Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.
Artykuł metodologiczny
Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Limfocyty T cytotoksyczne (CTL) o optymalnej funkcji efektorowej odgrywają kluczową rolę w zapewnianiu ochrony przed różnymi infekcjami wewnątrzkomórkowymi oraz nowotworami. Jednak u niektórych osób może występować supresyjne mikrośrodowisko immunologiczne i, w przeciwieństwie do aktywacji CTL, ich autologiczne komórki prezentujące antygen mogą dążyć do tolerancji lub anergii swoistych dla antygenu CTL. W rezultacie, choć wciąż znajduje się w fazie eksperymentalnej, adoptywna immunoterapia oparta na CTL stała się obiecującą metodą leczenia różnych schorzeń, takich jak nowotwory i infekcje wirusowe. W pierwszych eksperymentach do leczenia zakażeń CMV (cytomegalowirusem) u pacjentów po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego z niedoborem odporności zastosowano CTL swoiste dla CMV, namnożone ex vivo. Choć u takich pacjentów często występuje zagrażająca życiu wiremia CMV, żaden z pacjentów otrzymujących namnożone CTL nie rozwinął choroby związanej z CMV, co sugeruje, że odporność przeciw CMV została ustanowiona przez adoptywnie przetransferowane CTL1. Obiecujące wyniki zaobserwowano również w przypadku czerniaka, co można rozszerzyć na inne rodzaje nowotworów2.
Choć istnieje wiele sposobów stymulacji i ekspansji ludzkich CTL ex vivo, obecne podejścia są ograniczone przez koszty i bariery techniczne. Na przykład aktualny złoty standard opiera się na wykorzystaniu autologicznych DC. Wymaga to od każdego pacjenta oddania znacznej liczby leukocytów, a ponadto jest bardzo kosztowne i pracochłonne. Co więcej, szczegółowa charakterystyka in vitro CTL ekspandowanych za pomocą DC wykazała, że wykazują one jedynie suboptimalną funkcję efektorową 3.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy wysoce wydajny system oparty na aAPC do ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla CMV w celu immunoterapii adopcyjnej (Rysunek 1). aAPC otrzymano poprzez sprzężenie magnetycznych kulek o rozmiarze komórki z ludzkim dimerem HLA-A2-Ig oraz przeciwciałem anty-CD28mAb4. Po przygotowaniu aAPC można je obciążyć różnymi peptydami zainteresowania, a pozostają one funkcjonalne przez wiele miesięcy. W niniejszym raporcie aAPC obciążono dominującym peptydem CMV, pp65 (NLVPMVATV). Po hodowaniu oczyszczonych ludzkich CTL CD8+ od zdrowego dawcy z aAPC przez jeden tydzień, specyficzność CTL dla CMV może gwałtownie wzrosnąć do poziomu 98% (Rysunek 2), a ich liczba może zostać zwiększona ponad 10 000 razy. Jeśli wymagana jest większa liczba CTL specyficznych dla CMV, dalszą ekspansję można łatwo osiągnąć poprzez powtarzalną stymulację aAPC. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna wykazuje, że rozszerzone komórki posiadają fenotyp efektorowo-pamięciowy i wytwarzają znaczne ilości zarówno TNFα, jak i IFNγ (Rysunek 3).
Protokół
1. Przygotowanie aAPC opartych na HLA-A2-Ig
- Przygotowanie sterylnego buforu boranowego
- Rozpuścić kwas borowy w wodzie do uzyskania stężenia 0.1M. Dostosować pH do wartości 7.0.
- Przefiltrować przez sterylny filtr 0.22μm i przechowywać w temperaturze 4°C.
- Przygotowanie sterylnego buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer)
- Odmierzyć 956ml PBS bez magnezu i wapnia.
- Dodać 30ml ludzkiej surowicy grupy AB.
- Dodać EDTA do końcowego stężenia 2mM.
- Dodać 0.1g azotku sodu.
- Przefiltrować przez sterylny filtr 0.22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C.
- Pobrać 1ml kulek Invitrogen M-450 Epoxy z zapasu, około 400 milionów kulek (liczbę kulek można określić za pomocą hemocytometru), i przenieść do sterylnej szklanej fiolki z nakrętką.
- Umieścić fiolkę przy magnesie Dynal MPC-1; gdy kulki przylgną do ścianki fiolki, usunąć nadsącz poprzez aspirację. Przepłukać kulki raz 1ml buforu boranowego.
- Resuspender kulki w mieszaninie 1ml buforu boranowego, 20 μg dimeru HLA-A2-Ig oraz 20 μg przeciwciała mAb anty-ludzkiego CD28 (Klon 9.3).
- Koniugacja białka z kulkami: umieścić szklaną fiolkę na rotatorze i inkubować w temperaturze 4°C przez 24 godziny.
- Umieścić probówkę w magnesie MPC-1 i usunąć cały bufor boranowy.
- Przepłukać kulki dwukrotnie 1ml buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer).
