Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieinwazyjne podejścia do pobierania próbek genetycznych stają się coraz ważniejsze w badaniu populacji dzikich zwierząt. W wielu badaniach zgłoszono wykorzystanie nieinwazyjnych technik pobierania próbek do analizy genetyki populacyjnej i demografii dzikich populacji1. Podejście to okazało się szczególnie przydatne w przypadku gatunków rzadkich lub trudnych do uchwycenia2. Chociaż opracowano szereg metod pobierania sierści, odchodów i innych materiałów biologicznych od mięsożerców i ssaków średniej wielkości, w dużej mierze pozostały one nietestowane w odniesieniu do trudnych do uchwycenia małych ssaków. W tym filmie prezentujemy nową, niedrogą i nieinwazyjną pułapkę na sierść skierowaną przeciwko trudnemu do uchwycenia małemu ssakowi – pikasowi amerykańskiemu (Ochotona princeps). Opisujemy ogólną konstrukcję pułapki, która składa się z pasków taśmy pakowej rozmieszczonych w formie sieci i umieszczonych wzdłuż szlaków przemieszczania się w siedlisku pikasów. Ilustrujemy skuteczność pułapki w gromadzeniu dużej ilości sierści, która może być następnie zebrana i dostarczona do laboratorium. Następnie demonstrujemy zastosowanie systemu DNA IQ (Promega) do izolacji DNA i pokazujemy użyteczność tej metody w amplifikacji powszechnie stosowanych markerów molekularnych, w tym mikrosatelitów jądrowych, polimorfizmów długości fragmentów amplifikowanych (AFLPs), sekwencji mitochondrialnych (800bp), a także markera do określania płci metodą molekularną. Ogólnie rzecz biorąc, wykazujemy użyteczność tej nowej, nieinwazyjnej pułapki na sierść jako techniki pobierania próbek dla biologów populacyjnych dzikich zwierząt. Przewidujemy, że podejście to będzie możliwe do zastosowania u wielu gatunków małych ssaków, otwierając nowe obszary badań w obrębie populacji naturalnych przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu na badane organizmy.
Protokół
1. Pułapka na włosy
Przed rozstawieniem pułapki należy wyznaczyć optymalną lokalizację w obrębie siedliska piki lub na zboczu piargowym. Obejmuje to kopce siana, będące zgromadzeniami roślinności zbieranymi przez zwierzęta pod koniec lata, a także świeże odchody znalezione w miejscach latryn. Paski taśmy pakowej (o długości 10-50cm) zwija się tak, aby uzyskać klejącą powierzchnię 360°, a następnie rozmieszcza w formie sieci, aby otoczyć wejście do kopca siana (Rys. 1) lub miejsca latryny piki. W zależności od układu skał, do wsparcia struktury pułapki na włosy można użyć żyłki wędkarskiej, choć często nie jest to konieczne, gdy wejścia są bardzo małe (<30cm średnicy); szczegółowy opis zastosowania żyłki wędkarskiej znajduje się w pracy Henry i Russello (2010)3. Pułapki na włosy są sprawdzane tak często, jak to możliwe, a osadzone na taśmie próbki włosów (Rys. 2) są następnie zbierane i etykietowane. Po transporcie do laboratorium włosy są usuwane z klejącej taśmy za pomocą sterylnej pincety, przenoszone do probówek kriogenicznych i przechowywane w temperaturze -20°C do czasu dalszej obróbki. Próbki włosów zgrupowane razem w obrębie jednej pułapki uznaje się za należące do jednego osobnika, natomiast próbki zgrupowane oddzielnie uznaje się za należące do różnych osobników. W tym drugim przypadku włosy umieszcza się w osobnych probówkach. Założenia te mogą zostać później zweryfikowane za pomocą odcisków DNA oraz obliczeń prawdopodobieństwa tożsamości w oparciu o genotypowe dane mikrosatelitarne.
