Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prawidłowe funkcjonowanie mózgu zależy nie tylko od rozwoju embrionalnego, podczas którego powstają główne szlaki neuronalne, ale także od rozwoju ponatalnego, w trakcie którego obwody neuronalne dojrzewają i ulegają doprecyzowaniu. Zaburzenia regulacji na tym etapie mogą prowadzić do schorzeń neurologicznych i psychiatrycznych, takich jak autyzm i schizofrenia1,2. Wiele genów przebadano w mózgu prenatalnym, wykazując ich kluczowe znaczenie dla wielu procesów rozwojowych3-5. Jednak ich funkcja w mózgu ponatalnym pozostaje w dużej mierze nieznana, częściowo dlatego, że ich delecja u myszy często prowadzi do letalności podczas rozwoju noworodkowego, a częściowo dlatego, że ich niezbędność we wczesnym rozwoju utrudnia analizy ponatalne. Aby pokonać te przeszkody, u myszy generowane są obecnie allele floxowane tych genów 6. W połączeniu z allelami transgenicznymi wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre w konkretnych typach komórek, można uzyskać delecję warunkową w celu zbadania funkcji genów w mózgu ponatalnym. Metoda ta wymaga jednak dodatkowych alleli i więcej czasu (3-6 miesięcy) na wygenerowanie myszy o odpowiednich genotypach, co ogranicza możliwość rozszerzenia analizy genetycznej mózgu myszy na dużą skalę.
W niniejszej pracy demonstrujemy komplementarne podejście wykorzystujące ekspresję Cre za pomocą wirusów, aby szybko i systematycznie badać te allele z flankującymi sekwencjami loxP w rozwoju mózgu po urodzeniu. Poprzez wstrzykiwanie do mózgu noworodka rekombinowanych wirusów adeno-zależnych (rAAVs)7,8 kodujących Cre, jesteśmy w stanie usunąć interesujący nas gen w różnych obszarach mózgu. Kontrolując miano wirusa i współwyrażając marker białka fluorescencyjnego, możemy jednocześnie uzyskać mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów. Metoda ta pozwala ominąć wymogi związane z koniecznością obecności wielu genów we wczesnym rozwoju i umożliwia badanie ich autonomicznej funkcji komórkowej w wielu krytycznych procesach rozwoju mózgu po urodzeniu, w tym wzrostu aksonów i dendrytów, ich rozgałęziania i mozaikowania, a także tworzenia i doprecyzowania synaps. Metoda ta była z sukcesem stosowana w naszym laboratorium (wyniki nieopublikowane) oraz w innych jednostkach8,9, a jej zastosowanie można rozszerzyć na inne wirusy, takie jak lentiwirusy 9, a także na ekspresję shRNA lub białek dominująco aktywnych 10. Ponadto, dzięki połączeniu tej techniki z elektrofizjologią oraz niedawno opracowanymi narzędziami obrazowania optycznego 11, metoda ta stanowi nową strategię badania wpływu ścieżek genetycznych na rozwój i funkcjonowanie obwodów neuronalnych u myszy i szczurów.
Protokół
1. Przygotowanie wirusów do iniekcji
- Wektory rAAV zakupiono od zalecanego dostawcy komercyjnego, jednak mogą być one również produkowane we własnym laboratorium (patrz dyskusja poniżej). Roztwór wirusa jest zazwyczaj przygotowywany o mianie ok. 1x1012 kopii genomu na mililitr (GC/ml) i może być stosowany w pełnym mianie do manipulacji dużą liczbą komórek. Alternatywnie można go rozcieńczyć, aby uzyskać pożądany poziom rzadkiego znakowania. Odpowiednie rozcieńczenie musi zostać określone przez użytkownika, jednak na początek zaleca się rozcieńczenie 1:10.
- Wirusy rozmrozić na lodzie bezpośrednio przed użyciem. Przenieść pożądany objętość wstępnego rozcieńczenia roztworu wirusa do małej (ok. 250μl) probówki PCR. Rozcieńczyć roztwór wirusa, dodając odpowiednią objętość sterylnego DPBS w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozcieńczony roztwór wirusa przechowywać na lodzie do momentu użycia.
UWAGA: wszelkie prace z wirusami powinny być prowadzone zgodnie z protokołem bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonym przez Twoją instytucję
2. Napełnianie strzykawki i montaż sprzętu
- Podłącz igłę do pobierania do szklanej strzykawki i wciągnij roztwór wirusa z probówki PCR, delikatnie odciągając tłok. Odciągaj tłok, aż w strzykawce pojawi się niewielki pęcherzyk powietrza; wskazuje to, że cały roztwór znajduje się w strzykawce i nie pozostał w igle do pobierania. Alternatywnie do roztworu można dodać niewielką ilość barwnika obojętnego, aby uczynić go widocznym.
