Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA) to dwa białka powierzchniowe wirusów grypy, o których wiadomo, że odgrywają one istotną rolę w cyklu życiowym wirusa oraz w indukowaniu ochronnych odpowiedzi immunologicznych1,2. Jako główny cel dla przeciwciał neutralizujących, HA jest obecnie wykorzystywana jako marker mocy szczepionek przeciw grypie i jest mierzona za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji (SRID)3. Jednak zależność metody SRID od dostępności odpowiednich surowic specyficznych dla danego podtypu powoduje co najmniej 2-3 miesięczne opóźnienie w dopuszczeniu każdej nowej szczepionki do obrotu. Co więcej, mimo dowodów na to, że NA również indukuje odporność ochronną4, ilość NA w szczepionkach przeciw grypie nie jest jeszcze standaryzowana ze względu na brak odpowiednich odczynników lub metody analitycznej5. Zatem pożądane są proste, alternatywne metody zdolne do ilościowego oznaczania antygenów HA i NA, które umożliwiłyby szybsze dopuszczenie do obrotu oraz lepszą kontrolę jakości szczepionek przeciw grypie.
Uniwersalnie konserwowane regiony we wszystkich dostępnych sekwencjach HA i NA wirusa grypy typu A zidentyfikowano za pomocą analiz bioinformatycznych6-7. Jedna sekwencja (oznaczona jako Uni-1) została zidentyfikowana w jedynym uniwersalnie konserwowanym epitopie HA, czyli w peptydzie fuzyjnym6, natomiast dwie konserwowane sekwencje zidentyfikowano w neuraminidazach: jedną w pobliżu centrum aktywnego enzymu (oznaczoną jako HCA-2) i drugą w pobliżu N-końca (oznaczoną jako HCA-3)7. Peptydy o tych sekwencjach aminokwasowych zostały zsyntetyzowane i wykorzystane do immunizacji królików w celu produkcji przeciwciał. Przeciwciało przeciwko epitopowi Uni-1 HA było w stanie wiązać się z 13 podtypami HA grypy typu A (H1-H13), podczas gdy przeciwciała przeciwko regionom HCA-2 i HCA-3 NA były zdolne do wiązania wszystkich 9 podtypów NA. Wszystkie przeciwciała wykazały wyjątkową swoistość względem sekwencji wirusowych, co potwierdzono brakiem wykrytej reaktywności krzyżowej z białkami allantoicznymi. Te uniwersalne przeciwciała wykorzystano następnie do opracowania testów slot blot w celu ilościowego oznaczenia HA i NA w szczepionkach przeciwko grypie typu A bez konieczności stosowania specyficznych antyserów7,8. Próbki szczepionek naniesiono na membranę PVDF za pomocą aparatu do slot blotu wraz ze standardami referencyjnymi rozcieńczonymi do różnych stężeń. Do detekcji HA próbki i standard rozcieńczano najpierw w soli buforowanej trisem (TBS) zawierającej 4M mocznika, natomiast do pomiaru NA rozcieczano je w TBS zawierającym 0,01% Zwittergentu, ponieważ warunki te znacząco poprawiły czułość detekcji. Po wykryciu antygenów HA i NA metodą immunoblottingu z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał uniwersalnych, intensywność sygnału określono za pomocą densytometrii. Ilości HA i NA w szczepionkach obliczono następnie przy użyciu krzywej wzorcowej sporządzonej na podstawie intensywności sygnałów dla różnych stężeń wykorzystanych referencji.
Biorąc pod uwagę, że przeciwciała te wiążą się z uniwersalnymi epitopami HA lub NA, zainteresowani badacze mogą wykorzystać je jako narzędzia badawcze w innych analizach immunoenzymatycznych niż tylko slot blot.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników i sprzętu
- Przed rozpoczęciem procedury slot blot przygotować 20_mls 4M roztworu mocznika w soli buforowanej Trisem (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS) dla slot blot hemaglutyniny (HA) lub 20_mls 0,01% roztworu Zwittergentu w TBS dla slot blot neuraminidazy (NA). Podczas gdy 4M mocznik należy przygotowywać na świeżo za każdym razem, 10% roztwór stokowy Zwittergentu w dH2O jest stabilny przez co najmniej 6 miesięcy w temperaturze pokojowej i może być zatem rozcieńczany do stężenia 0,01% w TBS przed każdym badaniem.