- Inkubować kulki w 1ml buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer), rotując w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Ponieważ bufor do płukania kulek zawiera ludzką surowicę grupy AB, zablokuje on wszystkie pozostałe miejsca wiązania białek na kulkach.
- Usunąć nadsącz z szklanej fiolki i zastąpić go 1ml świeżego buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer).
2. Kontrola jakości aAPC i ładowania peptydów oraz przechowywanie
- Do probówek FACS dodać ˜5×105 kulek w 100μl buforu płuczącego do FACS, a następnie barwić za pomocą 1μl przeciwciała anti-mouse IgG1-PE (rozpoznającego część Fc HLA-A2-Ig) oraz 1μl przeciwciała anti-mouse IgG2a-FITC (rozpoznającego część Fc mAb anty-CD28). Po 20-minutowym barwieniu w buforze płuczącym do FACS ponownie wypłukać i niezwłocznie odczytać wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego (Rysunek 4).
- Ładowanie peptydów na kulki: wypłukać kulki dwukrotnie w fiolce szklanej w 1ml sterylnego PBS. Resuspendować w 1ml sterylnego PBS, a następnie dodać 10μl peptydu CMV (1mg/ml)
- Policzyć kulki za pomocą hemocytometru i opisać fiolkę datą oraz stężeniem.
- aAPC są gotowe do użycia po co najmniej 3 dniach inkubacji z peptydem w temperaturze 4°C, aby zapewnić wystarczający czas wiązania peptydu z dimerem HLA-A2-Ig. Kulki można przechowywać w temperaturze 4°C, gdzie pozostają funkcjonalne przez co najmniej 6 miesięcy.
3. Izolacja ludzkich CTL
- Pobrać ok. 100ml świeżej krwi obwodowej od zdrowego dawcy dodatniego pod kątem HLA-A2 do 10 probówek BD Sodium Heparin Vacutainer. Należy użyć igły o rozmiarze 21G lub większej, aby zapobiec hemolizie.
- Wirować przy 300xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie usunąć górną warstwę osocza poprzez aspirację. Osocze może być wykorzystane jako suplement do pożywki hodowlanej.
- Zastąpić pobrane osocze sterylnym PBS i przenieść krew do sterylnej kolby hodowlanej T75 lub probówek stożkowych 50ml. Dobrze wymieszać krew z PBS, pipetując ciecz w górę i w dół.
- Po zebraniu całej krwi przygotować cztery dodatkowe probówki stożkowe 50ml i dodać 15ml Ficoll-Paque Plus.
- Powoli nałożyć 30-35ml komórek krwi na wierzch Ficollu w każdej probówce. Należy zachować wyraźną granicę między Ficollm a komórkami krwi.
- Wirować przy 500xg przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyłączyć hamulec i ustawić przyspieszenie na jak najniższą wartość, aby zachować wyraźną granicę między warstwami.
- Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie aspirować warstwę PBMC i zebrać PBMC do nowej probówki stożkowej 50ml. Po zebraniu wszystkich PBMC dodać 30ml PBS i wirować przy 400xg przez 10 min. Odrzucić nadsącz i wyprać jeszcze raz 30ml PBS, aby usunąć resztki Ficollu.
- Przystąpić do izolacji limfocytów T CD8+ przy użyciu zestawu Miltenyi human CD8+ T cell isolation kit zgodnie z protokołem producenta. Zestaw ten zapewnia wysokie wzbogacenie w komórki CD8+ (zazwyczaj >95%) poprzez usuwanie komórek CD8-.
- Policzyć limfocyty T CD8+. Oczekiwana czystość powinna wynosić powyżej 95%. Aby to potwierdzić, należy użyć 2x105 komórek i przeprowadzić analizę FACS CD4/3/8. Pozostałe CTL można wykorzystać natychmiast do stymulacji aAPC swoistej dla antygenu lub zamrozić do późniejszego użycia.
4. System hodowlany in vitro oparty na aAPC
- Przygotowanie pożywki hodowlanej
- Dla 2X pożywki hodowlanej TF (czynnik wzrostu limfocytów T, przygotowany w laboratorium4): pełna pożywka RPMI z dodatkiem 5% autologicznej plazmy dawcy i 8% czynnika wzrostu limfocytów T.
- Autologiczną plazmę dawcy można zastąpić inaktywowaną termicznie ludzką surowicą grupy AB.
- Resuspendować 1 milion CTL w 8 ml 2X pożywki hodowlanej TF oraz 8 ml pełnej pożywki RPMI, dodać 1×106 aAPC i dokładnie wymieszać.
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść komórki na 96-dołkowe płytki hodowlane z dnem w kształcie litery U (160 μl na dołek).
- Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 7 dni. W 4. dniu zasilić komórki, dodając 80 μl/dołek pożywki TF 2X.
- Komórki są gotowe do zbioru w 7. dniu. Po zbiorze przyłożyć komórki do magnesu i usunąć stare aAPC.