UWAGA: Należy użyć małej probówki PCR, ponieważ igła do pobierania zazwyczaj nie jest wystarczająco długa, aby dotrzeć do dna większości innych probówek. - Zdejmij igłę do pobierania i umieść strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy strzykawkowej, zabezpieczając ją zaciskiem do strzykawki.
- Delikatnie wsuń jeden koniec przewodu łączącego do strzykawki, a drugi koniec do uchwytu igły. Wsuń igłę wstrzykującą do uchwytu igły. Końcówka igły wstrzykującej powinna bezpośrednio stykać się z końcem przewodu łączącego wewnątrz uchwytu igły.
- Powoli i ręcznie wciśnij tłok, aby przepchnąć roztwór przez przewód łączący. Przesuwaj tłok, aż na końcówce igły wstrzykującej pojawi się mała kropla roztworu.
- Ostrożnie ustaw tłok obok bloku napędowego i zabezpiecz go wspornikiem bloku napędowego.
- Ustaw parametry wstrzykiwania: szybkość wstrzykiwania powinna wynosić około 8μl/min (˜130nl/s); objętość wstrzykiwania zazwyczaj wynosi 1-2ul; wybierz odpowiednią średnicę strzykawki dla używanego rozmiaru strzykawki (wytyczne znajdują się w instrukcji obsługi pompy strzykawkowej).
- Ustaw płytkę grzewczą na ˜38°C i przykryj ją ręcznikiem papierowym lub inną cienką barierą, aby chronić młode szczury w fazie rekonwalescencji.
3. Procedura iniekcji i odzyskiwanie młodych
- Przygotuj myszy w wieku P0 lub P1 do iniekcji, poddając je anestezji zimnem zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Zwilż wodą kilka ręczników papierowych i połóż je na lodzie. Umieść odpowiednią liczbę myszy (4-5) na ręczniku papierowym (zachowując między nimi odstępy) i delikatnie złóż ręczniki tak, aby myszy były nimi przykryte. Połóż niewielką ilość kruszonego lodu na wierzchu ręczników papierowych i inkubuj myszy przez około 5 minut. Myszy mogą pozostawać na lodzie do 15 minut i zazwyczaj dobrze regenerują się po tym zabiegu.
- Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, umieść ją na bloku montażowym (stosujemy blok styropianowy, który zazwyczaj służy do przechowywania probówek 15ml) i ustaw ją tak, aby zapewnić najlepszy dostęp do miejsca iniekcji. W przypadku kory najłatwiej jest położyć zwierzę płasko na brzuchu, natomiast w przypadku móżdżku pomocne jest ustawienie głowy myszy nad krawędzią bloku, co zapewnia lepszy dostęp do tylnej części czaszki. Jeśli zajdzie taka potrzeba, mysz można przymocować plastrem.
- Jedną ręką unieruchom głowę myszy, podczas gdy drugą ręką ręcznie wprowadź igłę przez czaszkę w wyznaczonym miejscu. Pomocne jest mocne naciągnięcie skóry, aby zapobiec jej przesuwaniu się podczas iniekcji. W przypadku kory użyteczne jest wykonywanie iniekcji w odniesieniu do wyraźnego punktu orientacyjnego, takiego jak szew lambda czaszki, co ułatwi przyszłe iniekcje. Móżdżek jest widoczny przez czaszkę jako cienki pas tkanki położony bezpośrednio kuzałnie od kolcolca. Głębokość, na jaką należy wprowadzić igłę, różni się nieco w zależności od osobniczych różnic i szczepów; można ją ocenić za pomocą wcześniej wyznaczonych znaczników na igle, jednak w przypadku kory i móżdżku głębokość ˜0.5 - 1mm od powierzchni jest zazwyczaj odpowiednia. Głębokość wprowadzenia igły dla innych miejsc powinna zostać ustalona eksperymentalnie przez użytkownika końcowego.
UWAGA: Igła powinna łatwo przebić czaszkę; jeśli tak się nie dzieje, NIE naciskaj zbyt mocno, ponieważ może to zranić zwierzę. Zmień pozycję igły i spróbuj ponownie, robiąc to delikatnie. - Wstrzyknij roztwór wirusa. Iniekcję rozpoczyna się poprzez naciśnięcie przycisku START na pompie lub naciśnięcie pedału nożnego, w zależności od modelu używanego wstrzykiwacza ciśnieniowego. W przypadku braku pedału nożnego zaleca się, aby kolega pomógł w naciśnięciu przycisku, co zminimalizuje zbędne ruchy rąk, które mogłyby wpłynąć na przebieg iniekcji.