- Przygotować 2000 mls buforu płuczącego poprzez dodanie Tween-20 do roztworu TBS do końcowego stężenia 0,1%. Przygotować 80 mls buforu blokującego poprzez rozpuszczenie odtłuszczonego mleka w proszku (mleko w proszku klasy blotting grade) do końcowego stężenia 5% w/v w buforze płuczącym.
- Aktywować membranę PVDF (wstępnie dociętą do rozmiaru 9 x 12 cm) w metanolu przez 15 sekund, a następnie płukać przez 2 minuty w ddH2O. Namoczyć membranę w TBS do momentu użycia. Nawilżyć wstępnie 3 arkusze papieru filtrowanego Bio-Dot SF w TBS do momentu użycia.
2. Przygotowanie próbek szczepionki przeciw grypie oraz standardu odniesienia do analizy HA slot blot
Wzorcowe standardy szczepionki przeciw grypie o wcześniej określonej zawartości HA, odpowiadającej badanym szczepom szczepionkowym, pozyskano z Centre for Biologics Evaluation and Research (CBER/FDA, USA) lub National Institute for Biological Standard and Control (NIBSC, UK) i są one wykorzystywane do oznaczania ilości HA metodą slot blot. Badacze mogą również przygotować własne standardy antygenowe, stosując uznane procedury opisane w referencjach 9 i 10.
- W przypadku antygenów referencyjnych HA i próbek szczepionek testowych: rozcieńczyć zapas antygenu referencyjnego HA w 4M urea/TBS do następujących stężeń: 0, 0,0938, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3 oraz 6 μg HA/ml. Wymieszać dokładnie. Następnie rozcieńczyć w 4M urea/TBS i dokładnie wymieszać próbki szczepionek testowych przeznaczonych do użytku u ludzi, otrzymane od producentów szczepionek lub przygotowane wewnętrznie do celów badań naukowych. Choć dopuszczalne jest wykonanie pomiarów w duplikacie dla antygenu referencyjnego i próbek szczepionek, preferowane są triplikaty. Przygotować 3 rozcieńczenia każdej próbki (z różnicą dwukrotną), aby stężenie próbki mieściło się w zakresie krzywej wzorcowej. Przygotować 450 μl lub 650 μl każdego rozcieńczenia antygenu referencyjnego lub próbki szczepionki testowej w celu wykonania odpowiednio duplikatów lub triplikatów. Za pomocą tej metody slot blot można testować monowalentne szczepionki przeciw grypie A. Zawartość HA w antygenach referencyjnych została wcześniej określona metodą SRID, która jest obecnie stosowanym standardowym testem dla preparatów szczepionek przeciw grypie. Zawartość HA wyznaczoną metodą SRID wykorzystano jako początkowe stężenie zapasu antygenu referencyjnego HA do przygotowania rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej w metodzie slot blot.
