Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji specyficznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacji epigenetycznych histonów i DNA, które są istotne dla regeneracji uszkodzonych aksonów zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Streszczenie

Aksony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nie regenerują się, podczas gdy aksony w obwodowym układzie nerwowym (OUN) regenerują się w ograniczonym stopniu po urazie (Teng et al., 2006). Przyjmuje się, że programy transkrypcyjne niezbędne do wzrostu neurytów i aksonów ulegają reaktywacji po urazie w OUN (Makwana et al., 2005). Jednakże narzędzia dostępne do analizy regulacji genów neuronalnych in vivo są ograniczone i często stanowią wyzwanie.

Zwoje rdzeniowe tylne (DRG) stanowią doskonały model systemu uszkodzeń, ponieważ zarówno OUN, jak i OUN są unerwione przez rozgałęziony akson pochodzący z tego samego somy. Zwoje te reprezentują wydzieloną grupę ciał komórkowych, w których zachodzą wszystkie zdarzenia transkrypcyjne, zapewniając tym samym wyraźnie zdefiniowany obszar aktywności transkrypcyjnej, który można w łatwy i powtarzalny sposób usunąć z organizmu zwierzęcia. Uszkodzenie włókien nerwowych w OUN (np. nerwu kulszowego), gdzie zachodzi regeneracja aksonalna, powinno ujawnić zestaw programów transkrypcyjnych odmiennych od tych odpowiadających na podobne uszkodzenie w OUN, gdzie regeneracja nie ma miejsca (np. w rdzeniu kręgowym). Miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacje histonów i DNA wynikające z uszkodzenia OUN lub OUN można scharakteryzować za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).

W niniejszej pracy opisujemy protokół ChIP z wykorzystaniem utrwalonej tkanki zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy po urazie aksonalnym. To potężne połączenie metod umożliwia charakterystykę pro-regeneracyjnego środowiska chromatyny niezbędnego do promowania regeneracji aksonów.

Protokół

1. Uszkodzenie nerwu kulszowego i tylnych sznurów rdzenia kręgowego

1. Zwierzę umieszcza się na ręczniku chirurgicznym, pod którym przez cały czas trwania procedury znajduje się mata grzewcza, utrzymująca temperaturę ciała myszy na poziomie 37°C. Wszystkie zwierzęta są znieczulane do zabiegu poprzez ciągłą administrację izofluranu/O₂. Instrumenty chirurgiczne są autoklawowane przed rozpoczęciem procedury.
2. W przypadku urazu nerwu kulszowego, obie tylne kończyny są dokładnie golone, a depilacja jest dopełniana za pomocą ogólnego preparatu do usuwania włosów przed oczyszczeniem skóry alkoholem, a następnie trzykrotnym przemyciem Betadynem.
3. Nerw kulszowy zostaje odsłonięty poprzez wykonanie 4 mm nacięcia skóry w połowie uda, z tyłu i równolegle do kości udowej, oraz przez rozsuniecie mięśni biceps femoris za pomocą precyzyjnej pęsety.
4. Następnie odsłonięty nerw kulszowy zostaje uszkodzony, a skóra zamknięta za pomocą dwóch klamer chirurgicznych.

UWAGA: W celu wykonania procedury pozorowanej (sham injury) wykonuje się to samo cięcie, aby odsłonić nerw kulszowy, jednak ranę zaszywa się, pozostawiając nerw nienaruszonym.

5. W przypadku uszkodzenia słupów tylnych, plecy myszy są ostrożnie golone, a depilację kończy się za pomocą ogólnego preparatu do usuwania owłosienia przed oczyszczeniem skóry sprayem lub gazikiem nasączonym alkoholem.
6. Rdzeń kręgowy zostaje odsłonięty poprzez wykonanie nacięcia o długości 2,5 cm od poziomu ok. T7 do T13. Skóra jest rozszerzana, a tkanka łączna usuwana wzdłuż kręgów od T9 do T11.
7. Na poziomie T10 wykonuje się laminektomię.

UWAGA: W większości eksperymentów laminektomię uznaje się za uraz pozorowany (Sham).