2. Izolacja DNA
Ponieważ włosy piki są bardzo cienkie i posiadają niewielką cebulkę korzenia, wykazaliśmy wcześniej, że do uzyskania wystarczającej ilości DNA dla wysokiej jakości późniejszej amplifikacji PCR wymagane jest minimum 25 włosów3. Użyliśmy systemu DNA IQ (Promega, Madison, WI, USA) oraz nieco zmodyfikowanej wersji instrukcji producenta dotyczącej izolacji DNA z próbek włosów. Najpierw próbkę włosów wirowano w mikrocentry fudze, aby uniknąć utraty włosów podczas otwierania probówki. Następnie przygotowano roztwór inkubacyjny, mieszając 80 μl roztworu inkubacyjnego z 10 μl DTT (1M) i 10 μl Proteinazy K (18ng/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 0.1 M DTT i 1.8ng/ml Proteinazy K. Do próbki dodano roztwór inkubacyjny (100 μl) i inkubowano w temperaturze 56°C przez 1 godzinę. W międzyczasie przygotowano roztwór lizujący, dodając 1 μl DTT (1M) na każde 100 μl buforu lizującego, co dało końcowe stężenie DTT 0.01M. Następnie do próbki dodano przygotowany roztwór lizujący (200 μl) wraz z 7 μl żywicy DNA IQ, mieszano w wortexie przez 3 sekundy z dużą prędkością i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Próbkę wortexowano przez 2 sekundy i umieszczono w statywie magnetycznym, gdzie nastąpiło oddzielenie kulek magnetycznych od roztworu. Pozostały roztwór odessano i usunięto, uważając, aby nie naruszyć osadu żywicy magnetycznej. Próbkę potraktowano następnie 100 μl przygotowanego roztworu lizującego, wortexowano i ponownie umieszczono w statywie magnetycznym do oddzielenia. Bufor lizujący odessano i usunięto, a ten krok powtórzono trzykrotnie, używając buforu płuczącego (100 μl). Następnie próbkę pozostawiono do wyschnięcia w statywie magnetycznym na 15 minut. Po wyschnięciu do próbki dodano 100 μl buforu elucyjnego i inkubowano w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Próbkę wortexowano i umieszczono w statywie magnetycznym. Roztwór zawierający wyeluowane DNA przeniesiono następnie do probówki Eppendorf 1.5 ml i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu dalszych manipulacji. DNA z próbek wątroby również wyekstrahowano za pomocą systemu DNA IQ i wykorzystano jako kontrolę pozytywną dla amplifikacji PCR.
3. Amplifikacja PCR
DNA otrzymany z nieinwazyjnych pułapek na włosy oraz z próbek wątroby wykorzystano następnie do amplifikacji zestawu powszechnie stosowanych markerów molekularnych (mikrosatelitów, AFLP, mitochondrialnego cytochromu B oraz markerów określania płci ZFX/ZFY). Reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu termocyklera Veriti (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) w objętości 25 μL zawierającej: 10 - 20 ng DNA, 0,5 μM każdego z primerów, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 10 μ albuminy surowicy bydlęcej (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) oraz 0,5 U polimerazy DNA AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Parametry cyklowania dla loci mikrosatelitarnych zoptymalizowano za pomocą programu touchdown PCR (10 min w 95°C, 35 cykli: 95°C przez 30 s, 30 s przyłączania, 45 s w 72°C, a następnie etap końcowy w 72°C przez 10 min). Temperatura przyłączania malała o 1°C w każdym cyklu od 60 do 55°C aż do szóstego cyklu, po którym pozostałe 29 cykli odbywało się w temperaturze 55°C. Parametry cyklowania dla fragmentów mitochondrialnych były takie same jak opisane powyżej, jednak składały się z 35 cykli z temperaturą przyłączania 50°C. Analizę polimorfizmu długości fragmentów amplifikowanych (AFLP) przeprowadzono zgodnie z protokołem dla genomów kręgowców opisanym przez Bonina4. Na koniec określono płeć molekularnie, wykorzystując metodę PCR-RFLP loci ZFX/ZFY z trawieniem enzymem restrykcyjnym HinfI5. Produkty PCR z sekwencji mikrosatelitarnych, AFLP i cytochromu B analizowano na analizatorze genetycznym ABI 3130XL (Applied Biosystems), natomiast strawione fragmenty ZFX/ZFY rozdzielono wraz z markerem 100 bp (New England Biolabs) na 3% żelu agarozowym zawierającym 2,5% barwnika do żeli DNA SYBR Safe (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i wizualizowano za pomocą osobistego systemu obrazowania żeli RED (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatelity i AFLP wizualizowano przy użyciu oprogramowania Genemapper v3.7 (Applied Biosystems), a chromatogramy DNA mitochondrialnego analizowano za pomocą Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation, Ann Harbour, MI, USA).
4. Reprezentatywne wyniki
DNA wyizolowane z próbek włosów pobranych za pomocą naszej nieinwazyjnej pułapki z włosowłapem wykorzystano do amplifikacji PCR różnych typów markerów molekularnych. Jako podstawę do porównania, równolegle z próbkami włosów amplifikowano DNA wyizolowane z próbek wątroby. Loci mikrosatelitarne jądrowe zostały pomyślnie amplifikowane zarówno dla próbek włosów, jak i wątroby (Rys. 3). Choć intensywność sygnału była większa w przypadku próbek wątroby, nie miało to negatywnego wpływu na ocenę genotypów (Rys. 3). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu AFLP (Rys. 4), sekwencji mtDNA (Rys. 5) oraz molekularnego markera określania płci ZFX/ZFY (Rys. 6).
Rysunek 1. Przykład nieinwazyjnej pułapki na sierść ustawionej przy stosie siana. Paski zwiniętej przezroczystej taśmy pakowej są rozmieszczone w formie sieci, aby otoczyć wejście do stosu siana. Fragment żyłki wędkarskiej został tutaj użyty w celu zapewnienia dodatkowego wsparcia dla pułapki na sierść.