3. Przygotowanie próbek szczepionki przeciw grypie i standardu odniesienia do analizy slot blot dla NA
Standardy referencyjne szczepionek przeciw grypie, odpowiadające badanym szczepom szczepionkowym, zostały pozyskane z Centre for Biologics Evaluation and Research (CBER/FDA, USA) lub National Institute for Biological Standard and Control (NIBSC, UK) i są wykorzystywane do ilościowego oznaczania NA metodą slot blot. Zawartość NA w tych próbkach referencyjnych określono za pomocą analizy SDS-PAGE próbek deglikozylowanych w połączeniu z densytometryczną analizą skanowania, zgodnie z wcześniejszym opisem9, z niewielkimi modyfikacjami10. W skrócie, deglikozylowane referencyjne próbki szczepionki (5 μg) zmieszano z buforem do próbek i naniesiono na żel. Żel elektroforezowano przy natężeniu 20 mA przez około 90 min, aż barwnik śledzący niemal całkowicie opuścił żel, a następnie przeprowadzono barwienie Sypro. Ilościowe oznaczanie białek metodą densytometrii wykonano przy użyciu systemu dokumentacji żeli Fluorchem (Alpha Innotech). Ilość NA określono na podstawie stosunku białek NA do całkowitej ilości białek, wyznaczonej metodą Lowry'ego. Próbki referencyjne przygotowane tą metodą mogą być następnie wykorzystane w analizie slot blot do ilościowego oznaczania zawartości NA w próbkach szczepionek otrzymanych od producentów.
- W przypadku antygenów referencyjnych NA i próbek szczepionek testowych: Rozcień zapas antygenu referencyjnego NA w 0,01% Zwittergent/TBS do następujących stężeń: 0, 0,039, 0,078, 0,1562, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 i 10 μg NA/ml. Wymieszaj dokładnie. Następnie rozcieńcz w 0,01% Zwittergent/TBS i dokładnie wymieszaj próbki szczepionek testowych do użytku u ludzi, otrzymane od producentów szczepionek lub przygotowane wewnętrznie do celów badawczych. Dopuszczalne jest wykonywanie pomiarów w duplikacie dla antygenu referencyjnego i próbek szczepionek, jednak preferowane są triplikaty. Przygotuj 3 rozcieńczenia każdej próbki (różnica dwukrotna), aby stężenie próbki mieściło się w zakresie krzywej standardowej. Przygotuj 450 μl lub 650 μl każdego rozcieńczenia antygenu referencyjnego lub próbki szczepionki testowej, odpowiednio dla duplikatów lub triplikatów. Monowalentne szczepionki przeciw grypie A mogą być testowane za pomocą tej metody slot blot.
4. Montaż aparatury do mikrofiltracji Bio-Dot SF i przenoszenie próbek na membranę PVDF
- Złożyć wcześniej oczyszczony i wysuszony aparat do mikrofiltracji Bio-Dot SF. Umieścić płytkę wsporczą uszczelki w kolektorze próżniowym, a na niej położyć uszczelkę uszczelniającą. Na uszczelce umieścić 3 zwilżone arkusze papieru filtracyjnego Bio-Dot SF, a następnie namoczoną wcześniej membranę PVDF. Na wierzchu membrany położyć szablon próbek i dokręcić palcami cztery śruby, stosując schemat krzyżowy, aby zapewnić równomierny nacisk na powierzchnię membrany.
- Przed włączeniem pompy i podłączeniem próżni sprawdzić, czy zawór trójdrożny jest ustawiony tak, aby kolektor próżniowy był wystawiony wyłącznie na źródło próżni.
- Włączyć pompę i podłączyć ją do aparatu Bio-Dot. Upewnić się, że zawór przepływowy znajduje się na poziomie poniżej otworów na próbki, aby zapewnić szybki i prawidłowy odpływ próbek w kolejnych krokach.
- Powtórzyć etap dokręcania śrub, stosując schemat krzyżowy. Dokręcanie śrub podczas przyłożonej próżni zapewnia szczelniejsze zamknięcie i zapobiega zanieczyszczeniom krzyżowym między otworami.
- Zmienić ustawienie zaworu przepływowego, aby wystawić kolektor próżniowy na działanie powietrza, i wyłączyć pompę.
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 100 μl TBS do wszystkich otworów, aby rehydratować membranę, zapewniając tym samym równomierne wiązanie antygenu. Należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza i nanosić roztwór w środku otworu, jak najbliżej dna, aby równomiernie pokryć szczelinę. Ewentualne pęcherzyki powietrza wprowadzone przypadkowo należy przebić końcówką pipety.
