Artykuł metodologiczny

Metoda aglutynacji cząstek do identyfikacji wirusa polio

DOI:

10.3791/2824

⸱

20 kwietnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, 2New Product Design Department, Fujirebio Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opracowany nowy test aglutynacji cząstek (PA) wykorzystujący cząsteczkę receptora wirusa pozwolił na szybką i łatwą identyfikację wirusa polio (PV). W tym artykule przedstawimy procedurę testu PA do identyfikacji PV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Globalnej Inicjatywie Zwalczania Polio, diagnostyka laboratoryjna odgrywa kluczową rolę poprzez izolowanie i identyfikowanie PV z próbek kału przypadków ostrego wiotkiego paraliżu (AFP). W Globalnej Sieci Laboratoriów Polio Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) izolacja i identyfikacja PV są obecnie przeprowadzane przy użyciu odpowiednio systemu hodowli komórkowych i RT-PCR w czasie rzeczywistym. W erze po eradykacji PV proste i szybkie procedury identyfikacji byłyby pomocne w szybkim potwierdzaniu przypadków polio w krajowych laboratoriach. W niniejszej pracy przedstawimy procedurę nowatorskiego testu PA opracowanego do identyfikacji PV. Ten test PA wykorzystuje interakcję cząsteczki receptora PV (PVR) i wirionu, który ma specyficzne i jednolite powinowactwo do wszystkich serotypów PV. Procedura jest prosta (procedura jednoetapowa w płytkach reakcyjnych) i szybka (wyniki można uzyskać w ciągu 2 godzin od reakcji), a wynik jest obserwowany wizualnie (obserwacja aglutynacji cząstek żelatyny).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki pielęgnacyjnej (MM) i pożywki wzrostowej (GM)

Aby przygotować MM i GM, zobacz podręcznik laboratoryjny polio WHO 1. Zmodyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona o 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 10% FCS może być stosowana jako substytuty odpowiednio MM i GM.

2. Przygotowanie przeciwciał anty-PV

  1. Odtworzyć przeciwciało anty-PV (surowicę anty-typu RIVM PV), dodając wodę (0,5 ml na fiolkę) do każdej fiolki przeciwciała anty-PV (typu 1, 2 lub 3). Dodaj te odtworzone roztwory przeciwciał (po 0,5 ml każdy) do 4,5 ml MM w oddzielnych znakowanych probówkach.
    Uwaga: Niektóre partie przeciwciała anty-PV są dostarczane w postaci odtworzonej (0,5 ml na fiolkę). W przypadku takiej partii przeciwciał anty-PV dodawanie wody w celu rozpuszczenia nie jest konieczne.
  2. Wymieszać równą objętość rozpuszczonego przeciwciała anty-PV. Dla anty-PV1 +2, 2+3 lub 3+1: Wymieszać 1,8 ml każdego rozpuszczonego przeciwciała (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml dla każdej mieszaniny). Dla anty-PV1 +2+3: Wymieszaj 1,2 ml każdego rozpuszczonego przeciwciała (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml).
    Uwaga: Próbki PV mogą zawierać mieszaninę różnych serotypów PV. Do identyfikacji pojedynczego serotypu PV w próbkach z mieszaniną PV konieczne jest zebranie puli przeciwciał anty-PV (tj. 1+2, 2+3, 3+1, 1+2+3).
  3. Dodać 1/5 objętości FCS (0,72 ml) do każdego przeciwciała anty-PV (1+2, 2+3, 3+1 lub 1+2+3) (po 3,6 ml) (końcowe 18,2% FCS).
    Uwaga: Dodanie FCS ma na celu zmniejszenie nieswoistej aglutynacji cząstek żelatyny spowodowanej przez przeciwciała.
  4. Przechowywać pule przeciwciał w temperaturze -20 °C do czasu użycia w teście PA.

3. Rekonstytucja uczulonej cząsteczki żelatyny

  1. Dodać 1,5 ml buforu do rozpuszczania dołączonego do zestawu do jednej fiolki z uczulonymi cząstkami żelatyny (dostarczanymi w postaci liofilizowanego proszku).
  2. Dobrze wymieszaj, delikatnie stukając
  3. Rozpuszczoną cząstkę uczuloną należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Odtworzona cząstka żelatyny może być aktywna przez co najmniej 2 tygodnie i być przechowywana w temperaturze 4 °C, ale powinna być przygotowana tuż przed badaniem.

