Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2824

⸱

20 kwietnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, 2New Product Design Department, Fujirebio Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Niedawno opracowany nowoczesny test aglutynacji cząsteczek (PA) z wykorzystaniem cząsteczki receptora wirusowego umożliwił szybką i łatwą identyfikację poliwirusa (PV). W niniejszym artykule przedstawimy procedurę testu PA służącą do identyfikacji PV.

Streszczenie

W ramach Globalnej Inicjatywy na rzecz Eradykacji Polio (Global Polio Eradication Initiative) diagnostyka laboratoryjna odgrywa kluczową rolę poprzez izolację i identyfikację PV z próbek kału pobranych od pacjentów z ostrym wiotkim porażeniem (AFP). W Globalnej Sieci Laboratoriów Polio Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) izolacja i identyfikacja PV są obecnie przeprowadzane odpowiednio z wykorzystaniem systemów hodowli komórkowych oraz metody real-time RT-PCR. W erze po eradykacji PV proste i szybkie procedury identyfikacji byłyby pomocne w szybkim potwierdzaniu przypadków polio w laboratoriach krajowych. W niniejszym badaniu przedstawimy procedurę nowej analizy PA opracowanej do identyfikacji PV. Analiza PA wykorzystuje interakcję cząsteczki receptora PV (PVR) z wirionem, która charakteryzuje się swoistym i jednolitym powinowactwem do wszystkich serotypów PV. Procedura jest prosta (jednoetapowa w płytkach reakcyjnych) i szybka (wyniki można uzyskać w ciągu 2 h reakcji), a efekt jest obserwowany wizualnie (obserwacja aglutynacji cząsteczek żelatyny).

Protokół

1. Przygotowanie pożywki utrzymującej (MM) i pożywki wzrostowej (GM)

W celu przygotowania MM i GM należy zapoznać się z podręcznikiem laboratoryjnym WHO dotyczącym polio 1. Jako zamienniki dla MM i GM można odpowiednio zastosować modyfikowane podłoże Eagle'a (DMEM) uzupełnione o 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 10% FCS.

2. Przygotowanie przeciwciał anty-PV

  1. Zrekonstytuować przeciwciała anty-PV (antywykostyk RIVM do typowania PV), dodając wodę (0,5 mL na fiolkę) do każdej fiolki z przeciwciałami anty-PV (typ 1, 2 lub 3). Dodać te zrekonstytuowane roztwory przeciwciał (po 0,5 mL każdego) do 4,5 mL MM w oddzielnych, oznakowanych probówkach.
    Uwaga: Niektóre serie przeciwciał anty-PV są dostarczane w formie zrekonstytuowanej (0,5 mL na fiolkę). W przypadku takich serii przeciwciał anty-PV dodawanie wody do rekonstytucji nie jest konieczne.
  2. Zmieszać równe objętości zrekonstytuowanych przeciwciał anty-PV. Dla anty-PV1 +2, 2+3 lub 3+1: zmieszać 1,8 mL każdego zrekonstytuowanego przeciwciała (1,8 mL + 1,8 mL = 3,6 mL dla każdej mieszaniny). Dla anty-PV1 +2+3: zmieszać 1,2 mL każdego zrekonstytuowanego przeciwciała (1,2 mL + 1,2 mL + 1,2 mL = 3,6 mL).
    Uwaga: Próbki PV mogą zawierać mieszaninę różnych serotypów PV. Aby zidentyfikować pojedynczy serotyp PV w próbkach zawierających mieszaninę PV, konieczne jest użycie pul przeciwciał anty-PV (tj. 1+2, 2+3, 3+1, 1+2+3).
  3. Dodać 1/5 objętości FCS (0,72 mL) do każdego przeciwciała anty-PV (1+2, 2+3, 3+1 lub 1+2+3) (po 3,6 mL każdego) (końcowe stężenie 18,2% FCS).
    Uwaga: Dodanie FCS służy zmniejszeniu nieswoistej aglutynacji cząsteczek żelatyny wywoływanej przez przeciwciała.
  4. Przechowywać pule przeciwciał w temperaturze -20 °C do czasu użycia w teście PA.

3. Rekonstytucja uczulonych cząsteczek żelatyny

  1. Do jednej fiolki z uczulonymi cząsteczkami żelatyny (dostarczonymi w formie proszku liofilizowanego) dodać 1,5 mL buforu do rekonstytucji dołączonego do zestawu.
  2. Wymieszać dokładnie, delikatnie opukując fiolkę.
  3. Rekonstytuowane cząsteczki uczulone przechowywać w temperaturze 4 °C. Rekonstytuowane cząsteczki żelatyny zachowują aktywność przez co najmniej 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, jednak należy je przygotować bezpośrednio przed analizą.