- Zmienić ustawienie zaworu przepływowego, aby wystawić kolektor na działanie powietrza i próżni, włączyć pompę i delikatnie odprowadzić bufor z otworów, regulując siłę próżni poprzez przykrycie palcem otworu wystawionego na powietrze.
- Zmienić ustawienie zaworu przepływowego tak, aby wystawić kolektor na działanie powietrza, gdy tylko bufor całkowicie odpłynie ze wszystkich otworów. Wyłączyć pompę lub odłączyć próżnię.
- Nanieść 200 μl każdego rozcieńczenia standardu lub próbki szczepionki do każdego otworu. Próbki pipetować pojedynczo, w centrum każdego otworu, jak najbliżej dna, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki powietrza wprowadzone przypadkowo przebić końcówką pipety. Do nieużywanych otworów wlać 200 μl buforu do rozcieńczania próbek (mocznik 4M/TBS lub 0,01% Zwittergent/TBS), aby zapewnić prawidłową próżnię w otworach wykorzystywanych.
- Ustawić zawór przepływowy tak, aby wystawić kolektor na działanie powietrza i próżni. Włączyć pompę (lub ponownie podłączyć próżnię) i pozwolić próbkom całkowicie odpłynąć z otworów, kontrolując siłę próżni palcem przyłożonym do otworu wystawionego na powietrze. Zdjąć palec z otworu w celu zwolnienia próżni, gdy wszystkie próbki zostaną odprowadzone.
- Natychmiast dodać 200 μl TBS do każdego otworu za pomocą pipety wielokanałowej. Zastosować delikatną próżnię, aby odprowadzić ciecz i przemyć otwory, kontrolując siłę próżni palcem przyłożonym do otworu wystawionego na powietrze.
- Powtórzyć etap płukania opisany w punkcie 4.11. Gdy otwory całkowicie się opróżnią, poluzować śruby szablonu próbek i wyłączyć próżnię, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia otworów. Niezwłocznie przystąpić do wyjęcia membrany.
- Umieścić membranę w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy delikatnym kołysaniu. Użyć wystarczającej ilości buforu blokującego, aby całkowicie pokryć membranę.
5. Immunoblotting antygenów HA i NA
- Po inkubacji nocnej w buforze blokującym, przemyj membranę dwukrotnie przez 5 minut buforem płuczącym TBS/0,1% Tween-20. Podczas wszystkich etapów płukania i inkubacji upewnij się, że membrana jest całkowicie przykryta roztworem.
- Inkubuj membranę z uniwersalnym przeciwciałem króliczym przeciwko HA (np. Uni-1) lub NA (np. HCA-2 lub HCA-3) rozcieńczonym w 5% w/v BSA w buforze płuczącym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu. Optymalne stężenia przeciwciał należy określić dla każdego zapasu przeciwciał. W przypadku wyżej wymienionych przeciwciał optymalne wyniki uzyskano przy rozcieńczeniu anty-serum króliczego 1:4000.
- Przemyj membranę trzy razy w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu przez 15 minut za każdym razem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwotne.
- Inkubuj membranę z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym sprzężonym z HRP. Użyj rozcieńczenia 1:50000 przeciwciała Thermo ImmunoPure Goat anti-rabbit IgG, peroxidase conjugated w buforze blokującym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy delikatnym kołysaniu.
- Przemyj membranę trzy razy, kołysząc przez 15 minut za każdym razem, w temperaturze pokojowej buforem płuczącym, aby usunąć niezwiązane przeciwciała wtórne.
- Przemyj membranę roztworem TBS przez 5 minut przy delikatnym kołysaniu, aby usunąć pozostałości detergentu Tween-20 z powierzchni membrany.
- Przygotuj substrat, mieszając dokładnie 3 ml każdego z odczynników z zestawu Supersignal West Dura Extended Duration Substrate firmy Thermo Scientific.