Ważna uwaga:
Nie mieszaj różnych partii uczulonych cząstek żelatyny, ponieważ nieaglutynacyjny obraz uczulonych cząstek żelatyny może być różny w zależności od partii cząstek. Do każdego eksperymentu należy użyć pojedynczej partii uczulonej cząsteczki żelatyny.

4. Test PA do identyfikacji PV

  1. Przygotować płytkę do mikromiareczkowania. Do identyfikacji jednej próbki wirusa potrzebujemy 5 studzienek + co najmniej jedna kontrola ujemna (uczulona cząstka bez wirusa i przeciwciała, studnia # 6 poniżej. Zobacz Brak kontroli wirusa i przeciwciał w przykładzie). Całkowita liczba studzienek to 5 x próbki + co najmniej jedna kontrola w teście.
    Ważna uwaga:
    Proszę wziąć co najmniej jeden test kontroli bez wirusa i przeciwciał w teście. Jedna fiolka z uczulonymi cząstkami służy w przybliżeniu do identyfikacji 10 próbek wirusa.
  2. Dodać 12 μl/basenik przeciwciała anty-PV lub GM do płytki do mikromiareczkowania. Układ płyty jest następujący (patrz również przykład poniżej). W próbkach bez przeciwciał (dobrze #1 i 6) dodać 12 μl GM zamiast przeciwciała anty-PV.
    Ważna uwaga:
    Jeśli w tym teście ma być testowanych wiele próbek PV, pomocna na tym etapie będzie wielokanałowa pipeta lub dozownik. Studnia #1 Cóż #2 Cóż #3 Cóż #4 Cóż #5 Cóż #6 Gm anty-P1+2+3 anty-P1+2 anty-P2+3 ani-P1+3 Gm
  3. Dodać 12 μl/basenik próbki wirusa. W jednej próbce bez wirusa (dobrze #6) dodaj 12 μl GM zamiast roztworu wirusa.
    Uwaga: Próbka wirusa jest supernatantem hodowli zakażonych komórek, zwykle komórek L20B lub komórek RD.
    Ważna uwaga:
    Jeśli w tym teście ma być testowanych wiele próbek PV, pomocna na tym etapie będzie pipeta wielokanałowa. Studnia #1 Cóż #2 Cóż #3 Cóż #4 Cóż #5 Cóż #6 Próbka wirusa Próbka wirusa Próbka wirusa Próbka wirusa Próbka wirusa Gm
  4. Weź odtworzony roztwór uczulonych cząstek o temperaturze od 4 °C do temperatury pokojowej i delikatnie postukaj, aby całkowicie zawiesić cząstki.
    Ważna uwaga:
    Po całkowitym zawieszeniu cząstek przez delikatne stukanie, cząstki należy natychmiast dodać do płytek, zanim zawieszone cząstki wytrącą się i utworzą niejednorodny roztwór.
  5. Dodaj 25 μl / studzienkę uczulonej cząstki do wszystkich studzienek.
    Ważna uwaga:
    Po dodaniu uczulonej cząstki, płytkę należy natychmiast poddać mieszaniu płytki, aby rozpocząć równomierną reakcję próbek. Dlatego dodawanie uczulonych cząstek powinno odbywać się za pomocą dozownika, aby zminimalizować opóźnienie czasowe między próbkami w płytce.
  6. Umieść płytkę do mikromiareczkowania na mieszarce płytkowej i mieszaj płytkę przez 30 sekund.
  7. Umieść płytkę do mikromiareczkowania na białym papierze (dla wygody obserwacji wzrokowej) na stole w temperaturze pokojowej (15 ̃30 °C) przez 2 godziny
    Ważna uwaga:
    Nie przesuwaj płytki w trakcie i po reakcji w celu obserwacji wyników i robienia zdjęć. Powstała aglutynacja nie jest stabilna i łatwo ją zakłócić poprzez przesuwanie płytek.
  8. Zrób zdjęcia płyty.
    Ważna uwaga:
    Częściowy wgląd w zdjęcia nie mógł dostarczyć wystarczających danych do późniejszego zbadania i przeglądu wyników w celu interpretacji. Należy wykonać kilka zdjęć, aby pokryć wszystkie dołki płytek, koncentrując się na obrazie aglutynacji dołków.