- Po wstrzyknięciu wybranej objętości pozostaw igłę w miejscu przez kilka sekund, a następnie delikatnie ją wyjmij, wysuwając ją płynnym ruchem. Pamiętaj o unieruchomieniu głowy myszy, aby zminimalizować przypadkowe ruchy. Ponieważ sprzęt do iniekcji jest czyszczony i sterylizowany między eksperymentami za pomocą etanolu, a rana jest niewielka, stosowanie antyseptyków nie jest konieczne.
- Umieść mysz na przykrytej płycie grzewczej z temperaturą ustawioną na ˜38°C, aby ją ogrzać w celu regeneracji, zazwyczaj przez 5-10 minut. W tym czasie można kontynuować iniekcje u pozostałych myszy.
- Gdy wszystkie myszy dojdą do siebie (powinny być różowe i ruchliwe), weź porcję ściółki z klatki i delikatnie potrzyj nią myszy. Zwróć myszy do matki jako grupę.
UWAGA: Bardzo ważne jest upewnienie się, że szczenięta są ogrzane i miały kontakt z domową ściółką przed oddaniem ich matce, a także aby oddać je jako grupę. Niedopełnienie tego wymogu może doprowadzić do zranienia lub zabicia szczeniąt przez matkę.
4. Czyszczenie sprzętu
- Po zakończeniu iniekcji i oddaniu młodych szczurów do matki, należy oczyścić zestaw do iniekcji, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Przelej roztwór przez zestaw kilka razy, używając za każdym razem świeżego roztworu. Usunie to wszelkie pozostałości roztworu wirusa oraz osady. Aceton lub etanol następnie odparują.
UWAGA: Do czyszczenia zaleca się stosowanie acetonu, jednak jeśli zestaw zawiera elementy wrażliwe na aceton, takie jak kleje cyjanoakrylowe, w tych krokach należy użyć 70% etanolu. - Zdezynfekuj obszar roboczy wybielaczem, a odpady zutylizuj w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne.
5. Analiza
- Uśmierć zwierzęta w pożądanym wieku, stosując metodę eutanazji zatwierdzoną przez IACUC. W celu ułatwienia późniejszej wizualizacji zainfekowanych neuronów, szczególnie u dorosłych zwierząt, zaleca się utrwalanie perfuzyjne.
- W celu wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego można zastosować standardowe procedury immunobarwienia. W skrócie: pływające skrawki o grubości 100 μm wykonane w wibrotomie poddaje się permeabilizacji w PBS+1% Triton X-100 i blokowaniu w PBS+1% Triton X-100+10% normalnego surowicy koziej. Skrawki inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4°C, a następnie poddaje dodatkowemu przemywaniu i blokowaniu. Następnie skrawki inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami wtórnymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dokładnie przemywa, osadza na szkiełkach i zakrywa szkiełkami podstawowymi, stosując medium montażowe typu anti-fade. Do wizualizacji znakowanych neuronów można również wykorzystać krioprzekroje, jednak może dojść do utraty fluorescencji endogennej.
6. Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowo przeprowadzona procedura wstrzykiwania doprowadzi do skutecznej infekcji neuronów w obrębie miejsca wstrzyknięcia, bez widocznych uszkodzeń tkanki ani innych negatywnych skutków dla zwierzęcia. Jak pokazano na Ryc. 1, rozprzestrzenianie się infekcji można zaobserwować u myszy z reporterem Cre (ROSA26R)12 po wstrzyknięciu rAAV8-Cre w różne miejsca anatomiczne. Wstrzyknięcia do konkretnych obszarów, takich jak kora mózgu i wzgórze górne, zazwyczaj generują infekcje lokalne z minimalnym rozprzestrzenianiem się do sąsiednich regionów (Ryc. 1A-B). Zastosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo infekcji obszarów sąsiednich, takich jak hipokamp (Ryc. 1A). Wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie skutkuje rzadką infekcją, która zazwyczaj pozostaje w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, co pokazano w przypadku wstrzyknięcia rAAV8-Cre do móżdżku w linii środkowej u myszy reporterowych ROSA26R (Ryc. 1C-D). Obserwowaliśmy rekombinację u myszy reporterowych ROSA26R w ciągu 2 dni po wstrzyknięciu rAAV8-Cre, co sugeruje, że infekcja, rekombinacja i ekspresja genów reporterowych mogą zachodzić stosunkowo szybko. Ponadto z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę do badania efektów delecji genu w locus innym niż ROSA przy użyciu warunkowego allelu floxed, a wyniki tych badań zostaną opublikowane w innym opracowaniu.