- Połóż membranę na suchym papierze chłonnym, aby delikatnie usunąć nadmiar buforu TBS.
- Przenieś membranę do suchego pojemnika i dodaj substrat tak, aby pokrył całą membranę. Inkubuj przez 5 minut przy delikatnym kołysaniu w temperaturze pokojowej.
- Usuń nadmiar substratu, delikatnie osuszając membranę na papierze chłonnym.
- Naświetl membranę na filmie chemiluminescencyjnym. Czas ekspozycji będzie wymagał optymalizacji, aby uniknąć saturacji sygnału, ale zazwyczaj mieści się w przedziale od 10 sekund do 10 minut.
- Przeprowadź analizę densytometryczną wywołanego filmu przy użyciu aparatury do obrazowania żeli, takiej jak system dokumentacji żeli Fluorchem (Alpha Innotech), zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wyciąga się średnie wartości gęstości dla każdego zestawu powtórzeń antygenów referencyjnych i próbek szczepionek testowych. Choć standardy antygenów i próbki szczepionek można analizować w duplikacie, preferowane są triplikaty. Wartości gęstości dla powtórzeń powinny być bardzo zbliżone. Znaczące różnice między powtórzeniami wskazują na prawdopodobny błąd techniczny podczas procedury. Krzywą wzorcową zależną od stężenia wykreśla się, nanosząc średnie wartości gęstości względem ilości (w ng) antygenu HA lub NA naniesionego w każdym slocie ze standardu referencyjnego. Zastosowanie odpowiedniego dopasowania krzywej kalibracyjnej w immunoanalizach jest kluczowe dla dokładnego oznaczania ilości HA i NA. Regresja liniowa, uzyskana poprzez wykreślenie odpowiedzi (y) względem stężenia (x) z wykorzystaniem liniowej części krzywej odpowiedzi (y = mx + b), jest najprostszą metodą kwantyfikacji analitów. Jeśli do obliczenia stężenia rozważany jest szerszy zakres analitów, należy zastosować obecnie akceptowany w immunoanalizach model logistyczny czteroparametrowy (4PL). Zainteresowani badacze mają do dyspozycji różnorodne oprogramowanie. W przypadku opisanego testu slot blot, konwersja wartości osi x na skalę logarytmiczną pozwala na dopasowanie krzywej do modelu 4-PL, co umożliwia zastosowanie nieliniowej regresji o zmiennym nachyleniu do obliczenia ilości naniesionego HA i NA w testowanych próbkach szczepionek. Dlatego rutynowo stosujemy ten model w naszych analizach. Ponieważ próbki szczepionek testowych były rozcieńczane w 4M moczniku/TBS lub 0,01% Zwittergent/TBS przed naniesieniem na membranę, należy uwzględnić czynnik rozcieńczenia dla każdej próbki, aby określić zawartość HA i NA w oryginalnych próbkach szczepionek. Sugeruje się, aby każdą próbkę szczepionki testowej analizować w trzech różnych rozcieńczeniach (różnica dwukrotna), tak aby jeden z zestawów wartości gęstości mieścił się w zakresie krzywej wzorcowej. Próbki szczepionek, dla których wartości gęstości we wszystkich testowanych rozcieńczeniach przekraczają zakres krzywej wzorcowej, muszą zostać dodatkowo rozcieńczone w celu dokładnej kwantyfikacji HA lub NA. Jeśli wartości gęstości znajdują się poniżej dolnej granicy krzywej, próbki testowe należy rozcieńczyć z użyciem niższego czynnika rozcieńczenia.
