Sztuczne komórki prezentujące antygen na bazie HLA-IG do efektywnej ekspansji ex vivo ludzkiego CTL

Summary

Opisana jest nowa, niezależna od DC metoda indukcji i ekspansji limfocytów T specyficznych dla antygenu. Sztuczne komórki prezentujące antygen na bazie HLA A2-Ig (aAPC) są obciążone peptydami z ograniczeniami HLA-A2, aby skutecznie rozszerzać CTL o zróżnicowanej swoistości antygenowej. Technologia ta ma ogromny potencjał w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Abstract

CTL z optymalną funkcją efektora odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w ochronie przed różnymi infekcjami wewnątrzkomórkowymi i rakiem. Jednak osoby mogą wykazywać supresyjne mikrośrodowisko immunologiczne i, w przeciwieństwie do aktywacji CTL, ich autologiczne komórki prezentujące antygen mogą mieć tendencję do tolerowania lub anergizacji CTL specyficznego dla antygenu. W rezultacie, choć wciąż w fazie eksperymentalnej, immunoterapia adoptywna oparta na CTL ewoluowała, stając się obiecującym sposobem leczenia różnych chorób, takich jak rak i infekcje wirusowe. We wstępnych eksperymentach ekspandowany ex vivo wirus CMV (cytomegalia) specyficzny dla wirusa cytomegalii CTL stosowano w leczeniu zakażenia CMV u pacjentów po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego z obniżoną odpornością. Chociaż często występuje zagrażająca życiu wiremia CMV u tych pacjentów, u żadnego z pacjentów otrzymujących rozszerzoną CTL nie rozwija się choroba związana z CMV, co sugeruje, że odporność anty-CMV jest tworzona przez adoptywnie przenoszony CTL¹. Obiecujące wyniki zaobserwowano również w przypadku czerniaka i mogą one zostać rozszerzone na inne rodzaje raka².

Chociaż istnieje wiele sposobów na stymulację ex vivo i rozszerzenie ludzkiego CTL, obecne podejścia są ograniczone przez koszty i ograniczenia techniczne. Na przykład obecny złoty standard opiera się na wykorzystaniu autologicznego prądu stałego. Wymaga to od każdego pacjenta oddania znacznej liczby leukocytów, a także jest bardzo kosztowne i pracochłonne. Co więcej, szczegółowa charakterystyka in vitro rozszerzonego DC CTL ujawniła, że mają one tylko nieoptymalną funkcję efektorową ³.

Tutaj prezentujemy wysoce wydajny system oparty na aAPC do ekspansji ex vivo ludzkiego CTL specyficznego dla CMV dla immunoterapii adoptywnej (Rysunek 1). aAPC wykonano przez sprzężenie kulek magnetycznych wielkości komórki z ludzkim dimerem HLA-A2-Ig i anty-CD28mAb⁴. Po wytworzeniu aAPC można je załadować różnymi interesującymi peptydami i zachować funkcjonalność przez wiele miesięcy. W tym raporcie aAPC zostały załadowane dominującym peptydem z CMV, pp65 (NLVPMVATV). Po wyhodowaniu oczyszczonego ludzkiego CD8 ⁺ CTL od zdrowego dawcy z aAPC przez tydzień, swoisty CTL swoisty dla CMV można znacznie zwiększyć swoistość do 98% (ryc. 2) i wzmocnić ponad 10 000 razy. Jeśli wymagana jest większa liczba CTL specyficznych dla CMV, dalszą ekspansję można łatwo osiągnąć poprzez powtarzającą się stymulację za pomocą aAPC. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna pokazuje, że te rozszerzone komórki mają fenotyp pamięci efektorowej i wytwarzają znaczne ilości zarówno TNFα, jak i IFNγ (Figura 3).