- Specyficzność antygenową można określić poprzez barwienie tetramerami zgodnie z protokołem producenta. Barwienie fenotypowe oraz barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych wykonuje się zgodnie z naszym poprzednim badaniem3.
- Zebrane komórki można ponownie wysiać z aAPC w tych samych warunkach. Oczekuje się zwiększenia liczby komórek oraz specyficzności antygenowej po wielokrotnej stymulacji.
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład aAPC po koniugacji HLA A2-Ig i anty-CD28 przedstawiono na rysunku 4. Pomyślna koniugacja białek jest widoczna poprzez wyraźne przesunięcie odpowiadającego im barwienia przeciwciałami. Podczas gdy częstotliwość występowania CTL swoistych dla CMV we krwi obwodowej wynosi zazwyczaj 0,5-1%, po jednym tygodniu stymulacji za pośrednictwem aAPC specyficzność ta może osiągnąć 55-93% (rysunki 2 i 3). Ekspansja CTL swoistych dla antygenu może być bardzo zróżnicowana u różnych dawców, jednak wyniki są powtarzalne u tego samego dawcy. Poprzez ekstrapolację można stwierdzić, że ekspansja komórek swoistych dla CMV może być tysiąckrotnie większa w porównaniu z poziomami prekursorów bezpośrednio ex vivo (dane nie przedstawiono). Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych (rysunek 3) wykazuje, że te wyekspandowane CTL są polifunkcyjne, a nie wyczerpane, po przedłużonej hodowli komórkowej i znaczącej proliferacji.
Rycina 1. Reprezentatywny schemat blokowy ekspansji ex vivo ludzkich CTL oparty na aAPC do immunoterapii adopcyjnej w allogenicznym HSCT
Rysunek 2. Reprezentatywny wynik barwienia tetramerem dla CTL swoistych dla CMV wygenerowanych przez aAPC po jednym tygodniu hodowli
Rysunek 3. Reprezentatywny wynik barwienia wewnątrzkomórkowego cytokin dla CTL specyficznych dla CMV generowanych przez aAPC (specyficzność CMV wyniosła 61%)
Rycina 4. Reprezentatywny wynik barwienia kulek M-450 Epoxy po koniugacji z białkiem, zabarwionych przeciwciałami anti-mouse IgG1-PE i anti-mouse IgG2-FITC
Dyskusja
Opisany tutaj system aAPC jest wydajnym systemem do ekspansji ex vivo ludzkich CTL przeciwko różnorodnym antygenom. Należy zwrócić szczególną uwagę na jakość koniugacji białek oraz równomierny rozkład aAPC i CTL w hodowli na płytce 96-dołkowej. Stosując to podejście, udało nam się prowadzić ekspansję CTL przez ponad 8 tygodni, podczas których zwiększyliśmy liczbę antygenowo swoistych CTL nawet milionkrotnie4. Opracowano różne systemy sztucznych APC wykorzystujące linie komórkowe lub inne platformy bezkomórkowe5; jednak zgodnie z opublikowanymi danymi każdy system posiada unikalny profil w zakresie ekspansji i swoistości, co wspiera różne zastosowania. Co istotne, ponieważ jakość CTL jest równie ważna jak ich ilość, oczekuje się, że polifunkcyjność CMV-swoistych CTL generowanych przez nasz system zapewni wyższą skuteczność przeciwwirusową.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Aaronowi Selyi za pomocne dyskusje. Praca ta była finansowana z grantów NIH AI29575, CA108835 oraz AI077097 dla JS, z grantu pilotażowego z Johns Hopkins Malaria Research Institute oraz z grantu Departamentu Obrony PC 040972 dla M.O.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka Vacutainer (zawierająca heparynę) | BD Biosciences | 367874 | |
| Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T CD8+ | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Invitrogen | 140.11 | |
| Magnes Dynal MPC-1 | Invitrogen | 120-01D | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Pożywka RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Dimer HLA-A2-Ig X | BD Biosciences | 551263 | |
| Tetramer iTAgMHC (HLA-A2-CMV)-PE | Beckman Coulter Inc. | T20099 | |
| Przezroczysta płytka mikrotitracyjna Falcon 96-dołkowa | BD Biosciences | 353077 | |
| Przeciwciało szczurze anty-mysie IgG2a-FITC | BD Biosciences | 553390 | |
| Przeciwciało kozie anty-mysie IgG1-PE | Invitrogen | P21129 | |
| Ludzka surowica grupy AB | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8a-FITC | Sigma-Aldrich | F0772 | |
| Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8a-APC | BD Biosciences | 340684 | |
| Przeciwciało mysie anty-ludzkie IFNγ-FITC | BD Biosciences | 340449 | |
| Przeciwciało mysie anty-ludzkie TNFα-PE | BD Biosciences | 340512 |
Bibliografia
- Walter, E. A. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).
- Rosenberg, S. A. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).
- Oelke, M. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat Med. 9, 619-619 (2003).
- Oelke, M. Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases. Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).
Przedruki i uprawnienia