6. Reprezentatywne wyniki:
Analizy bioinformatyczne wszystkich dostępnych sekwencji HA wirusa grypy typu A potwierdziły, że N-koniec podjednostki HA2 (peptyd fuzyjny) jest jedynym konserwowanym regionem HA. Rycina 1 przedstawia stopień konserwacji dla każdej pozycji aminokwasowej zidentyfikowanej sekwencji konsensusowej. W pozycjach 2 (L—>I) i 12 (G—>N) z 14 aminokwasów N-końca HA2 zidentyfikowano dwie zmienności, jednak stwierdzono, że nie wpływają one na wiązanie przeciwciał z wariantami peptydów6. Do opracowania uniwersalnego przeciwciała przeciwko HA wybrano epitop Uni-1 (GLFGAIAGFIEGGW). Przeciwciało to wykazało niezwykłą swoistość względem sekwencji wirusowych i jest zdolne do wiązania się z 13 różnymi podtypami HA wirusa grypy typu A (H1-H13) (Rycina 2).
Stosując podobne podejście, w obrębie wszystkich białek NA wirusa grypy A zidentyfikowano dwie uniwersalnie konserwowane sekwencje: jedną w pobliżu miejsca aktywności enzymatycznej (HCA-2) (Rysunek 3A) oraz drugą na N-końcu (HCA-3) (Rysunek 3B). Peptydy o tych sekwencjach aminokwasowych wykorzystano jako antygeny do wytworzenia uniwersalnych przeciwciał przeciwko NA. Przeciwciała skierowane przeciwko obu epitopom były zdolne do wiązania się ze wszystkimi 9 podtypami NA i wykazywały bardzo niską reaktywność krzyżową z białkami allantoicznymi lub komórkowymi, co świadczy o wysokiej swoistości względem wirusowych sekwencji NA (Rysunek 4).
Rycina 5 przedstawia ogólny schemat metody slot blot służącej do ilościowego oznaczenia HA i NA wirusa grypy.
Przykłady analizy slot blot antygenów HA i NA przedstawiono na rysunkach 6 i 7. Rysunek 6A i 6C pokazuje reprezentatywne wyniki odpowiednio po detekcji antygenu HA w standardzie referencyjnym szczepionki przeciw grypie oraz w próbkach szczepionki. Każda próbka (standard lub szczepionka) była analizowana w dwóch powtórzeniach w sąsiednich dołkach. Powtórzenia powinny wykazywać podobną intensywność po detekcji. W zależności od użytych przeciwciał może być wymagana optymalizacja rozcieńczeń przeciwciał, czasu inkubacji i czasu ekspozycji.
Przykład typowej krzywej wzorcowej uzyskanej po wykryciu różnych stężeń HA z próbki referencyjnej szczepionki przedstawiono na rysunku 6B. Stężenie antygenu HA jest proporcjonalne do natężenia sygnału po detekcji chemiluminescencyjnej w metodzie slot blot i odpowiada modelowi dopasowania krzywej 4-PL dla tego zakresu stężeń (0,0938 do 6 μg HA/ml).
Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne wyniki detekcji antygenu NA w wzorcu odniesienia szczepionki przeciw grypie oraz w próbkach szczepionek. Analiza gęstości wykazała, że intensywność sygnału uzyskanego podczas detekcji antygenu NA w różnych rozcieńczeniach wzorca odniesienia szczepionki metodą slot blot jest proporcjonalna do stężenia NA (Rys. 7A). Otrzymana krzywa wzorcowa pasuje do modelu 4-PL dla tego zakresu stężeń (od 0,039 do 10 μg NA/ml), co przedstawiono na Rysunku 7B. Rysunek 7C pokazuje przykład analizy slot blot zawartości NA w próbkach szczepionki przeciw grypie. Każda próbka była analizowana w dubletach, w sąsiednich dołkach.
Rycina 1. Stopień konserwacji epitopu Uni-1 w regionie peptydu fuzyjnego HA grypy A.
Analizy bioinformatyczne wszystkich dostępnych sekwencji HA grypy A potwierdziły, że peptyd fuzyjny (znajdujący się na N-końcu podjednostki HA2) jest jedynym uniwersalnie konserwowanym regionem HA. Należy zauważyć, że dwie warianty w pozycji 2 (L—>I) i 12 (G—>N) nie wpływały na wiązanie przeciwciał6. Uniwersalne przeciwciało zdolne do wiązania 13 różnych podtypów HA grypy A (H1-H13) zostało opracowane z wykorzystaniem epitopu Uni-1 (GLFGAIAGFIEGGW).
