach vsm-1 o zwiększonej gęstości synaptycznej. MSP są unikalne dla C. elegans i są odpowiedzialne za dojrzewanie oocytów i owulację. Chai ¹ wykazał, że regulacja liczby i wielkości presynaptycznych guzów na skrzyżowaniu nerwowo-mięśniowym u muszek owocowych jest prawdopodobnie kontrolowana przez cząsteczki zawierające główne domeny białek plemników. Badania przeprowadzone przez Tsudę i współpracowników ^wykazały, że główne domeny białek plemników mogą służyć jako ligandy dla receptorów efryny, wyzwalając kaskady sygnalizacyjne receptorowej kinazy tyrozynowej. Co więcej, analiza PCR w czasie rzeczywistym zweryfikowała i zawęziła wyniki mikromacierzy do jednego członka rodziny msp, msp-32. Podsumowując, zaprezentowana tutaj praca stanowi analizę całego genomu głównego dylematu neurobiologii, a także siły badań licencjackich w przedsięwzięciu naukowym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Later	Ambion	AM7020
Żywica do mielenia molekularnego	G-Biosciences	786-138
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Agaroza LE	Ambion	AM9040
NorthernMax Gly 10X Żel do przygotowania/biegania	bufor Ambion	8678
RNA Millenium Marker	Ambion	AM7150
Glioksal do ładowania próbki Barwnik	Ambion	8551
Zestaw DNazy	Qiagen	79254
RNeasy MinElute	Qiagen	74204
RT Enzym i 5-krotny bufor reakcyjny	Genisphere	RT300320
Array 350	Genisphere	W300180
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
20X SSC	VWR international	82021-4846
Nasiącenie nasienia łososia DNA	Ambion	AM9680
Rozwiązanie SDS	Promega Corp.	V6551
DTT EM	VWR international	3860
Zestaw do syntezy cDNA iScript	Bio-Rad	170-8890
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad	170-8880