Ekonomiczna metoda śledzenia źródeł mikrobiologicznych przy użyciu określonych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Summary

Badanie opisuje opłacalną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałem/moczem lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie za pomocą qPCR do specyficznej kwantyfikacji wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów ludzkich/świńskich/bydlęcych, proponowanych jako narzędzia MST.

Abstract

Mikrobiologiczne zanieczyszczenie środowiska stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia. Klasyczne bakteryjne wskaźniki kału okazały się mieć znaczne ograniczenia, wirusy są bardziej odporne na wiele procesów inaktywacji, a standardowe wskaźniki kałowe nie informują o źródle zakażenia. Opracowanie opłacalnych metod koncentracji wirusów w wodzie i testów molekularnych ułatwia zastosowanie wirusów jako wskaźników zanieczyszczenia kałem oraz jako narzędzi do śledzenia źródeł drobnoustrojów (MST). Adenowirusy i poliomawirusy to wirusy DNA infekujące określone gatunki kręgowców, w tym ludzi, i są trwale wydalane z kałem i/lub moczem we wszystkich badanych obszarach geograficznych. W poprzednich badaniach sugerowaliśmy oznaczanie ilościowe ludzkich adenowirusów (HAdV) i poliomawirusów JC (JCPyV) za pomocą ilościowego PCR (qPCR) jako wskaźnika zanieczyszczenia ludzkimi kałami. Ostatnio opracowaliśmy testy qPCR do specyficznej kwantyfikacji adenowirusów świń (PAdV) i poliomawirusów bydła (BPyV) jako zwierzęcych markerów zanieczyszczenia kałem o wrażliwości 1-10 kopii genomu na probówkę. W niniejszej pracy przedstawiono procedurę, którą należy zastosować, aby zidentyfikować źródło zanieczyszczenia w próbkach wody za pomocą tych narzędzi. Jako przykład reprezentatywnych wyników przedstawiono analizę wirusów w wodach gruntowych wykazujących wysoki poziom azotanów.

Wykrywanie wirusów w wodach o niskim lub umiarkowanym zanieczyszczeniu wymaga koncentracji wirusów z co najmniej kilku litrów wody w znacznie mniejszej objętości, procedura, która zwykle obejmuje dwa etapy koncentracji w rzędzie. Ta nieco uciążliwa procedura i obserwowana zmienność w odzyskiwaniu wirusa znacznie utrudniają jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek wody.

Aby wyeliminować wąskie gardło spowodowane dwuetapowymi procedurami, zastosowaliśmy jednoetapowy protokół opracowany w poprzednich badaniach i mający zastosowanie do różnych matryc wodnych. Procedura obejmuje: zakwaszenie dziesięciolitrowych próbek wody, flokulację mlekiem odtłuszczonym, sedymentację grawitacyjną flokulowanych materiałów, pobranie osadu i odwirowanie, ponowne zawieszenie osadu w 10 ml buforze fosforanowym. Koncentrat wirusowy jest stosowany do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych, a specyficzne adenowirusy i poliomawirusy, które są przedmiotem zainteresowania, są oznaczane ilościowo za pomocą qPCR. Przy użyciu tej taniej metody zagęszczania można jednocześnie analizować dużą liczbę próbek.

Procedura została zastosowana do analizy wody w kąpieliskach, wody morskiej i wody rzecznej, a w tym badaniu prezentujemy wyniki analizy próbek wód gruntowych. Ta wysokowydajna metoda ilościowa jest niezawodna, prosta i opłacalna.

Protocol

1. Stężenie cząsteczek wirusa obecnych w próbkach wody

1. Pobieranie i kondycjonowanie próbek wody
   1. Zebrać co najmniej 2 powtórzenia po 10 l na próbkę w pojemnikach z tworzywa sztucznego z płaskim dnem i jedną dodatkową próbkę w ramach kontroli procesu. Ta ostatnia próbka zostanie wzbogacona znaną ilością cząstek wirusa i wykorzystana jako kontrola.
      Uwaga: Zaleca się posiadanie specjalnego oddzielnego materiału (butelki, tubka itp.) dla próbek z dodatkami.
   2. Sprawdź kalibrację konduktometru i w razie potrzeby skalibruj ponownie. Przygotować kontrolę ujemną, używając wody z kranu uprzednio dostosowanej do odpowiedniej przewodności (p....

Discussion

Opisana procedura spełniałaby warunki dla metody dopasowania dla rutynowych laboratoriów środowiskowych i zdrowia publicznego: powtarzalna, niezawodna, prosta i opłacalna. Protokół jest prosty; Należy jednak uważnie go przestrzegać. Niska przewodność w próbkach bez dodania żądanego stężenia sztucznych soli wody morskiej znacznie ograniczyłaby odzyskiwanie wirusów, co miałoby miejsce, gdyby czas mieszania do flokulacji został znacznie skrócony (na przykład mniej niż 5 godzin).

Obecnie stosowane.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka szybkoobrotowa (8 000xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-metr, termometr i konduktometr	Afora	LPPC3003
Probówki plastikowe o długości 100-200 cm	Deltalab	350059
Sterylne pipety jednorazowe z podziałką	Labclinics	PN10E1
Sterylne probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 i 10-15 ml (Eppendorf, Falcons, itp.)	Afora	KA298/00
Naczynia wirówkowe (500 ml)	Fisher Scientific	SE5753512
Mieszadła magnetyczne i magnesy (po jednym na próbkę)	Fisher Scientific	10510
Szklane lub plastikowe pojemniki z płaskim dnem, aby umożliwić stosowanie mieszadeł magnetycznych	Deltalab	191642
Pompa perystaltyczna do usuwania supernatantu (lub pompa próżniowa strumieniem wody)	Grupa pomp Watson-Marlow	323E/D Timer
do wyłączania mieszania po 8-10 godzinach	Deltalab	900400
Kwas solny (1N i 0,1N)	Panreac	141020.1611
Wodorotlenek sodu (1N)	Panreac	131687.1211
Sztuczne sole morskie w wodzie morskiej	Sigma-Aldrich	S9883
Mleko odtłuszczone (SM)	Difco Laboratories	232100
Bufor fosforanowy pH 7,5			1:2 v/v sterylnego Na2HPO4 0,2M i NaH2PO4 0,2M przy pH 7,5
Tiosiarczan	Panreac	121879.1209	Przygotuj 10% roztwór w wodzie
QIAamp Wirusowy zestaw RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96-dołkowa optyczna płytka reakcyjna (500 jednostek)	Applied Biosystems	43426659
Optyczne osłony samoprzylepne (100 jednostek)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838