Protocol

1. Wytwarzanie, APC na bazie HLA-A2-Ig

1. Przygotować sterylny bufor boranowy
   1. Rozpuść kwas borowy w wodzie, aby uzyskać 0,1 M. Dostosuj pH do 7,0.
   2. Przefiltruj przez sterylny filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4°C.
2. Przygotuj sterylny bufor do płukania koralików
   1. Weź 956 ml PBS bez magnezu i wapnia.
   2. Dodaj 30 ml ludzkiej surowicy AB.
   3. Dodaj EDTA 2mM stężenie końcowe.
   4. Dodać 0,1 g azydku sodu.
   5. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C.
3. Weź 1 ml kulek epoksydowych Invitrogen M-450 z magazynu, około 400 milionów kulek (kulki można policzyć za pomocą hemocytometru) i umieść w sterylnej, zakręcanej szklanej fiolce.
4. Przyłożyć fiolkę do magnesu Dynal MPC-1, podczas gdy kulki przylegają do boku fiolki, usunąć supernatant przez aspirację. Umyj koraliki raz 1 ml buforu boranowego.
5. Ponownie zawiesić kulki w mieszaninie 1 ml buforu boranowego i 20 μg dimeru HLA-A2-Ig oraz 20 μg anty-ludzkiego mAb CD28 (klon 9.3).
6. Koniugacja białka z kulką: umieścić szklaną fiolkę na rotatorze i obracać w temperaturze 4°C przez 24 godziny.
7. Umieść probówkę w magnesie MPC-1 i usuń cały bufor boranowy.
8. Umyj koraliki dwukrotnie za pomocą 1 ml bufora do płukania koralików.
9. Inkubować kulki w 1 ml buforu do płukania koralików, obracać w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Ponieważ bufor Bead Wash zawiera ludzką surowicę AB, zablokuje wszystkie resztkowe miejsca wiązania białek na kulkach.
10. Usunąć supernatant ze szklanej fiolki i zastąpić go 1 ml świeżego buforu do płukania kulek.

2. Kontrola jakości ładowania APC i peptydów, przechowywania

1. Dodaj ̃5×10⁵ kulek do 100 μl buforu myjącego FACS w probówkach FACS i zabarwić 1 μl anty-mysiego IgG1-PE (rozpoznaj część Fc HLA-A2-Ig) i 1 μl anty-mysiej IgG2a-FITC (rozpoznaj część Fc mAb anty-CD28). Po barwieniu przez 20 minut w buforze płuczącym FACS ponownie przemyć i natychmiast odczytać wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego (rysunek 4).
2. Ładowanie peptydów na kulki: umyj kulki dwukrotnie w szklanej fiolce z 1 ml sterylnego PBS. Zawiesić za pomocą 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodać 10 μl peptydu CMV (1 mg / ml)
3. Policz kulki za pomocą hemocytometru i oznacz fiolkę datą i stężeniem.
4. aAPC są gotowe do użycia po co najmniej 3 dniach inkubacji peptydów w temperaturze 4°C, aby zapewnić wystarczający czas wiązania peptydu z dimerem HLA-A2-Ig. Koraliki mogą być przechowywane w temperaturze 4°C i pozostają sprawne przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Izolacja CTL człowieka

1. Pobrać 100 ml świeżej krwi obwodowej od zdrowego dawcy z dodatnim wynikiem testu HLA-A2 do 10 probówek BD z heparyną sodową Vacutainer. Użyj igły o rozmiarze 21 lub większej, aby zapobiec hemolizie.
2. Wirować przy 300xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej
3. Ostrożnie usuń górną warstwę plazmy przez aspirację. Osocze może być stosowane jako uzupełnienie pożywki hodowlanej.
4. Zastąp pobrane osocze sterylnym PBS i przenieś krew do sterylnej kolby hodowlanej T75 lub stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj krew z PBS, pipetując w górę iw dół.
5. Po zebraniu całej krwi przygotuj cztery dodatkowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml Ficoll-Paque Plus.
6. Powoli nałóż 30-35 ml komórek krwi na wierzch Ficollu każdej probówki. Utrzymuj interfejs oddzielony między Ficollem a komórkami krwi.
7. Wirować przy 500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyłącz hamulec, a przyspieszenie tak nisko, jak to możliwe, aby zachować wyraźny interfejs między warstwami.
8. Za pomocą pipety seriologicznej ostrożnie odessać warstwę PBMC i zebrać PBMC do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Gdy wszystkie PBMC zostaną zebrane, dodaj 30 ml PBS i wiruj w temperaturze 400 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i przemyć jeszcze raz 30 ml PBS, aby usunąć wszystkie pozostałości Ficollu.
9. Przejdź do izolacji limfocytów T CD8 ⁺ za pomocą zestawu do izolacji ludzkich limfocytów T CD8 ⁺ Miltenyi zgodnie z protokołem producenta. Ten zestaw znacznie wzbogaca komórki CD8 ⁺ (zwykle >95%) poprzez zubożenie komórek CD8^.
10. Policz limfocyty T CD8 ⁺. Oczekiwana czystość powinna być większa niż 95%. Aby to potwierdzić, użyj^{2x10 5} komórek i wykonaj analizę FACS CD4/3/8. Pozostałe CTL mogą być albo wykorzystane od razu do stymulacji aAPC specyficznej dla antygenu, albo mogą zostać zamrożone do wykorzystania w przyszłości.