Liczba zainfekowanych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusa. Na przykład wstrzyknięcie do móżdżku mieszaniny roztworów o wysokim mianie dwóch wirusów rAAV8 wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych prowadzi do zainfekowania wielu komórek Purkinjego, które są różnie znakowane (Ryc. 2A). Z kolei wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może skutkować rzadką infekcją, co ułatwia wizualizację pojedynczych komórek (Ryc. 2B). Neurony znakowane fluorescencyjnie można obserwować bezpośrednio w świeżo pociętej, żywej tkance (Ryc. 2B) lub poddać immunobarwieniu w celu wzmocnienia endogennych sygnałów fluorescencyjnych przed późniejszą akwizycją obrazów za pomocą szerokopolowej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2A, Ryc. 3A-C). Wreszcie, rAAV8 jest w stanie zainfekować różne typy neuronów w korze mózgu, zapewniając silne znakowanie drobnych wypustek (Ryc. 3A-C).
Rycina 1: Barwienie LacZ w mózgu myszy reporterowych ROSA26R, którym w dniu P0 wstrzyknięto rAAV8-Cre, wykazuje aktywność Cre oraz miejsce infekcji.
- Widok strzałkowy szerokopolowy mózgu P14 ukazujący wstrzyknięcia wysokiego miana (1x1012 GC/ml) do kory oraz wzgórka górnego. Zastosowanie wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo zainfekowania obszarów sąsiadujących.
- Przekrój strzałkowy kory P14 po wstrzyknięciu wirusa o niższym mianie (1x1011 GC/ml) wykazuje infekcję lokalną z mniejszym rozprzestrzenieniem.
- Widok całego preparatu móżdżku P28 po wstrzyknięciu w linii środkowej roztworu wirusa o niskim mianie (1x109 GC/ml) pokazuje, że infekcja jest rzadka i zazwyczaj pozostaje w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.
- Widok strzałkowy linii środkowej móżdżku z obrazu C). Należy zauważyć, że rAAV8 infekuje zazwyczaj tylko komórki Purkinjego.
Rycina 2: Znakowanie móżdżku poprzez wstrzyknięcie wysokich i niskich mian rAAV8 wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych.
- Przekrój strzałkowy móżdżku szczura w 21. dniu życia (P21) zainfekowanego mieszaniną dwóch wirusów wykazujących ekspresję EGFP (zielony) i DsRed (czerwony). Do zainfekowania dużej liczby komórek Purkinjego użyto mieszaniny wirusów o wysokim mianie.
- Komórka Purkinjego w żywym móżdżku szczura w 14. dniu życia (P14) po infekcji wirusowej o bardzo niskim mianie, obrazowana natychmiast po sekcji.
Rycina 3: Markowanie kory mózgowej za pomocą rAAV8-DsRed.
Przykłady różnorodności typów neuronów korowych w przekrojach koronarnych kory P21, która została zainfekowana rAAV8-DsRed w dniu P0.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania wirusa noworodkom stanowi prosty i szybki sposób generowania mozaik in vivo do badania postnatalnego rozwoju mózgu. Metoda ta wykorzystuje allele floxowane, które są obecnie dostępne, a także te, które powstają w ramach projektu High Throughput Gene Targeting6. W porównaniu z wykorzystaniem transgenicznej ekspresji Cre, metoda ta zapewnia szybki sposób testowania funkcji genów w różnych typach komórek, ponieważ myszy niosące allele floxowane mogą być wykorzysta...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana z grantu RO1 przyznanego przez NIH (NINDS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, zamówienie specjalne | http://www.vectorbiolabs.com |
| Pompa Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (Bez portu pedału nożnego) |
| Zestaw do iniekcji do nabłonka barwnikowego siatkówki | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Zawiera przewody łączące, igły do iniekcji (36G) oraz uchwyt do igieł |
| Strzykawka NanoFil, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Obejmuje wielorazową igłę do napełniania |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| Przeciwciało przeciwko GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Przeciwciało przeciwko DsRed | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Blok grzejny | VWR international | 97042-610 | |
| Mysz ROSA26R | Jackson Laboratory | 003309 |
Bibliografia
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
