Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Podsumowanie

Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.

Streszczenie

Prawidłowe funkcjonowanie mózgu zależy nie tylko od rozwoju embrionalnego, podczas którego powstają główne szlaki neuronalne, ale także od rozwoju ponatalnego, w trakcie którego obwody neuronalne dojrzewają i ulegają doprecyzowaniu. Zaburzenia regulacji na tym etapie mogą prowadzić do schorzeń neurologicznych i psychiatrycznych, takich jak autyzm i schizofrenia^1,2. Wiele genów przebadano w mózgu prenatalnym, wykazując ich kluczowe znaczenie dla wielu procesów rozwojowych^3-5. Jednak ich funkcja w mózgu ponatalnym pozostaje w dużej mierze nieznana, częściowo dlatego, że ich delecja u myszy często prowadzi do letalności podczas rozwoju noworodkowego, a częściowo dlatego, że ich niezbędność we wczesnym rozwoju utrudnia analizy ponatalne. Aby pokonać te przeszkody, u myszy generowane są obecnie allele floxowane tych genów ⁶. W połączeniu z allelami transgenicznymi wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre w konkretnych typach komórek, można uzyskać delecję warunkową w celu zbadania funkcji genów w mózgu ponatalnym. Metoda ta wymaga jednak dodatkowych alleli i więcej czasu (3-6 miesięcy) na wygenerowanie myszy o odpowiednich genotypach, co ogranicza możliwość rozszerzenia analizy genetycznej mózgu myszy na dużą skalę.

W niniejszej pracy demonstrujemy komplementarne podejście wykorzystujące ekspresję Cre za pomocą wirusów, aby szybko i systematycznie badać te allele z flankującymi sekwencjami loxP w rozwoju mózgu po urodzeniu. Poprzez wstrzykiwanie do mózgu noworodka rekombinowanych wirusów adeno-zależnych (rAAVs)^7,8 kodujących Cre, jesteśmy w stanie usunąć interesujący nas gen w różnych obszarach mózgu. Kontrolując miano wirusa i współwyrażając marker białka fluorescencyjnego, możemy jednocześnie uzyskać mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów. Metoda ta pozwala ominąć wymogi związane z koniecznością obecności wielu genów we wczesnym rozwoju i umożliwia badanie ich autonomicznej funkcji komórkowej w wielu krytycznych procesach rozwoju mózgu po urodzeniu, w tym wzrostu aksonów i dendrytów, ich rozgałęziania i mozaikowania, a także tworzenia i doprecyzowania synaps. Metoda ta była z sukcesem stosowana w naszym laboratorium (wyniki nieopublikowane) oraz w innych jednostkach^8,9, a jej zastosowanie można rozszerzyć na inne wirusy, takie jak lentiwirusy ⁹, a także na ekspresję shRNA lub białek dominująco aktywnych ¹⁰. Ponadto, dzięki połączeniu tej techniki z elektrofizjologią oraz niedawno opracowanymi narzędziami obrazowania optycznego ¹¹, metoda ta stanowi nową strategię badania wpływu ścieżek genetycznych na rozwój i funkcjonowanie obwodów neuronalnych u myszy i szczurów.

Protokół

1. Przygotowanie wirusów do wstrzyknięcia

1. Wektory rAAV zakupiono od rekomendowanego dostawcy komercyjnego, jednak można je również wytworzyć we własnym laboratorium (patrz dyskusja poniżej). Roztwór wirusa jest zazwyczaj otrzymywany z mianem rzędu ˜1x10¹² kopii genomu na mililitr (GC/ml) i może być stosowany w pełnym mianie do manipulacji dużą liczbą komórek. Alternatywnie można go rozcieńczyć, aby uzyskać pożądany poziom rzadkiego znakowania. Odpowiednie rozcieńczenie musi zostać określone przez użytkownika, jednak na początek zaleca się rozcieńczenie 1:10.
2. Wirusy należy rozmrozić na lodzie bezpośrednio przed użyciem. Przenieść pożądaną objętość roztworu wirusa do wstępnego rozcieńczenia do małej (˜250μl) probówki PCR. Rozcieńczyć roztwór wirusa, używając odpowiedniej objętości sterylnego DPBS w komorze do hodowli tkanek. Rozcieńczony roztwór wirusa przechowywać na lodzie do momentu użycia.

