Opisano metodę transferu genów w leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u świń. Nasza prosta i powtarzalna metoda pozwala na łatwą ocenę skuteczności różnych transferów genów w sposób bardzo prosty i odtwarzalny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfer genów w przedklinicznym modelu niedokrwiennej niewydolności serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowywanych jest wiele nowych technologii przeznaczonych dla pacjentów z niewydolnością serca. Niezbędne są rzetelne oceny przedkliniczne w celu określenia ich skuteczności i bezpieczeństwa.
Terapia genowa z wykorzystaniem wektorów wirusowych jest jednym z najbardziej obiecujących podejść w leczeniu chorób serca. Wirusowa dostawa różnych genów poprzez zmianę genu przenoszonego wykazuje ogromny potencjał terapeutyczny.
W tym filmie przedstawiono pełen proces tworzenia zwierzęcego modelu niewydolności serca, a następnie transferu genów z wykorzystaniem modelu świńskiego. W pierwszej kolejności wywołuje się zawał mięśnia sercowego poprzez zamknięcie proksymalnego odcinka lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej. Przebudowa serca prowadzi do przewlekłej niewydolności serca. Charakterystyczną cechą naszego modelu jest stosunkowo obszerna blizna, która wiernie odzwierciedla stan pacjentów z ciężką niewydolnością serca wymagających agresywnej terapii w celu uzyskania pozytywnych rezultatów. Po wywołaniu zawału mięśnia sercowego i wytworzeniu się tkanki bliznowatej zaprezentowano dokoronarną iniekcję wirusa przy jednoczesnej infuzji nitrogliceryny. Nasza metoda iniekcji zapewnia prosty i wydajny transfer genów z wzmocnioną ekspresją genową. To połączenie świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego z dokoronarnym dostarczaniem wirusa okazało się spójną i powtarzalną metodologią, która pomaga nie tylko testować efekt pojedynczego genu, ale także porównywać skuteczność wielu genów jako kandydatów terapeutycznych.
Protokół
1. Wywołanie zawału mięśnia sercowego
- Samicach świń rasy Yorkshire (20kg) z Animal Biotech Industries (Doylestown, PA) stosuje się premedykację z użyciem Telazolu (tiletamina/zolazepam) (8,0 mg/kg) oraz buprenorfiny (0,6 mg).
- Zwierzęta są intubowane, a następnie wentylowane 100% tlenem. Przez cały czas trwania procedury utrzymywana jest narkoza ogólna za pomocą propofolu (5-8mg/kg/hr).
- Miejsce wkłucia w tętnicy udowej jest przygotowywane za pomocą 70% alkoholu izopropylowego, a następnie powidonu jodowego. Dostęp do tętnicy oraz miejsce wprowadzenia pochewki zapewnia punkcja przezskórna. Po wprowadzeniu pochewki podaje się dożylnie 3000-5000 IU heparyny w celu utrzymania aktywnego czasu krzepnięcia na poziomie 250-300 sekund.
- Dawkę bolusową amiodaronu (75 mg) podaje się domięśniowo. Rozpoczęty zostaje i utrzymywany przez cały czas trwania procedury w tempie 150 ml/hr dożylny wlew 1000 ml soli fizjologicznej z amiodaronem (75 mg), atropiną (2 mg) i octanem potasu (20 mEq).
- Cewnik 7 Fr typu hockey-stick (Cordis; Miami, FL) jest wprowadzany do lewej tętnicy wieńcowej, a następnie wykonuje się angiografię wieńcową. Przewodnik 0,014-calowy (Abbott, Park, IL) jest wprowadzany do lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD). Balon VOYAGER typu over-the-wire o długości 8 mm i średnicy 4,0 mm (Abbott, Park, IL) jest wprowadzany i pozycjonowany w proksymalnej części LAD, a następnie balon wieńcowy jest nadmuchiwany do 3 atm. Zamknięcie LAD potwierdza się w angiogramie.
