Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zanieczyszczenie środowiska drobnoustrojami stanowi istotne ryzyko dla zdrowia. Klasyczne bakteryjne wskaźniki fekalne wykazują znaczące ograniczenia, wirusy są bardziej odporne na wiele procesów inaktywacji, a standardowe wskaźniki fekalne nie dostarczają informacji o źródle zanieczyszczenia. Opracowanie kosztowo efektywnych metod koncentracji wirusów z wody oraz testów molekularnych ułatwia zastosowanie wirusów jako wskaźników zanieczyszczenia fekalnego oraz jako narzędzi do śledzenia mikrobiologicznego źródła zanieczyszczeń (MST). Adenowirusy i polyomawirusy to wirusy DNA zakażające konkretne gatunki kręgowców, w tym ludzi, i są one stale wydalane z kałem i/lub moczem we wszystkich badanych obszarach geograficznych. W poprzednich badaniach zasugerowaliśmy ilościowe oznaczenie ludzkich adenowirusów (HAdV) i polyomawirusów JC (JCPyV) za pomocą ilościowej PCR (qPCR) jako wskaźnika ludzkiego zanieczyszczenia fekalnego. Opracowaliśmy niedawno testy qPCR do specyficznego ilościowego oznaczania adenowirusów świńskich (PAdV) i polyomawirusów bydlęcych (BPyV) jako zwierzęcych markerów zanieczyszczenia fekalnego, o czułości wynoszącej 1-10 kopii genomu na probówkę. W niniejszym badaniu przedstawiamy procedurę identyfikacji źródła zanieczyszczenia w próbkach wody przy użyciu tych narzędzi. Jako przykład reprezentatywnych wyników przedstawiono analizę wirusów w wodach gruntowych wykazujących wysokie poziomy azotanów.
Wykrywanie wirusów w wodach o niskim lub umiarkowanym stopniu zanieczyszczenia wymaga skoncentrowania wirusów z co najmniej kilku litrów wody do znacznie mniejszej objętości, co zazwyczaj obejmuje dwa następujące po sobie etapy koncentracji. Ta dość uciążliwa procedura oraz obserwowana zmienność w odzysku wirusów znacząco utrudniają jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek wody.
Aby wyeliminować wąskie gardło spowodowane procedurami dwuetapowymi, zastosowaliśmy jednowariantowy protokół opracowany w poprzednich badaniach, który można stosować do różnych matryc wodnych. Procedura obejmuje: zakwaszenie dziesięciolitrowych próbek wody, flokulację za pomocą odtłuszczonego mleka, sedymentację grawitacyjną materiałów sflokulowanych, zebranie osadu i wirowanie oraz resuspensję osadu w 10 ml buforu fosforanowego. Koncentrat wirusowy jest wykorzystywany do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych, a specyficzne adenowirusy i poliomawirusy są ilościowo oznaczane metodą qPCR. Dzięki tej niskokosztowej metodzie koncentracji można jednocześnie analizować dużą liczbę próbek.
Procedura ta była stosowana do analizy wód kąpieliskowych, wody morskiej i rzecznej, a w niniejszym badaniu przedstawiamy wyniki analizy próbek wód podziemnych. Ta wysokoprzepustowa metoda ilościowa jest niezawodna, prosta i kosztowo efektywna.
Protokół
1. Zagęszczanie cząstek wirusowych obecnych w próbkach wody
- Pobieranie i przygotowanie próbek wody
- Pobrać minimum 2 powtórzenia po 10 L na próbkę do plastikowych pojemników z płaskim dnem oraz jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie wzbogacona znaną ilością cząstek wirusowych i posłuży jako kontrola.
Uwaga: Zaleca się stosowanie osobnych, dedykowanych materiałów (butelek, probówek itp.) do próbek wzbogaconych. - Sprawdzić kalibrację konduktometru i w razie potrzeby przeprowadzić rekalibrację. Przygotować kontrolę negatywną, używając wody z kranu uprzednio dostosowanej do odpowiedniej przewodności (patrz poniżej punkt 1.6) w dodatkowym plastikowym pojemniku o pojemności 10 L.
- W przypadku próbek wzbogaconych: dodać do próbki standardową objętość wirusa kontrolnego (około 105 kopii genomu na 10 L wody). Wymieszać poprzez mieszanie, unikając rozpryskiwania i tworzenia aerozoli. Kontrole dodatnie mogą stanowić rzadki szczep adenowirusa, taki jak HAdV-35, lub bakteriofag, np. MS2.