8. Do tkanki dodaje się kilka kropli ksylokainy w celu znieczulenia rdzenia, a następnie usuwa oponę twardą, dbając o to, aby nie dotknąć rdzenia kręgowego.
9. Następnie uszkadza się słup tylny i zaszywa mięśnie, ponownie dbając o to, by nie dotknąć rdzenia kręgowego. Na koniec skórę zamyka się za pomocą klipsów chirurgicznych. Buprenorfinę (0.1 mg/kg masy ciała) należy podawać dwa razy dziennie przez 48 h lub do momentu, gdy nie będzie już potrzebna.

2. Sieciowanie

1. Po eutanazji myszy z uszkodzeniami wypreparować zwoje grzbietowe (DRG) L4 i L5. Zebrać łącznie 16 DRG do lodowatego roztworu HBSS z koktajlem inhibitorów proteaz (po 2 DRG uszkodzonych i 2 DRG z grupy kontrolnej sham od każdego zwierzęcia, łącznie z 4 zwierząt).
2. Krótko odwirować DRG, a następnie ostrożnie usunąć HBSS i dodać 500 μl 1% formaldehydu w PBS z koktajlem inhibitorów proteaz; inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37°C.

KROK KRYTYCZNY. Należy użyć świeżego formaldehydu klasy do biologii molekularnej.

3. Dodaj 125 mM glicyny, aby przerwać utrwalanie, i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Krótko odwiruj, odessij bufor i przemyj tkankę dwukrotnie 500 μl schłodzonego do temperatury lodowej PBS + koktajlem inhibitorów proteaz.

3. Przygotowanie jąder komórkowych i fragmentacja chromatyny

1. Odssać PBS, dodać 400 μl buforu lizującego z SDS, przenieść do schłodzonej rurki do mikrowirówki i rozbić tkankę, wykonując około 30 ruchów mikropestle.

KROK KRYTYCZNY. Lizą i rozbicie tkanki są niezbędne dla uzyskania dobrej wydajności sieciowanej chromatyny.

2. Poddaj próbkę sonikacji, stosując 8 impulsów po 10 sekund każdy, przy mocy 70% (Bandelin, Sonoplus GM70).

OSTROŻNIE. Stopień ścinania chromatyny musi zostać zoptymalizowany dla konkretnej konfiguracji sonikacji, a prawidłową fragmentację chromatyny należy sprawdzić przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu IP (patrz sekcja 3).

UWAGA. Fragmentację chromatyny można również przeprowadzić poprzez trawienie nukleazą mikrokokkalną (MNase). Co do zasady, fragmentacja przez sonikację jest preferowana dla utrwalonych tkanek, natomiast trawienie MNase jest wskazane dla immunoprecypitacji chromatyny z natywnych tkanek. Sieciowana, pofragmentowana chromatyna może być przechowywana w temperaturze -80° C do 2 miesięcy, jednak należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i odmrażania.

4. Analiza trawienia chromatyny (rekomendowana)

1. Pobrać 10 μl próbki rozciętej chromatyny do analizy. Dodać do próbki NaCl do stężenia 200 mM i odwrócić sieciowanie poprzez inkubację w temperaturze 65° C przez 2h.
2. Oczyścić DNA (patrz sekcja 8) i przeprowadzić elektroforezę na 1% żelu agarozowym. DNA powinno być pofragmentowane do długości około 200-1000 bp (Rysunek 1).

UWAGA. Nadmierna fragmentacja chromatyny może prowadzić do osłabienia sygnału, natomiast niepełna fragmentacja spowoduje obniżenie rozdzielczości i zwiększenie tła.

5. Immunoprecypitacja

1. Wyznaczyć liczbę reakcji immunoprecypitacji (patrz UWAGA poniżej) i równomiernie podzielić próbki do nowych probówek. Uzupełnić objętość każdej z nich do 500 μl za pomocą buforu ChIP + koktajlu inhibitorów proteaz.
2. Pobrać 5 μl rozcieńczonej próbki i przenieść do nowej probówki. Jest to próbka wejściowa (input) 1%, którą należy przechowywać w temperaturze -20° C do czasu wykorzystania (Sekcja 7).
3. Do każdej immunoprecypitacji dodać odpowiednie przeciwciało lub kontrolę w postaci normalnego IgG i inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy stałym mieszaniu rotacyjnym.