- Przy ciągłym monitorowaniu EKG i parametrów hemodynamicznych zamknięcie jest utrzymywane przez 90 minut. W ciągu pierwszych 40 minut mogą sporadycznie wystąpić złośliwe arytmie komorowe, w takim przypadku natychmiast podaje się defibrylację prądem stałym z energią od 200 J do 300 J. Zazwyczaj występują dwa szczytowe przedziały czasowe arytmii: jeden między 2 a 10 minutą oraz drugi między 25 a 35 minutą po nadmuchaniu balonu. Uważny monitoring i natychmiastowa defibrylacja są kluczowe dla pomyślnego wywołania zawału mięśnia sercowego, ponieważ częstotliwość wystąpienia migotania komór w indicated przedziałach czasowych przekracza 95%. Jeśli przeprowadzona zostanie natychmiastowa i odpowiednia defibrylacja, przeżywalność jest bardzo wysoka. W przypadku spadku ciśnienia tętniczego poniżej 80 mmHg, uzupełnienie objętości odbywa się poprzez szybką dożylną infuzję soli fizjologicznej.
- Balon jest spuszczany, a wszystkie urządzenia usuwane.
- Pochewkę usuwa się z tętnicy udowej, zaprzestaje podawania znieczulenia i monitoruje zwierzę podczas wybudzania. Infuzję soli fizjologicznej z amiodaronem, atropiną i octanem potasu zmniejsza się do 50 ml/hr i podaje przez noc. Podaje się domięśniowo nitroglicerynę i furosemid. Następnie zwierzę przechodzi proces rekonwalescencji, a uważny monitoring EKG jest kontynuowany przez co najmniej 3 godziny.
- Przez pięć dni podaje się doustnie kwas acetylosalicylowy (200mg) PO.
Typowe powikłania występujące w trakcie i po procedurze wywoływania zawału mięśnia sercowego to rozwarstwienie tętnic wieńcowych, krwiak w miejscu nakłucia, arytmia oraz niewydolność serca. Aby zapobiec tym powikłaniom i nimi zarządzać, wymagana jest dopracowana technika oraz dokładny monitoring.
2. Iniekcja wirusa
- Zwierzęta są przygotowywane zgodnie z opisem w krokach 1–3 tworzenia zawału mięśnia sercowego. Należy podać tę samą dawkę heparyny, aby zapobiec zakrzepicy podczas wstrzykiwania wirusa.
- Cewnik typu hockey stick 5Fr (Cordis; Miami, FL) zostaje wprowadzony do lewej tętnicy wieńcowej. Po wykonaniu angiogramu wprowadzane są dwa druty prowadzące o średnicy 0,014 cala, jeden do LAD i jeden do lewej tętnicy okalającej (LCX), aby ustabilizować pozycję cewnika.
- Z cewnika pobiera się krew tętniczą (-20 ml). Aby zapobiec niedokrwieniu podczas infuzji, do roztworu stosuje się krew rozcieńczoną w połowie. Wirus jest mieszany z 10 ml krwi i rozcieńczany solą fizjologiczną do objętości 20 ml. Pozostałe 10 ml jest również rozcieńczane do 20 ml i używane do podania pozostałego wirusa znajdującego się w świetle cewnika.
- Przez żyłę uszną rozpoczyna się podawanie dożylne nitrogliceryny (20 μg/min).
- Koniec cewnika zostaje umieszczony w proksymalnym odcinku lewej tętnicy głównej. Monitoruje się ciśnienie w cewniku, aby upewnić się, że nie doszło do jego zaklinowania.
- Mieszaninę krwi z wirusem (15 ml) wstrzykuje się przez cewnik do lewej tętnicy wieńcowej w czasie 15 minut przy użyciu pompy infuzyjnej. Po 15 minutach strzykawkę wymienia się na roztwór płuczący i kontynuuje infuzję przez 10 minut.
- Drut i cewnik są mocowane w prawej tętnicy wieńcowej w ten sam sposób, co w lewej tętnicy wieńcowej.