5. Interpretacja wyników

  1. Identyfikacja studni dodatnich i ujemnych. Porównaj aglutynację w próbkach z aglutynacją w przypadku braku kontroli wirusa i przeciwciał (wytrącanie cząstek żelatyny, brak aglutynacji) (ryc. 1 i 2). Obrazy aglutynacji, które są wyraźnie odróżniane od braku wirusa i braku kontroli przeciwciał (brak aglutynacji, kontrola ujemna) powinny być oceniane jako pozytywne, a obrazy aglutynacji, które są podobne do kontroli negatywnej, powinny być oceniane jako negatywne. Próbki, które wykazują wyraźną, ale tylko częściową aglutynację, mogą być oceniane jako dodatnie, ale rejestrowane jako "dodatnie (częściowa aglutynacja)".
  2. Identyfikacja PV. Interpretacja wyników na podstawie dodatnich i ujemnych dołków z przeciwciałami anty-PV w celu identyfikacji serotypów PV. Zasada interpretacji wyniku jest podobna do zasady testu neutralizacji w systemie hodowli komórkowej (np. dodatni wynik na obecność przeciwciał anty-P1+2 oznacza, że próbka zawiera PV typu 3).

6. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny wynik identyfikacji PV testu PA jest pokazany na rysunku 1. Wszystkie szczepy PV utworzyły aglutynację uczulonych cząstek żelatyny (próbki bez przeciwciał). W obecności odpowiednich przeciwciał anty-PV obserwowano wytrącanie się cząstek żelatyny (brak aglutynacji) podobne do braku kontroli wirusa i przeciwciał (kontrola ujemna) (np. PV1 (Sabin) w obecności przeciwciał anty-P1 + 2 lub anty-P3 + 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Identyfikacja PV za pomocą testu PA. Do identyfikacji za pomocą testu PA użyto roztworów wirusów PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) i PV3 (Sabin (miana wirusów odpowiednio 1,2 x 108 CCID50 / 12 μL, 8,2 x 107 CCID50 / 12 μL i 3,5 x 107 CCID50 / 12 μL). Brak kontroli wirusa i przeciwciał wykazał wytrącanie się cząstek żelatyny (brak aglutynacji, kontrola ujemna).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Interpretacja studni dodatnich i ujemnych. Roztwory wirusów PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) i PV3 (Sabin) (miana wirusów odpowiednio 2,4 x 108 CCID50 / 25 μL, 1,7 x 108 CCID50 / 25 μL i 7,3 x 107 CCID50 / 25 μL) rozcieńczono od 1/20 do 1/320, a następnie 25 μl rozcieńczonych próbek zbadano testem PA bez przeciwciał anty-PV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unikalnym punktem tego testu PA jest wykorzystanie cząsteczki PVR zamiast przeciwciał anty-PV do wykrywania PV 2. Pozwala to na specyficzne oddziaływanie uczulonych cząstek żelatyny z PV o równomiernym powinowactwie do wszystkich trzech serotypów PV 3-6. Użyliśmy immunoadhezynowej formy PVR (PVR-IgG2a) do uwrażliwiania cząstek żelatyny, ponieważ monomeryczne formy PVR mają tylko umiarkowane powinowactwo do pojedynczego miejsca wiązania na wirionie (stała dysocjacji 10-7 ̃-8 M) 7, 8 i z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Souji Masujima jest pracownikiem Działu Projektowania Nowych Produktów w firmie Fujirebio Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Junko Wada za jej doskonałą pomoc techniczną. Jesteśmy wdzięczni prof. Akio Nomoto za uprzejme udostępnienie wektora ekspresji bakulowirusa dla PVR-IgG2a. Badanie to było częściowo wspierane przez Grants-in-Aid for the Promotion of Polio Eradication and Research on Emerging and Re-Emerging Infectious Diseases z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Uczulone cząsteczki żelatynyFujirebio Inc.Zestaw
testowy Bufor do rekonstytucjiFujirebio Inc.Zestaw testowy
Płytka do mikromiareczkowaniaFujirebio Inc.Zestaw testowy
Przeciwciało anty-PVRIVM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Receptor poliwirusacz steczki elatynowetest aglutynacjineutralizacja wirusakombinacje przeciwciainkubacja w temperaturze pokojowejp ytka 96 do kowaobserwacja wizualna

Powiązane artykuły