UWAGA: wszelkie prace z wirusami powinny być prowadzone zgodnie z protokołem bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonym przez Twoją instytucję

2. Napełnianie strzykawki i montaż sprzętu

1. Podłącz igłę do pobierania do szklanej strzykawki i pobierz roztwór wirusa z probówki PCR, delikatnie pociągając tłok. Ciągnij tłok do momentu, aż w strzykawce pojawi się bardzo mały pęcherzyk powietrza; oznacza to, że cały roztwór znajduje się w strzykawce i nie pozostał w igle do pobierania. Alternatywnie, do roztworu można dodać niewielką ilość barwnika obojętnego, aby uczynić go widocznym.
   UWAGA: Należy używać małej probówki PCR, ponieważ igła do pobierania zazwyczaj nie jest wystarczająco długa, aby sięgnąć dna większości innych probówek.
2. Zdejmij igłę do pobierania i umieść strzykawkę na bloku strzykawki pompy dozującej, mocując ją za pomocą uchwytu strzykawki.
3. Delikatnie włóż jeden koniec rurki łączącej do strzykawki, a drugi koniec do uchwytu igły. Włóż igłę wstrzykującą do uchwytu igły. Końcówka igły wstrzykującej powinna bezpośrednio stykać się z końcem rurki łączącej wewnątrz uchwytu igły.
4. Powoli wciśnij tłok ręcznie, aby przepchnąć roztwór przez rurkę łączącą. Przesuwaj tłok, aż na czubku igły wstrzykującej pojawi się maleńka kropla roztworu.
5. Ostrożnie ustaw tłok obok bloku naciskowego i zabezpiecz go za pomocą wspornika bloku naciskowego.
6. Ustaw parametry wstrzykiwania: szybkość wstrzykiwania powinna wynosić około 8μl/min (˜130nl/s); objętość wstrzykiwania wynosi zazwyczaj 1-2ul; wybierz odpowiednią średnicę strzykawki dla rozmiaru używanej strzykawki (wytyczne znajdują się w instrukcji pompy dozującej).
7. Ustaw płytkę grzejną na ˜38°C i przykryj ją ręcznikiem papierowym lub inną cienką barierą, aby chronić szczenięta podczas fazy rekonwalescencji.

3. Procedura wstrzykiwania i odzyskiwanie młodych

1. Przygotować szczenięta myszy w wieku P0 lub P1 do iniekcji, poddając je znieczuleniu zimnem zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Zwilżyć wodą kilka ręczników papierowych i umieścić je na lodzie. Położyć odpowiednią liczbę szczeniąt (4-5) na ręczniku papierowym (zachowując między nimi odstęp), a następnie delikatnie złożyć ręczniki nad szczeniętami tak, aby zostały one przykryte wilgotnym papierem. Delikatnie nasypać niewielką ilość kruszonego lodu na wierzch ręczników papierowych i inkubować szczenięta przez około 5 minut. Szczenięta można trzymać na lodzie do 15 minut, po czym zazwyczaj prawidłowo dochodzą do siebie.
2. Po odpowiednim znieczuleniu szczenięcia, umieścić je na bloku montażowym (stosujemy blok styropianowy, który zazwyczaj służy do trzymania probówek 15ml) i ustawić w pozycji zapewniającej najlepszy dostęp do miejsca iniekcji. W przypadku kory najłatwiej jest położyć zwierzę płasko na brzuchu, natomiast w przypadku móżdżku pomocne jest ustawienie głowy szczenięcia nad krawędzią bloku, aby zapewnić lepszy dostęp do tylnej części czaszki. Jeśli zajdzie taka potrzeba, szczenię można przymocować plastrem.
3. Jedną ręką unieruchomić głowę szczenięcia, podczas gdy drugą ręką ręcznie wprowadzić igłę przez czaszkę w wybrane miejsce. Pomocne jest mocne naciągnięcie skóry, aby zapobiec jej przesuwaniu się podczas iniekcji. W przypadku kory użyteczne jest wykonywanie iniekcji względem wyraźnego punktu orientacyjnego w anatomii, takiego jak szew lambda czaszki, co ułatwi przyszłe iniekcje. Móżdżek jest widoczny przez czaszkę jako cienki pas tkanki znajdujący się bezpośrednio ogonowo względem wzgórków. Głębokość, na jaką należy wprowadzić igłę, różni się nieco w zależności od osobniczych różnic i szczepów i może być oceniana za pomocą wcześniej wyznaczonych znaczników na igle; jednak w przypadku kory i móżdżku stwierdzono, że głębokość ˜0.5 - 1mm od powierzchni jest zazwyczaj odpowiednia. Głębokość wprowadzenia dla innych miejsc powinien określić eksperymentalnie użytkownik końcowy.
   UWAGA: Igła powinna z łatwością przebić czaszkę; jeśli tak się nie dzieje, NIE naciskać zbyt mocno, ponieważ może to zranić zwierzę. Zmienić położenie igły i delikatnie spróbować ponownie.
4. Wstrzyknąć roztwór wirusa. Iniekcję rozpoczyna się poprzez naciśnięcie przycisku START na pompie lub naciśnięcie pedału nożnego, w zależności od modelu używanego wstrzykiwacza ciśnieniowego. W przypadku braku pedału nożnego zaleca się pomoc współpracownika przy naciskaniu przycisku, aby zminimalizować niepotrzebne ruchy dłoni, które mogłyby wpłynąć na iniekcję.
5. Po wstrzyknięciu wybranej objętości pozostawić igłę w miejscu przez kilka sekund, a następnie delikatnie ją usunąć, wysuwając ją płynnym ruchem. Należy pamiętać o unieruchomieniu głowy szczenięcia, aby zminimalizować zbędne ruchy. Ponieważ sprzęt do iniekcji jest czyszczony i sterylizowany między eksperymentami etanolem, a rana jest mała, stosowanie antyseptyku nie jest konieczne.
6. Umieścić szczenię na przykrytej płycie grzejnej z temperaturą ustawioną na ˜38°C w celu ogrzania go i rekonwalescencji, zazwyczaj przez 5-10 minut. W tym czasie można kontynuować iniekcje u pozostałych szczeniąt.
7. Po dojciu wszystkich szczeniąt do siebie (powinny być różowe i ruchliwe), wziąć część ściółki z klatki i delikatnie nimi potrzeć szczenięta. Zwrócić szczenięta do matki jako grupę.

UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przed oddaniem szczeniąt matce upewnić się, że są one ogrzane i miały kontakt z domową ściółką, oraz aby zwrócić je jako grupę. Niedopełnienie tego wymogu może doprowadzić do tego, że matka zrani lub zabije szczenięta.

4. Czyszczenie sprzętu

1. Po zakończeniu iniekcji i oddaniu młodych szczurów matce, należy oczyścić zestaw do iniekcji, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Przepłucz układ iniekcyjny roztworem kilkukrotnie, za każdym razem używając świeżej porcji cieczy. Pozwoli to usunąć wszelkie pozostałości roztworu wirusa oraz osady. Następnie aceton lub etanol odparują.
   UWAGA: Do czyszczenia zaleca się stosowanie acetonu, jednak jeśli zestaw zawiera elementy wrażliwe na działanie acetonu, takie jak kleje cyjanoakrylowe, w tych krokach należy użyć 70% etanolu.
2. Zdezynfekuj obszar roboczy wybielaczem, a odpady wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne.

5. Analiza

1. Uśmierć zwierzęta w pożądanym wieku, stosując metodę eutanazji zatwierdzoną przez IACUC. Zaleca się fiksację perfuzyjną, aby ułatwić późniejszą wizualizację zainfekowanych neuronów, szczególnie u dorosłych zwierząt.
2. W celu wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego można zastosować standardowe procedury immunobarwienia. W skrócie: 100 μm wolnopływające przekroje wykonane wibratomem poddaje się permeabilizacji w PBS+1% Triton X-100 i blokowaniu w PBS+1% Triton X-100+10% normalnego surowicy koziej. Przekroje inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4°C, po czym następuje dodatkowe przemywanie i blokowanie. Następnie przekroje inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami wtórnymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dokładnie przemywa, montuje na szkiełkach i przykrywa szkiełkami cover-slip przy użyciu medium montażowego anti-fade. Do wizualizacji znakowanych neuronów można również użyć krioprzekrojów, jednak może dojść do utraty fluorescencji endogennej.

6. Reprezentatywne wyniki:

Prawidłowo przeprowadzona procedura wstrzyknięcia zapewni skuteczną infekcję neuronów w obszarze miejsca wstrzyknięcia, bez widocznych uszkodzeń tkanek ani innych negatywnych skutków dla zwierzęcia. Jak pokazano na Rysunku 1, rozprzestrzenianie się infekcji można obserwować u myszy Cre-reporter (ROSA26R)¹² po wstrzyknięciu rAAV8-Cre w różne miejsca anatomiczne. Wstrzyknięcia do konkretnych obszarów, takich jak kora mózgowia i kolliculus superior, zazwyczaj powodują lokalne infekcje z minimalnym rozprzestrzenianiem się do obszarów sąsiednich (Rys. 1A-B). Zastosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo infekcji obszarów sąsiednich, takich jak hipokamp (Rys. 1A). Wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie skutkuje rzadką infekcją, która zazwyczaj pozostaje w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, co pokazano na przykładzie wstrzyknięcia rAAV8-Cre w linię środkową móżdżku u myszy reporterowych ROSA26R (Rysunek 1C-D). Zaobserwowaliśmy rekombinację u myszy reporterowych ROSA26R w ciągu 2 dni po wstrzyknięciu rAAV8-Cre, co sugeruje, że infekcja, rekombinacja i ekspresja genów reporterowych mogą zachodzić stosunkowo szybko. Ponadto z sukcesem zastosowaliśmy tę technikę do badania efektów delecji genu w locus innym niż ROSA z wykorzystaniem warunkowego allelu floxed, których wyniki zostaną opublikowane w innym opracowaniu.