UWAGA. Podczas określania liczby immunoprecypitacji należy uwzględnić kontrolę dodatnią (np. przeciwciało przeciwko histonie H3) oraz kontrolę ujemną (normalna IgG). Ilość przeciwciała wykorzystywana do każdego IP różni się w zależności od przeciwciała i musi zostać określona empirycznie. Zazwyczaj mieści się ona jednak w zakresie 2-10 ?g/immunoprecypitacja.

4. Aby przeprowadzić immunoprecypitację kompleksu przeciwciało/białko/DNA, dodaj 30 μl magnetycznych kulek Protein G klasy ChIP i inkubuj przez 2 h w temperaturze 4°C przy stałym obracaniu.

6. Płukanie

1. Aby wyizolować kompleks chromatyny związanej z koralikami, umieść probówkę na statywie magnetycznym. Odczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie ostrożnie usuń nadsącz.
2. Do koralików dodaj 1 ml buforu do płukania o niskim zasoleniu (bufor ChIP) i inkubuj w temperaturze 4°C przez 3-5 minut przy jednoczesnej rotacji, a następnie wyizoluj koraliki i odessaj bufor płuczący, postępując zgodnie z krokiem 6.1. Powtórz ten krok łącznie 3 razy.
3. Do koralików dodaj 1 ml buforu do płukania o wysokim zasoleniu (bufor ChIP+ 350 mM NaCl) i inkubuj przez 3-5 minut przy jednoczesnej rotacji, a następnie wyizoluj koraliki i odessaj bufor płuczący, postępując zgodnie z krokiem 6.1.

7. Elucja i odwracanie sieciowania

1. Wyjąć próbki wejściowe (input) z temperatury -20°C, dodać 150 μl buforu do elucji ChIP i odstawić w temperaturze pokojowej do kroku 7.5.
2. Do każdej próbki IP z kroku 6.3 dodać 150 μl 1x buforu do elucji ChIP.
3. Umieścić probówki w termomikserze i eluować chromatynę z kulek, inkubując próbki w temperaturze 65°C przez 30 minut przy delikatnym mieszaniu w vortexie.
4. Odseparować kuleczki za pomocą statywu magnetycznego i ostrożnie przenieść eluowaną chromatynę (nadosad) do nowych probówek.
5. Do wszystkich probówek, w tym do próbek wejściowych, dodać NaCl do stężenia 200mM oraz Proteinazę K w ilości 40 μg/reakcję i inkubować w temperaturze 65°C przez 2 godziny.

UWAGA. Etap elucji można przeprowadzić również w temperaturze pokojowej, jednak może on być mniej wydajny.

8. Odzysk DNA

1. Do próbek z kroku 7.5 dodać 1 objętość fenolu/chloroformu i mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 30 sekund.
2. Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Ostrożnie przenieść fazę wodną (górną) do nowych probówek, dodać 1 objętość chloroformu do fazy wodnej i mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 30 sekund.
4. Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
5. Ostrożnie przenieść fazę wodną (górną) do nowych probówek, a następnie dodać 300mM NaOAc, 20 μg/reakcję glikogenu oraz 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu.

UWAGA. Dodanie nośnika, takiego jak glikogen, jest konieczne w celu zwiększenia wydajności precypitacji stosunkowo małych fragmentów DNA.

6. Inkubować w temperaturze -80°C przez 2 godziny w celu wytrącenia DNA.

UWAGA. Etap wytrącania można również przeprowadzić przez noc w temperaturze -20°C.

7. Wirować próbki z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 20 minut w temperaturze 4°C.
8. Ostrożnie usunąć nadsącz i przemyć osady wytrąconego DNA 300 μl lodowatego 70% etanolu.
9. Wirować próbki z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 4°C.
10. Ostrożnie usunąć jak najwięcej nadsączu i pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu.
11. Resuspender w 20 μl sterylnej H₂O. Próbki są teraz gotowe do reakcji PCR lub DNA można przechowywać w temperaturze -20°C.

9. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono reprezentatywny wynik eksperymentu ChIP w zwojach rdzeniowych (DRGs) po uszkodzeniu nerwu kulszowego (ryciny 1 i 2). Po pierwsze, pokazujemy DNA po fragmentacji do długości około 200-1000 bp (rycina 1). Po drugie, wykazujemy sygnał PCR po ChIP z proksymalnego promotora białka związanego ze wzrostem-43 (GAP-43) wyłącznie po uszkodzeniu nerwu kulszowego (ścieżka 4, rycina 2, 5'). Brak sygnału PCR występuje w przypadku zwierzęcia poddanego jedynie zabiegowi pozorowanemu (ścieżka 3) oraz przy użyciu normalnego serum IgG do immunoprecypitacji (IP) (ścieżki 5 i 6). Aby przetestować specyficzność przeciwciała, przeanalizowano te same próbki DNA, stosując zestaw starterów kontrolnych wykrywających region w 3'-UTR badanego genu, w którym nie oczekuje się wiązania białka. Sygnały PCR są nieobecne we wszystkich ścieżkach (ścieżki 3-6, rycina 2, 3'), z wyjątkiem sygnału wejściowego (input), reprezentującego próbki DNA bez IP jako standardowe kontrole PCR (ścieżki 1-2, rycina 2). Tę procedurę ChIP można przeprowadzić po uszkodzeniu nerwu kulszowego lub tylnych słupów rdzenia kręgowego, co przedstawiono na schemacie (rycina 3).

Rysunek 1. Żel agarozowy DNA z odwróconymi wiązaniami krzyżowymi, który został poddany sonikacji w celu uzyskania odpowiedniego zakresu długości fragmentów.

Rysunek 2. Wyniki półilościowej reakcji PCR z tkanek zwojów korzeni grzbietowych (DRG) po uszkodzeniu nerwu kulszowego, wykazujące, że acetylowane p53 wiąże się z proksymalnym regionem promotora GAP-43 48 godzin po urazie nerwu kulszowego. Kontrolna reakcja PCR z tych samych tkanek DRG wykazuje, że acetylowane p53 nie wiąże się z kontrolnym regionem DNA znajdującym się w 3’-nieprzetłumaczonym regionie (UTR) genu GAP-43 (S = grupa pozorowana, I = grupa z urazem).

Rycina 3. Ogólny schemat przedstawiający lokalizację miejsc uszkodzeń w nerwie kulszowym oraz w słupie tylnym.

Dyskusja

Niniejszy protokół przedstawia metodę bezpośredniego badania środowiska chromatyny podczas regeneracji aksonalnej w dorosłym układzie nerwowym po urazie aksonów. Łączy on model uszkodzenia zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z immunoprecypitacją chromatyny w celu zbadania środowiska transkrypcyjnego i epigenetycznego po urazie obwodowego (PNS) lub ośrodkowego (CNS) układu nerwowego. Jest on szczególnie przydatny dla badaczy pragnących scharakteryzować domniemane miejsca wiązania dla konkretnego czynnika transkrypcyjnego or...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x bufor do ChIP	Cell Signaling Technology	7008
2x bufor do elucji ChIP	Cell Signaling Technology	7009
Magnetyczne kulki Protein G klasy ChIP	Cell Signaling Technology	9006
Statyw Magna Grip (8 pól)	EMD Millipore	20-400
Chloroform	Merck & Co., Inc.	UN 1888
37% formaldehyd	Carl Roth Gmbh	CP10.1
10x roztwór glicyny	Cell Signaling Technology	7005
Glikogen	Sigma-Aldrich	G1767
10x HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14185
Przeciwciało przeciwko histonie H3 (królik)	Cell Signaling Technology	2650
Normalne królice IgG	Cell Signaling Technology	2729
Fenol/chloroform/alkohol izoamylkowy	Carl Roth Gmbh	A156.1
Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz	Roche Group	04 693 116 001
Proteinaza K (20 mg/ml)	Cell Signaling Technology	10012
Bufor do lizy SDS	Upstate, Millipore	20-163