Ważna uwaga:
Nie należy mieszać cząsteczek żelatyny uczulonej z różnych partii, ponieważ obraz braku aglutynacji cząsteczek żelatyny uczulonej może różnić się w zależności od partii cząsteczek. Do każdego eksperymentu należy użyć pojedynczej partii cząsteczek żelatyny uczulonej.

4. Analiza PA w celu identyfikacji PV

  1. Przygotować płytkę mikrotytracyjną. Do identyfikacji jednej próbki wirusa wymagane są 5 dołków + co najmniej jedna kontrola negatywna (uczulone cząsteczki bez wirusa i przeciwciała, dołek nr 6 poniżej; patrz: Kontrola bez wirusa i przeciwciał w przykładzie). Całkowita liczba dołków wynosi 5 x liczba próbek + co najmniej jedna kontrola w teście.
    Ważna uwaga:
    Należy uwzględnić w teście co najmniej jedną kontrolę bez wirusa i przeciwciał. Jedna fiolka uczulonych cząsteczek wystarcza mniej więcej do identyfikacji 10 próbek wirusa.
  2. Dodać 12 μL/dołek przeciwciał anty-PV lub GM do płytki mikrotytracyjnej. Układ płytki jest następujący (patrz również przykład poniżej). W próbkach bez przeciwciał (dołek nr 1 i 6) dodać 12 μL GM zamiast przeciwciał anty-PV.
    Ważna uwaga:
    Jeśli w teście ma być badanych wiele próbek PV, w tym kroku pomocne będzie użycie pipety wielokanałowej lub dozownika.
    Dołek nr 1Dołek nr 2Dołek nr 3Dołek nr 4Dołek nr 5Dołek nr 6
    GManti-P1+2+3anti-P1+2anti-P2+3ani-P1+3GM
  3. Dodać 12 μL/dołek próbki wirusa. W jednej próbce bez wirusa (dołek nr 6) dodać 12 μL GM zamiast roztworu wirusa.
    Uwaga: Próbka wirusa to supernatant hodowli zainfekowanych komórek, zazwyczaj komórek L20B lub RD.
    Ważna uwaga:
    Jeśli w teście ma być badanych wiele próbek PV, w tym kroku pomocna będzie pipeta wielokanałowa.
    Dołek nr 1Dołek nr 2Dołek nr 3Dołek nr 4Dołek nr 5Dołek nr 6
    próbka wirusapróbka wirusapróbka wirusapróbka wirusapróbka wirusaGM
  4. Przenieść zrekonstytuowany roztwór uczulonych cząsteczek z temperatury 4 °C do temperatury pokojowej i delikatnie opukać, aby całkowicie zawiesić cząsteczki.
    Ważna uwaga:
    Po całkowitym zawieszeniu cząsteczek poprzez delikatne opukanie, należy je niezwłocznie dodać do płytek, zanim zawieszone cząsteczki opadną i utworzą niejednorodny roztwór.
  5. Dodać 25 μL/dołek uczulonych cząsteczek do wszystkich dołków.
    Ważna uwaga:
    Po dodaniu uczulonych cząsteczek płytka powinna zostać niezwłocznie poddana mieszaniu, aby rozpocząć jednoczesną reakcję próbek. Dlatego dodawanie uczulonych cząsteczek powinno być wykonywane za pomocą dozownika, aby zminimalizować różnice czasowe między próbkami na płytce.
  6. Umieścić płytkę mikrotytracyjną na mieszadle do płytek i mieszać przez 30 s.
  7. Położyć płytkę mikrotytracyjną na białej kartce papieru (dla ułatwienia obserwacji wizualnej) na stole w temperaturze pokojowej (15˜30 °C) na 2 h.
    Ważna uwaga:
    Nie przesuwać płytki podczas i po reakcji w celu obserwacji wyników i wykonywania zdjęć. Powstała aglutynacja jest niestabilna i łatwo może zostać zakłócona przez przesuwanie płytek.
  8. Wykonac zdjęcia płytki.
    Ważna uwaga:
    Zdjęcia przedstawiające jedynie fragmenty mogą nie dostarczyć wystarczających danych do późniejszej analizy i przeglądu wyników w celu ich interpretacji. Należy wykonać kilka zdjęć, aby objąć wszystkie dołki płytek, skupiając się na obrazie aglutynacji w dołkach.