- Jeśli próbka zawiera dużą ilość materiału zawieszonego (piasek lub inne materiały), pozostawić ją do osadzenia na 15 minut. Przenieść wodę do nowego pojemnika.
- Dostosować pH próbki wody do 3,5 (± 0,1) poprzez dodanie 1 N HCl. Krok ten jest istotny dla koncentracji wirusów, dlatego należy upewnić się, że pH zostało prawidłowo ustawione. Wodę mieszać dokładnie, energicznie mieszając podczas dodawania HCl. (Uwaga: jeśli pH jest niższe niż 3,5, dodać 1 M NaOH).
- Dostosować przewodność. Jeśli próbka ma przewodność 1500 μS/cm lub wyższą, ten krok nie jest wymagany. Jeśli przewodność jest niższa niż 1500 μS/cm, utworzenie materiału flokulowanego (kłaczków) nie jest gwarantowane, dlatego należy dostosować przewodność do 1500 μS/cm poprzez dodanie sztucznych soli morskich (Sigma). Mieszać energicznie podczas dodawania soli morskich.
- Zarejestrować pH próbek przed i po przygotowaniu, a także objętość zużytego HCl. Przewodność powinna zostać zarejestrowana po dostosowaniu pH. Elektrody pH-metru i konduktometru zawsze dezynfekować świeżym roztworem HCl, dechlorować roztworem 10% tiosiarczanu sodu, a na koniec przepłukać wodą destylowaną.
- Pobrać minimum 2 powtórzenia po 10 L na próbkę do plastikowych pojemników z płaskim dnem oraz jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie wzbogacona znaną ilością cząstek wirusowych i posłuży jako kontrola.
- Przygotowanie wstępnie flokulowanego 1% mleka odtłuszczonego (PSM)
- Sprawdzić kalibrację pH-metru i konduktometru i w razie potrzeby przeprowadzić rekalibrację.
- Przygotować roztwór wstępnie flokulowanego mleka odtłuszczonego (1% PSM, m/v), rozpuszczając 10 g proszku mleka odtłuszczonego (Difco) w 1 L sztucznej wody morskiej (rozpuścić 33,3 g sztucznych soli morskich w 1 L dechlorowanej wody z kranu i autoklawować) i ostrożnie dostosować pH do 3,5 za pomocą 1N HCl. Kłaczki powinny być widoczne. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem lub przechowywać w temperaturze 4°C przez 24 h. Do dechlorowania użyć 1 ml 10% roztworu tiosiarczanu na 100 ml wody.
- Flokulacja cząstek wirusowych obecnych w próbkach wody
- Dodać 100 ml 1% PSM do 10-litrowej próbki wody.
- Mieszać próbki przez 8-10 h, aby umożliwić adsorpcję wirusów do kłaczków. Użyć programatora czasu, aby wyłączyć mieszanie po 8-10 h.
- Zatrzymać mieszanie i pozostawić kłaczki do osadzenia grawitacyjnego przez 8-10 h.
- Zbieranie i ponowne rozpuszczanie kłaczków. Centryfugacja
- Usunąć nadosad za pomocą pompy perystaltycznej i plastikowej pipety połączonej z plastikową rurką. W przypadku próbek wzbogaconych nadosad należy zebrać do butelki i zdezynfekować zgodnie z procedurami wewnętrznymi. W każdym przypadku NALEŻY UWAŻAĆ, aby nie zebrać osadu.
- Zebrać osad z kłaczkami (około 500 ml) do butelki wirówkowej.
- Zrównoważyć masę probówek poprzez dodanie PSM o pH 3,5.
- Wirować probówki w wirówce wysokoprędkościowej przy 8,000 x g przez 30 min w temperaturze 4°C. Natychmiast po zatrzymaniu wirówki ostrożnie wyjąć probówki.
- Bardzo ostrożnie odlać i usunąć nadosad. Stosować odpowiednie środki ostrożności dla materiałów zakaźnych.
- Dodać 7 ml buforu fosforanowego, aby rozpuścić osad w każdej butelce wirówkowej.
- Po rozpuszczeniu kłaczków odmierzyć i dodać bufor fosforanowy do osiągnięcia całkowitej objętości 10 ml.