Liczba zainfekowanych komórek powinna być skorelowana z mianem wstrzykniętego roztworu wirusa. Na przykład wstrzyknięcie do móżdżku mieszaniny roztworów o wysokim mianie dwóch wirusów rAAV8 wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych prowadzi do zainfekowania wielu komórek Purkinje, które są różnie znakowane (Ryc. 2A). Z kolei wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może skutkować rzadką infekcją, co ułatwia wizualizację pojedynczych komórek (Ryc. 2B). Neurony znakowane fluorescencyjnie można obserwować bezpośrednio w świeżo wyciętej, żywej tkance (Ryc. 2B) lub poddać immunobarwieniu w celu wzmocnienia endogennych sygnałów fluorescencyjnych do późniejszej akwizycji obrazów za pomocą szerokopolowej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2A, Ryc. 3A-C). Wreszcie, rAAV8 jest zdolny do infekowania różnych typów neuronów w korze mózgowej, zapewniając silne znakowanie cienkich wypustek (Ryc. 3A-C).

Rysunek 1: Barwienie LacZ w mózgu myszy reporterowych ROSA26R, którym w dniu P0 wstrzyknięto rAAV8-Cre, wykazuje aktywność Cre oraz lokalizację infekcji.

1. Widok strzałkowy szerokopolowy mózgu P14 pokazujący iniekcje o wysokim mianie (1x10¹² GC/ml) do kory i kolizka górnego. Zastosowanie wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo zainfekowania obszarów sąsiadujących.
2. Przekrój strzałkowy kory P14 po iniekcji wirusa o niższym mianie (1x10¹¹ GC/ml) wykazuje infekcję lokalną z mniejszym rozprzestrzenieniem.
3. Widok całego preparatu móżdżku P28 po iniekcji wzdłuż linii środkowej roztworem wirusa o niskim mianie (1x10⁹ GC/ml) pokazuje, że infekcja jest rzadka i zazwyczaj ogranicza się do miejsca iniekcji.
4. Widok strzałkowy linii środkowej móżdżku w C). Należy zauważyć, że rAAV8 infekuje zazwyczaj tylko komórki Purkinjego.

Rycina 2: Markowanie móżdżku poprzez wstrzyknięcie rAAV8 o wysokim i niskim mianie wykazującego ekspresję białek fluorescencyjnych.

1. Przekrój strzałkowy móżdżku P21 zainfekowanego mieszanką dwóch wirusów wykazujących ekspresję EGFP (zielony) i DsRed (czerwony). Aby zainfekować dużą liczbę komórek Purkinjego, zastosowano mieszankę wirusów o wysokim mianie.
2. Komórka Purkinjego w żywym móżdżku P14 po infekcji wirusowej o bardzo niskim mianie, obrazowana bezpośrednio po sekcji.

Rycina 3: Markowanie kory za pomocą rAAV8-DsRed.
Przykłady różnorodności typów neuronów korowych w przekrojach czołowych kory P21, która została zainfekowana rAAV8-DsRed w dniu P0.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania wirusa noworodkom stanowi prosty i szybki sposób generowania mozaik in vivo do badania postnatalnego rozwoju mózgu. Metoda ta wykorzystuje allele floxowane, które są obecnie dostępne, a także te, które powstają w ramach projektu High Throughput Gene Targeting⁶. W porównaniu z wykorzystaniem transgenicznej ekspresji Cre, metoda ta zapewnia szybki sposób testowania funkcji genów w różnych typach komórek, ponieważ myszy niosące allele floxowane mogą być wykorzysta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed,	Vector Biolabs	#7060, #7061, zamówienie specjalne	http://www.vectorbiolabs.com
Pompa Harvard Pump 11 Plus	Harvard Apparatus	#702208	(Bez portu pedału nożnego)
Zestaw do iniekcji do nabłonka barwnikowego siatkówki	World Precision Instruments, Inc.	RPE-KIT	Zawiera przewody łączące, igły do iniekcji (36G) oraz uchwyt do igieł
Strzykawka NanoFil, 100μl	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL-100	Obejmuje wielorazową igłę do napełniania
D-PBS	Invitrogen	14040-117
Przeciwciało przeciwko GFP	Aves	GFP-1020
Przeciwciało przeciwko DsRed	Clontech Laboratories	632496
Blok grzejny	VWR international	97042-610
Mysz ROSA26R	Jackson Laboratory	003309