Rysunek 2. Skuteczna pułapka na sierść zawierająca dużą liczbę włosów przyklejonych do taśmy pakowej.
Rycina 3. Reprezentatywny chromatogram mikrosatelitów jądrowych (Ocp6)8 wyświetlony w programie Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby; w tym locus jest on heterozygotyczny (354/358). Dolny chromatogram reprezentuje innego osobnika wykazującego genotyp heterozygotyczny (358/362) na podstawie DNA wyekstrahowanego z włosa. Mimo że sygnał chromatogramu z próbki włosa ma niższą intensywność niż w próbce z wątroby, ocena genotypu nie jest negatywnie wpływana przez tę różnicę w sygnale.
Rycina 4. Reprezentatywny chromatogram AFLP (E31T32) wyświetlony w programie Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby, natomiast dolny chromatogram przedstawia DNA wyekstrahowane z włosa.
Rycina 5. Reprezentatywny chromatogram sekwencji mitochondrialnego DNA (cytochrom B) wyświetlony w programie Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby, dolny chromatogram przedstawia DNA wyekstrahowane z włosa.
Rycina 6. Reprezentatywny marker molekularny do oznaczania płci (ZFX/ZFY) amplifikowany dla próbek wątroby i włosa. Podejście to opiera się na obserwacji, że chromosom Y posiada w tym regionie miejsce restrykcyjne dla enzymu HinfI, którego brakuje w chromosomie X. W związku z tym u samic powstają dwa współmigrujące fragmenty o wielkości 432 bp, natomiast u samców powstają fragmenty o wielkości 432 bp, 261 bp i 171 bp.
Dyskusja
Nieinwazyjne pobieranie próbek genetycznych stało się atrakcyjną alternatywą dla tradycyjnych metod odłowu żywych zwierząt z kilku powodów. Po pierwsze, dzięki dyskretnemu gromadzeniu materiału biologicznego (np. kału, włosów, piór, śliny i śluzu) z dzikich populacji, badacze mogą studiować te gatunki bez ich płoszenia, chwytania, a nawet obserwowania, co zmniejsza ryzyko zarówno dla zwierząt, jak i badaczy. Po drugie, nieinwazyjne pobieranie próbek genetycznych umożliwia biologom badanie populacji gatunków rzadkich i trudnych do wykrycia, co może okazać się problematyczne przy zastosowaniu bardziej tradycyjnych metod odłowu 6. Po trzecie, NGS może potencjalnie zwiększyć wielkość prób poprzez ograniczenie stresu zwierząt, nakładów pracy przy pobieraniu próbek oraz kosztów, co pomaga minimalizować błędy w szacowaniu parametrów populacyjnych 7. Ten ostatni punkt może okazać się kluczowy w przypadku gatunków zagrożonych, ponieważ błędne szacunki parametrów populacyjnych mogą prowadzić do niewłaściwego zarządzania ochroną.
W niniejszym artykule wideo opisujemy prostą, nową, niedrogą i nieinwazyjną metodę pobierania próbek od trudnych do uchwycenia małych ssaków, posługując się przykładem piki amerykańskiej. Wykazujemy, że DNA wyekstrahowane z sierści wykazuje podobną wydajność co DNA wyekstrahowane z próbek wątroby w odniesieniu do markerów mikrosatelitarnych, AFLP, mitochondrialnych oraz markerów określania płci, co czyni tę nieinwazyjną metodę pobierania próbek atrakcyjną alternatywą dla odłowu żywych osobników lub pobierania próbek metodą letalną. Przewidujemy, że metoda ta będzie użyteczna na etapie gromadzenia danych w badaniach genetyki populacyjnej i behawioralnej rzadkich lub trudnych do uchwycenia gatunków małych ssaków, minimalizując jednocześnie wpływ na badane organizmy.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować L. Evansowi, B. Grangerowi, D. Risslingowi, Z. Simowi, A. Goodwinowi, K. Hayhurstowi oraz D. Kuchowi za pomoc w terenie. K. Galbreath uprzejmie udostępnił próbki wątroby piki z doliny Bella Coola. Dziękujemy A. Gonçalves da Silvie oraz K. Larsenowi za interesujące dyskusje, które przyczyniły się do opracowania tej nieinwazyjnej metody pobierania próbek genetycznych. Praca ta była finansowana z grantów Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery oraz UBC Okanagan Individual Research przyznanych MAR. PH otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktorskiego Swiss National Science Foundation PBSKP3_128523. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Kolumbijskiego w Brytyjskiej Kolumbii (numer certyfikatu: A07-0126).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Pułapka na włosy:
Ekstrakcja DNA:
|
Bibliografia
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
Przedruki i uprawnienia