- Uhomogenizować koncentrat wirusowy za pomocą vortexa i rozdzielić 10 ml do czystych mikroprobówek, które należy zamrozić w temperaturze -80°C do czasu dalszych analiz.
2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
- Przeprowadź ekstrakcję kwasów nukleinowych za pomocą zestawu QIAamp Viral RNA Mini Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Zestaw ten umożliwia wykorzystanie platformy zautomatyzowanej (takiej jak Qiacube, Qiagen).
3. Ilościowy PCR adenowirusów ludzkich (HAdV), poliomawirusów JC (JCPyV), adenowirusów świń (PAdV) i poliomawirusów bydła (BPyV)
- Ilościowe oznaczenie kopii genomu w próbkach
- Przygotować mieszaninę do qPCR w czystej, wydzielonej strefie, używając TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Reakcja odbywa się w optycznej płytce reakcyjnej z 96 dołkami, przykrytej optycznymi pokrywami samoprzylepnymi. Stężenia Master Mix, starterów i sond opisano w Tabeli 1.
- Po przygotowaniu mieszaniny, odmierzyć 15μl do każdego dołka, w tym do kontrolek (patrz 3.2). Całkowita objętość jednej reakcji po dodaniu celu wyniesie 25μl (15μl mieszaniny + 10μl próbki lub standardu).
- W wydzielonej strefie dodać ekstrakty kwasów nukleinowych z próbek (10μl). Każdą próbkę należy przeprowadzić w duplikacie: w formie bezpośredniej oraz jako rozcieńczenie dziesięciokrotne w wodzie oczyszczonej. Dołki zawierające próbki przykryć częścią pokrywy samoprzylepnej, a pozostałą część pokrywy zachować do następnego kroku.
- Dodać rozcieńczenia zawiesin standardu DNA (10μl) od 100 do 106 GC/10μl w tryplikacie, używając mikropipety przeznaczonej wyłącznie do standardowego DNA. Zaleca się dodawanie standardów w strefie wyposażonej w promieniowanie UV w celu niszczenia plazmidowego DNA oraz czyszczenie mikropipety po każdym użyciu. Dołki zawierające standardy przykryć wcześniej odciętą częścią pokrywy samoprzylepnej.
Uwaga: Aby przygotować zawiesiny standardowe do ilościowego oznaczenia kopii genomu, docelowy region DNA należy sklonować do plazmidu i zlinearyzować. Pod poniższym adresem znajduje się szczegółowa procedura tworzenia krzywych wzorcowych z matrycami plazmidowego DNA do zastosowania w qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Przeprowadzić qPCR w odpowiednim systemie, wybierając właściwe parametry (uwzględniając zastosowanie pokrywy samoprzylepnej, całkowitą objętość w każdym dołku itp.). Po aktywacji AmpliTaq Gold przez 10 min w 95°C, przeprowadza się 40 cykli amplifikacji w następujący sposób: 15 s w 95°C i 1 min w 60°C dla HAdV, JCPyV i BPyV oraz 15 s w 95°C, 20s w 55°C i 20s w 60°C dla PAdV.
- Po zakończeniu reakcji zapisać dane i wyniki zgodnie z instrukcją obsługi użytego urządzenia. Ilość DNA zostanie określona jako mediana danych uzyskanych po skorygowaniu o czynnik rozcieńczenia, jeśli jest to wymagane.
- Kontrolki
- Stosować kontrolki pozytywne i negatywne. Analiza musi obejmować więcej niż jedną kontrolkę bez matrycy (NTC), aby udowodnić, że mieszanina nie generuje fluorescencji. Zaleca się przeprowadzenie pozytywnej kontrolki procesu w celu oceny potencjalnego hamowania enzymatycznego przez inhibitory obecne w badanych próbkach.
- Zarejestrować wyniki analiz qPCR dla dwóch różnych rozcieńczeń standardu DNA oraz z kontrolki procesu. Wykorzystać wyniki do przygotowania wykresów kontrolnych dla programów kontroli jakości (QC) związanych z czułością i wydajnością analiz.
- Potwierdzenie wyników
- Wyniki pozytywne można dodatkowo potwierdzić za pomocą nested-PCR i sekwencjonowania nukleotydowego amplikonów, co pozwala na uzyskanie dodatkowych danych o sekwencjach nukleotydowych wykrytych szczepów1,5,6,7,9,12.