Rycina 2. Wykrywanie 13 podtypów HA za pomocą uniwersalnego przeciwciała przeciwko HA.
Płyny allantoiczne 13 podtypów wirusów grypy A namnożonych w zarodkowych jajach poddano frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE, a następnie wykryto białka HA przy użyciu uniwersalnego przeciwciała przeciwko epitopowi Uni-1 białka HA. Białko NP wykryto jako kontrolę ładowania, stosując królicze poliklonalne przeciwciało specyficzne dla NP. Kontrolą negatywną (-) był płyn allantoiczny z niezakażonych jaj. Kontrolą pozytywną (+) był wzorzec referencyjny H1 z NIBSC, Wielka Brytania.
Rycina 3. Homologia sekwencji neuraminidazy (NA) wirusa grypy A w pobliżu centrum aktywnego enzymu oraz na N-końcu.
Dzięki bioinformatyce zidentyfikowano dwie uniwersalnie konserwowane sekwencje w NA wirusa grypy A: jedną w pobliżu centrum aktywnego enzymu (HCA-2) (Panel A) oraz drugą na N-końcu (HCA-3) (Panel B). Zsyntetyzowano peptydy o tych konserwowanych sekwencjach aminokwasowych i wykorzystano je do wytworzenia uniwersalnych przeciwciał przeciwko NA.
Rycina 4. Wykrywanie 9 podtypów NA za pomocą przeciwciał przeciwko NA.
Płyny alantoiczne dziewięciu podtypów NA wirusów grypy A namnożonych w zarodowanych jajach poddano frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE, a następnie wykryto białka NA przy użyciu przeciwciał HCA-2 (Panel A) i HCA-3 (Panel B). Białko NP wykryto jako kontrolę załadunku, stosując królicze poliklonalne przeciwciało specyficzne dla NP (Panel C). Kontrolą negatywną (-) był płyn alantoiczny z nieinfected jaj. Kontrolą pozytywną (+) był płyn alantoiczny wzbogacony o rNA1 szczepu A/New Caledonia/20/99 i poddany analizie z odpowiednimi antyserami.
Rycina 5. Schemat procedury slot blot do oznaczania ilości antygenów HA i NA w szczepionkach przeciw grypie.
W pierwszej kolejności przygotowuje się bufory niezbędne do rozcieńczania próbek oraz do płukania i blokowania membrany slot blot, a membranę PVDF oraz papiery filtracyjne potrzebne do montażu aparatury do mikrofiltracji Bio-Dot SF poddaje się namaczaniu. Próbki szczepionki przeciw grypie oraz wzorce referencyjne rozcieńcza się w optymalnych buforach do detekcji HA lub NA metodą slot blot. Aparaturę do mikrofiltracji Bio-Dot SF montuje się zgodnie z instrukcją producenta, a następnie nanosi próbki na membranę PVDF. Antygeny HA i NA wykrywa się przy użyciu uniwersalnych przeciwciał przeciwko każdemu z antygenów. W celu oznaczenia ilości HA i NA w badanych próbkach przeprowadza się analizę densytometryczną uzyskanych sygnałów chemiluminescencyjnych.
Rysunek 6. Wykrywanie antygenu HA w próbkach szczepionki przeciw grypie i wzorcu referencyjnym.
Panel A przedstawia reprezentatywny blot uzyskany po immunodetekcji antygenu HA. Antygen HA referencyjny rozcieńczono do stężeń od 0 do 6 μg HA/ml, a szczepionki rozcieńczono do stężenia 0.375 μg HA/ml w 4M urea/TBS przed naniesieniem na membranę PVDF za pomocą aparatu do mikrofiltracji Bio-Dot SF. Następnie antygen HA wykryto przy użyciu uniwersalnego przeciwciała Uni-1. Panel B przedstawia przykład krzywej wzorcowej uzyskanej poprzez detekcję sygnałów dla różnych stężeń HA ze wzorca referencyjnego szczepionki. Intensywność sygnału jest proporcjonalna do stężenia HA, a krzywa odpowiada modelowi 4-PL.