4. System hodowli in vitro oparty na aAPC

1. Przygotuj pożywkę hodowlaną
   1. Dla TF (czynnik wzrostu komórek T, wyprodukowany w laboratorium⁴) Pożywka hodowlana 2X: kompletna pożywka RPMI plus 5% autologicznego osocza dawcy i 8% czynnika wzrostu komórek T.
   2. Autologiczne osocze dawcy można zastąpić inaktywowaną termicznie ludzką surowicą AB.
2. Ponownie zawiesić 1 milion CTL w 8 ml pożywki hodowlanej TF 2X plus 8 ml kompletnej pożywki RPMI, dodać 1×10⁶ aAPC, dobrze wymieszać.
3. Użyj pipetera wielokanałowego, aby umieścić komórki na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych na dnie U. (160 μl na studzienkę)
4. Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% CO_{2 przez} 7 dni. Nakarm komórki w 4 dniu 80 μl/studzienkę TF 2X podłoże.
5. Komórki są gotowe do pobrania w 7 dniu. Po zbiorach przyłóż ogniwa do magnesu i wyjmij stary APC.
6. Swoistość antygenu można określić za pomocą barwienia tetramerem zgodnie z protokołem producenta. Barwienie fenotypem i barwienie cytokiny wewnątrzkomórkowej przeprowadza się zgodnie z naszym poprzednim badaniem³.
7. Pobrane komórki można ponownie pokryć aAPC w tych samych warunkach. Oczekuje się, że liczba komórek i swoistość antygenu wzrosną po wielokrotnej stymulacji.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład aAPC po HLA A2-Ig i koniugacji anty-CD28 jest pokazany na rysunku 4. Udana koniugacja białek jest widoczna po wyraźnym przesunięciu odpowiedniego barwienia przeciwciał. Podczas gdy częstość występowania CTL swoistego dla CMV we krwi obwodowej wynosi zwykle 0,5-1%, po jednym tygodniu stymulacji za pośrednictwem aAPC swoistość może osiągnąć 55-93% (ryc. 2 i 3). Ekspansja CTL swoistej dla antygenu może być bardzo zmienna u różnych dawców, ale wyniki są powtarzalne w obrębie tego samego dawcy. Ekstrapolując, ekspansja komórek specyficznych dla CMV może być tysiące razy większa w porównaniu z poziomami prekursorów bezpośrednio ex vivo (dane nie pokazane). Barwienie cytokiny wewnątrzkomórkowej (ryc. 3) pokazuje, że te rozszerzone CTL są raczej wielofunkcyjne niż wyczerpane po długotrwałej hodowli komórkowej i znacznej proliferacji.

Rysunek 1. Reprezentatywny schemat blokowy ekspansji ex vivo ludzkiej CTL opartej na aAPC do immunoterapii adoptywnej w allogenicznym HSCT

Rysunek 2. Reprezentatywny wynik barwienia tetramerami CTL specyficznego dla CMV wygenerowanego przez aAPC po tygodniu posiewu

Rysunek 3. Reprezentatywny wynik barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi CTL specyficznego dla CMV generowanego przez aAPC (swoistość CMV wynosiła 61%)

Rysunek 4. Reprezentatywny wynik barwienia kulek epoksydowych M-450 po koniugacji białek wybarwionych anty-mysim IgG1-PE i anty-mysim IgG2-FITC

Discussion

Opisywany przez nas system aAPC jest skutecznym systemem do ekspansji ex vivo ludzkiego CTL przeciwko różnym antygenom. Szczególną uwagę należy zwrócić na jakość koniugacji białek i równomierne rozmieszczenie aAPC i CTL w 96-dołkowej hodowli płytkowej. Stosując to podejście, byliśmy w stanie rozszerzyć CTL przez ponad 8 tygodni, podczas których rozszerzyliśmy CTL specyficzny dla antygenu do miliona razy⁴. Istnieją różne sztuczne systemy APC wykorzystujące linie komórkowe lub inne platformy bezkomórkowe⁵; Z opublikowanych danych wynika jednak, że każdy system ma swój unikalny profil pod względem rozbudowy i specyfiki obsługi różnych aplikacji. Co ważne, ponieważ jakość CTL jest równie ważna jak ilość, oczekuje się, że wielofunkcyjność CTL specyficznej dla CMV generowanej przez nasz system zapewni wyższą skuteczność przeciwwirusową.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka próżniowa (zawiera heparynę)	BD Biosciences	367874
Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T CD8+	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Żywica epoksydowa	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, firmy Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
tetramer iTAgMHC (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon przezroczysta 96-dołkowa płytka mikrotestowa	BD Biosciences	353077
Szczur anty-mysi IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Kozia anty-mysia IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Surowica ludzka typu AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mysz anty-ludzka CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mysz anty-ludzka CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mysz anty-ludzka IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mysz anty-ludzka TNFα-PE	BD Biosciences	340512