5. Interpretacja wyników

  1. Identyfikacja studni pozytywnych i negatywnych. Porównaj aglutynację w próbkach z kontrolą bez wirusa i przeciwciał (precypitacja cząsteczek żelatyny, brak aglutynacji) (Rycina 1 i 2). Obrazy aglutynacji, które wyraźnie odróżniają się od kontroli bez wirusa i bez przeciwciał (brak aglutynacji, kontrola negatywna), należy uznać za pozytywne, natomiast obrazy aglutynacji podobne do kontroli negatywnej należy uznać za negatywne. Próbki wykazujące wyraźną, ale tylko częściową aglutynację mogą zostać uznane za pozytywne, lecz należy je zapisać jako „Pozytywne (aglutynacja częściowa)”.
  2. Identyfikacja PV. Interpretuj wyniki na podstawie studni pozytywnych i negatywnych z przeciwciałami anty-PV w celu zidentyfikowania serotypów PV. Zasada interpretacji wyniku jest analogiczna do testu neutralizacji w systemie hodowli komórkowej (np. wynik pozytywny dla przeciwciała anty-P1+2 wskazuje, że próbka zawiera PV typu 3).

6. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny wynik badania PA w celu identyfikacji PV przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie szczepy PV powodowały aglutynację uczulonych cząstek żelatyny (próbki bez przeciwciał). W obecności odpowiadających im przeciwciał anty-PV obserwowano opadanie cząstek żelatyny (brak aglutynacji), podobnie jak w kontroli bez wirusa i bez przeciwciał (kontrola negatywna) (np. PV1(Sabin) w obecności przeciwciał anty-P1+2 lub anty-P3+1).

Test neutralizacji wirusów wykazujący wpływ przeciwciał na różne typy poliwirusów Sabina w dołkach.
Rysunek 1. Identyfikacja PV za pomocą analizy PA. roztwory wirusów PV1(Sabin), PV2(Sabin) i PV3(Sabin) (miana wirusów wynoszące 1,2 x 108 CCID50 / 12 μL, 8,2 x 107 CCID50 / 12 μL, oraz 3,5 x 107 CCID50 / 12 μLodpowiednio) wykorzystano do identyfikacji za pomocą testu aglutynacji cząstek (PA). W kontroli bez wirusa i bez przeciwciał nie stwierdzono precypitacji cząstek żelatyny (brak aglutynacji, kontrola negatywna).

Wyniki testu aglutynacji wirusowej; schemat z serią rozcieńczeń do detekcji wirusa, kontrole pozytywna i negatywna.
Rysunek 2. Interpretacja studni dodatnich i ujemnych. Roztwory wirusów PV1(Sabin), PV2(Sabin) i PV3(Sabin) (miana wirusów wynoszące 2,4 x 108 CCID50 / 25 μL, 1,7 x 108 CCID50 / 25 μL, oraz 7,3 x 107 CCID50 / 25 μL, odpowiednio) rozcieńczono w zakresie od 1/20 do 1/320, a następnie 25 μL rozcieńczone próbki zbadano za pomocą testu PA bez użycia przeciwciał anty-PV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyjątkowym aspektem tego testu PA jest wykorzystanie cząsteczki PVR zamiast przeciwciał anty-PV do detekcji PV 2. Pozwala to na specyficzną interakcję uczulonych cząsteczek żelatyny z PV z jednolitym powinowactwem do wszystkich trzech serotypów PV 3-6. Do uczulenia cząsteczek żelatyny wykorzystaliśmy formę immunoadhezyny PVR (PVR-IgG2a), ponieważ formy monomerowe PVR wykazują jedynie umiarkowane powinowactwo do pojedynczego miejsca wiązania na wirionie (stała dysocjacji 10-7˜-8 M) 7, 8, i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Souji Masujima jest pracownikiem Działu Projektowania Nowych Produktów w firmie Fujirebio Inc.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Junko Wada za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy prof. Akio Nomoto za uprzejme udostępnienie wektora ekspresyjnego bakulowirusa dla PVR-IgG2a. Niniejsze badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej w ramach programów wspierania eradykacji polio oraz badań nad nowymi i powracającymi chorobami zakaźnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cząsteczki żelatyny uwrażliwionejFujirebio Inc.Zestaw testowy
Bufor do rekonstytucjiFujirebio Inc.Zestaw testowy
Płyta mikrotytracyjnaFujirebio Inc.Zestaw testowy
Przeciwciało anty-PVRIVM

Bibliografia

  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Receptor poliwirusacz steczki elatynowetest aglutynacjineutralizacja wirusakombinacje przeciwciainkubacja w temperaturze pokojowejp ytka 96 do kowaobserwacja wizualna
Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.