Rycina 7. Wykrywanie antygenu NA w próbkach szczepionki przeciw grypie oraz w wzorcu odniesienia.
Panele A i B przedstawiają reprezentatywne sygnały uzyskane po wykryciu NA we wzorcu odniesienia szczepionki przeciw grypie rozcieńczonym do stężeń NA w zakresie od 0 do 10 μg NA/ml w 0,01% Zwittergent/TBS oraz wynikową krzywą wzorcową 4-PL po analizach densytometrycznych. Przykład typowych sygnałów chemiluminescencyjnych wykrytych po analizie slot blot antygenu NA w próbkach szczepionki przeciw grypie przedstawiono w panelu C. Próbki szczepionki przeciw grypie rozcieńczono do stężenia 1 μg HA/ml w 0,01% Zwittergent/TBS i naniesiono na membranę PVDF przy użyciu aparatu do mikrofiltracji Bio-Dot SF. Na tej samej membranie naniesiono rozcieńczenia odpowiedniego wzorca odniesienia szczepionki, o stężeniach od 0 do 2,5 μg NA/ml, w celu ustalenia krzywej wzorcowej do ilościowego oznaczania antygenu NA w próbkach szczepionki. Antygen NA wykryto za pomocą uniwersalnego przeciwciała HCA-2 przeciwko NA, a następnie przeprowadzono analizę densytometryczną uzyskanych sygnałów chemiluminescencyjnych. Ilość NA w każdej próbce szczepionki można obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej 4-PL, uzyskanej poprzez naniesienie wartości intensywności sygnału w funkcji stężenia NA dla wzorca odniesienia szczepionki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ilościowe oznaczenie wirusowej HA i NA grypy jest kluczowe dla badań i opracowywania szczepionek, ponieważ te dwa białka powierzchniowe są najważniejszymi komponentami wirusa indukującymi odpowiedzi immunologiczne6-11. Wcześniej opisane metody immunologiczne służące do wykrywania tych białek wymagają przeciwciał specyficznych dla danego szczepu. Prosta, powtarzalna i szybka metoda slot blot do ilościowego oznaczenia antygenów HA i NA opisana w niniejszej pracy jest odpowiednia dla wszystkich białek HA i NA wir...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować pani Monice Tocchi za redakcyjną recenzję manuskryptu. AMH otrzymał wsparcie w formie stypendium z King Abdulaziz University za pośrednictwem Biura Kultury Arabii Saudyjskiej w Kanadzie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aparat do mikrofiltracji Bio-Dot SF | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Papier filtracyjny Bio-Dot SF | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Membrana transferowa Immobilon-FL (PVDF) | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Pompa próżniowa | EMD Millipore | WP6111560 | |
| Film do chemiluminescencji BioMax Light | Kodak | 178 8207 | |
| System dokumentacji żeli FluorChem | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Uniwersalne przeciwciała królicze przeciwko antygenom HA i NA | Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) | Przeciwciała są dostępne poprzez MTA lub mogą zostać wytworzone przez zainteresowanych badaczy zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami6,7. | |
| Antygen referencyjny szczepionki przeciw grypie | CBER/FDA lub NIBSC | ||
| Próbki szczepionki przeciw grypie | Powszechnie dostępne w większości krajów | ||
| Mocznik | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Detergent Zwittergent 3-14 | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bloker do blotowania w postaci beztłuszczowego mleka w proszku | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure przeciwciała kozie anty-królicze IgG, (H+L), sprzężone z peroksydazą | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31460 | |
| Substrat SuperSignal West Dura Extended Duration | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34075 |
Bibliografia
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