Zgodnie z opisaną procedurą, wirusy ludzkie i zwierzęce zostały wykryte i ilościowo określone w wodach kąpieliskowych, wodzie morskiej oraz rzecznej2,3. Jako reprezentatywny przykład, w celu określenia źródeł zanieczyszczeń, oceniono próbki wód gruntowych z obszarów wykazujących wysokie stężenia azotanów. Dziesięciolitrowe próbki wody pobrano z 4 różnych studni na obszarach wiejskich w regionie północno-wschodniej Hiszpanii. Z każdej studni pobrano pięć powtórzeń, przy czym jedno powtórzenie zaszczepiono ludzkim adenowirusem 2 jako kontrolę procesu. Próbki przetworzono zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1. Cztery powtórzenia przeanalizowane w jednym z czterech badanych miejsc wykazały wyniki dodatnie dla PAdV (średnia wartość 7,74x102 GC/L), co może być związane z obecnością gnojowicy wieprzowej na obszarach otaczających miejsce poboru próbek i potwierdzałoby fekalne zanieczyszczenie wieprzowe jako źródło azotanów w wodach gruntowych (Tabela 2).
4. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Procedura wykrywania i oznaczania ilościowego wirusów w wodzie.
Tabela 1. Stężenia starterów i sond dla testów qPCR.
Tabela 2. Detekcja i ilościowe oznaczanie adenowirusów i poliomawirusów zwierzęcych i ludzkich w próbkach wód gruntowych.
n liczba analizowanych powtórzeń
% procent dodatnich powtórzeń
(-) nie wykryto
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana procedura spełnia warunki odpowiedniej metody dla rutynowych laboratoriów ochrony środowiska i zdrowia publicznego: jest powtarzalna, niezawodna, prosta i kostoeffektywna. Protokół jest prosty, jednak należy go ściśle przestrzegać. Niska przewodność w próbkach bez dodania wymaganej koncentracji soli sztucznej wody morskiej drastycznie obniżyłaby odzysk wirusów, podobnie jak miałoby to miejsce w przypadku znacznego skrócenia czasu mieszania podczas flokulacji (na przykład poniżej 5 godzin).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
W 2009 roku złożono dwa wnioski patentowe w celu ochrony własności intelektualnej protokołów kwantyfikacji PAdV i BPyV.
Podziękowania
Praca ta była częściowo finansowana przez rząd Hiszpanii „Ministerio de Educación y Ciencia” (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), w ramach projektów finansowanych z funduszy 7. ramy badawczej Unii Europejskiej VIROBATHE (umowa nr 513648), VIROCLIME (umowa nr 243923) oraz przez Katalońską Agencję Wodną Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Aquàtics. W czasie realizacji badania Marta Rusiñol była stypendystką rządu Katalonii „AGAUR” (FI-DGR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka wysokoprędkościowa (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-metr, termometr i konduktometr | Afora | LPPC3003 | |
| Probówki plastikowe o długości 100-200 cm | Deltalab | 350059 | |
| Sterylne mierzone pipety jednorazowe | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterylne probówki plastikowe o pojemności 1,5 i 10-15 mL (Eppendorf, Falcon i inne) | Afora | KA298/00 | |
| Naczynia wirówkowe (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Mieszadła magnetyczne i magnesy (jeden na próbkę) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Szklane lub plastikowe pojemniki z płaskim dnem umożliwiające stosowanie mieszadeł magnetycznych | Deltalab | 191642 | |
| Pompa perystaltyczna do usuwania supernatantu (lub pompa próżniowa z wyporem wody) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer do wyłączania mieszania po 8-10 godzinach | Deltalab | 900400 | |
| Kwas solny (1N i 0,1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Wodorotlenek sodu (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Sole do sztucznej wody morskiej | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Mleko odtłuszczone (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Bufor fosforanowy pH 7,5 | 1:2 v/v sterylnego Na2HPO4 0,2M i NaH2PO4 0,2M przy pH 7,5 | ||
| Tiosiarczan | Panreac | 121879.1209 | Przygotować 10% roztwór w wodzie |
| Zestaw QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| Optyczna płytka reakcyjna 96-dołkowa (500 sztuk) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optyczne pokrywy samoprzylepne (100 sztuk) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Bibliografia
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