- Pozostałe 5 ml krwi zmieszanej z wirusem wstrzykuje się do prawej tętnicy wieńcowej przez 5 minut, a następnie przeprowadza płukanie przez 10 minut.
3. Przypadek reprezentatywny
Rycina 1 przedstawia lewokardiografię w 1. miesiącu po wywołaniu zawału mięśnia sercowego. Ruch ścian lewej komory jest znacznie upośledzony, a frakcja wyrzutowa (EF) wynosi 31%. Rycina 2 przedstawia przekroje poprzeczne lewej komory w 1. miesiącu. Widoczna jest rozległa blizna od podstawy do wierzchołka ściany przedniej. Średnia EF w 1. miesiącu po zawale mięśnia sercowego w tym modelu wynosi 36%, a średnia objętość końcowodorozkurczowa to 83 ml, podczas gdy średnie wartości u zwierząt o tej samej wielkości bez zawału mięśnia sercowego wynoszą odpowiednio 68% i 42 ml. Rycina 3 przedstawia ekspresję beta-gal w strefie przyzawałowej lewej komory 1 miesiąc po wstrzyknięciu wirusa towarzyszącego adenowirusom (2 x 1012 cząsteczek rAAV1 CMV Lac-Z opornych na DNAzę). W obszarze wstrzyknięcia wirusa stwierdzono zwiększoną ekspresję.
Rycina 1. Frakcja wyrzutowa zmierzona w badaniu lewokardioangiografii 1 miesiąc po wywołaniu zawału mięśnia sercowego. Lewa komora jest poszerzona do 92,5 ml, a ruch ściany przedniej jest znacznie upośledzony.
Rycina 2. Przekroje poprzeczne lewej komory 1 miesiąc po wywołaniu zawału mięśnia sercowego, barwione chlorkiem trifenylotetrazolium w celu wyznaczenia obszaru blizny. Widoczna jest rozległa blizna od podstawy do wierzchołka ściany przedniej.
Rycina 3. Ekspresja Beta-gal indukowana przez wirusa towarzyszącego adenowirusom (2 x 1012 cząstek rAAV1 CMV Lac-Z odpornych na DNazę). Zwiększoną ekspresję stwierdzono w strefie granicznej między obszarem zawału a tkanką prawidłową, 1 miesiąc po dokoronarnej iniekcji wirusa. Zdjęcie w prawym dolnym rogu przedstawia kontrolę negatywną, w której do tętnic wieńcowych wstrzyknięto wyłącznie roztwór soli fizjologicznej zgodnie z tym samym protokołem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wśród różnych przyczyn niewydolności serca, niedokrwienie jest zdecydowanie najczęstszym czynnikiem etiologicznym. W celu zwalczania tej poważnej choroby opracowywane są różnorodne podejścia terapeutyczne. Przed zastosowaniem tych obiecujących terapii w praktyce klinicznej niezbędna jest ich staranna ocena. Dlatego ustanowienie modelu niedokrwiennej niewydolności serca, który odzwierciedla stan kliniczny pacjentów, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju metod leczenia niewydolności serca. Opracowany przez nas model zawału mię...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w żadnych związkach handlowych, które mogłyby stanowić konflikt interesów w związku z niniejszym manuskryptem.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana przez Fundację Leducq za pośrednictwem sieci Caerus (RJH) oraz przez NIH w ramach grantów R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 i P20HL100396 (RJH). DL otrzymał wsparcie z Deutsche Forschungsgemeinschaft (Niemiecka Fundacja Badawcza). Chcielibyśmy podziękować Lauren Leonardson za pomoc techniczną przy tym projekcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparyna | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodaron | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Siarczan atropiny | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Octan potasu | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitrogliceryna | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemid) | Intervet Inc. | 710461 | |
| Kaniula typu „hockey stick” 5 Fr | Cordis | 556-278-0L | |
| Kaniula typu „hockey stick” 7 Fr | Cordis | 778-278-00 | |
| Drut koronarny | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Balon koronarny | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| Osłonka 8Fr | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
Bibliografia
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
