Celowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą Parkinsona

Podsumowanie

Zaburzenia głosu są uciążliwe w procesie starzenia się oraz w chorobie Parkinsona. Ultradźwiękowe wokalizacje szczurów, które również są dotknięte tymi schorzeniami, mogą być wykorzystane do badania tych zaburzeń głosu, ich podłoży neuronalnych oraz charakteru powrotu do sprawności funkcjonalnej w wyniku interwencji behawioralnej.

Streszczenie

Zaburzenia głosu są powszechną komplikacją zarówno choroby Parkinsona (PD), jak i starzenia się; mogą one znacząco obniżyć jakość życia poprzez wpływ na zdolności komunikacyjne. ^{1, 2} Celowany trening (terapia mowy/głosu) może poprawić konkretne deficyty głosu,^{3, 4} choć mechanizmy leżące u podstaw interwencji behawioralnych nie są dobrze poznane. Systematyczne badanie zaburzeń głosu i terapii powinno uwzględniać wiele czynników trudnych do kontrolowania u ludzi, takich jak wiek, środowisko domowe, czas od wystąpienia objawów choroby, stopień zaawansowania choroby oraz przyjmowane leki. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu wykorzystuje zwierzęcy model wokalizacji, który umożliwia systematyczne badanie zmian w sensoromotorycznych mechanizmach sterujących głosem pod wpływem celowanego treningu. Procedury nagrywania i analizy ultradźwięków opisane w tym protokole mają zastosowanie w każdym badaniu ultradźwiękowych wokalizacji gryzoni.

Ultradźwiękowe wokalizacje gryzoni stają się cennym modelem do badania neuronalnych substratów zachowania.^5-8 Zarówno wokalizacje gryzoni, jak i ludzi niosą wartość semiotyczną i są wytwarzane poprzez modyfikację wypływającego strumienia powietrza za pomocą zwężenia krtani.^{9, 10} Zatem wokalizacje gryzoni mogą być użytecznym modelem do badania deficytów głosu w kontekście sensoryczno-motorycznym. Ponadto modele szczurze pozwalają nam badać neurobiologiczne podstawy regeneracji po deficytach za pomocą ukierunkowanego treningu.

Aby zamodelować PD, wykorzystujemy szczury Long-Evans (Charles River Laboratories International, Inc.) i wywołujemy parkinsonizm poprzez jednostronną infuzję 7 μg 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do przyśrodkowego pęczka przedmózgowego, co powoduje umiarkowaną do ciężkiej degenerację presynaptycznych neuronów prążkowia (szczegóły patrz: Ciucci, 2010).^{11, 12} W naszym modelu starzenia wykorzystujemy szczury Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).

Naszą główną metodą wywoływania wokalizacji jest eksponowanie samców szczurów z doświadczeniem seksualnym na samice szczurów w okresie receptywności seksualnej. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą, zostaje ona usunięta, a samiec kontynuuje wokalizację. Poprzez nagradzanie złożonych wokalizacji pokarmem lub wodą, można zwiększyć zarówno liczbę złożonych wokalizacji, jak i częstotliwość wokalizacji (Rysunek 1).

Mikrofon ultradźwiękowy zamontowany nad klatką domową samca rejestruje wokalizacje. Nagrywanie rozpoczyna się po usunięciu samicy szczura, aby wyizolować wołania samca. Wokalizacje mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym w celach treningowych lub nagrywane i analizowane offline. Poprzez nagrywanie i akustyczną analizę wokalizacji przed i po treningu wokalnym można ocenić skutki choroby oraz stopień przywrócenia prawidłowej funkcji dzięki treningowi. Model ten pozwala również powiązać zaobserwowane poprawy behawioralne (wokalne) ze zmianami w mózgu i układzie nerwowo-mięśniowym.

Protokół

1. Nagrania przed i po treningu

1. Rozpocznij monitorowanie ultradźwięków za pomocą programu Avisoft Recorder, stosując konfigurację przedstawioną na Rysunku 2.
2. Wokalizacje ultradźwiękowe można monitorować wizualnie, obserwując spektrogram w czasie rzeczywistym, lub słuchowo, korzystając ze słuchawek podłączonych do interfejsu rejestracji ultradźwięków.
3. Umieść samicę szczura w rui (podatną na kopulację) w klatce domowej badanego samca. Objawami rui są lordoza, drganie uszu oraz szybkie, gwałtowne ruchy. Samice w rui wywołują u samców więcej wokalizacji niż samice niepodatne na kopulację.
4. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą (np. węszenie, gonitwa i/lub próby kopulacji), usuń samicę i rejestruj wokalizacje samca przez 1-2 minuty.
5. Jeśli samiec nie wyda dźwięków natychmiast, na krótko wprowadź samicę z powrotem do klatki domowej samca, aby stymulować wokalizację.

2. Trening wokalny

1. Rozpocznij monitorowanie ultradźwiękowe za pomocą programu Avisoft Recorder, stosując konfigurację przedstawioną na Rysunku 2.
2. Umieść samca szczura w jego domowej klatce pod mikrofonem.
3. Wprowadź samicę szczura do klatki samca. Zgodnie z wcześniejszymi informacjami, samica powinna znajdować się w fazie rui, aby zmaksymalizować odpowiedź wokalną samca.
4. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą, usuń samicę z klatki.
5. Natychmiast po tym, jak samiec wyda docelową wokalizację, nagrodź go jednocześnie kliknięciem długopisu oraz krótkim udostępnieniem butelki z wodą lub przysmaku. Na początku nagradzane jest każde wołanie z modulacją częstotliwości 50-kHz (Rysunek 5B). W miarę postępów w treningu wzmacniane są jedynie coraz bardziej złożone ciągi wołań, np. serie od 5 do 10 wołań następujących szybko po sobie.
6. Kontynuuj sesję treningową aż do podania 30 wzmocnień. Zazwyczaj trwa to od 5 do 10 minut.

3. Przygotowanie do analizy akustycznej

1. Zawsze archiwizuj oryginalne pliki dźwiękowe i wykonuj edycje oraz pomiary na kopii roboczej, ponieważ analiza będzie wymagała filtrowania i usuwania szumów z każdego pliku.
2. Używając trybu wsadowego w programie Avisoft SASLab Pro, zastosuj filtr górnoprzepustowy o częstotliwości 25 kHz dla wszystkich plików dźwiękowych przeznaczonych do analizy, aby usunąć niepożądany szum poniżej wokalizacji ultradźwiękowych.
3. Aby skorzystać z funkcji automatycznego wykrywania w SASLab Pro, należy najpierw określić próg szumu. W tym celu otwórz plik dźwiękowy i utwórz spektrogram, korzystając z ustawień przedstawionych na Rysunku 3.
4. Okno Automatycznych Pomiarów Parametrów (Automatic Parameter Measurements) należy skonfigurować zgodnie z ustawieniami pokazanymi na Rysunku 4.
5. Znajdź obszar spektrogramu, w którym nie występują żadne sygnały ani szumy; jest to szum tła.
6. Korzystając z opcji „automatic (single threshold)”, ustaw próg w sekcji Element separation okna dialogowego konfiguracji Automatycznych Pomiarów Parametrów nieco powyżej poziomu szumu tła, przesuwając czarną linię w oknie widma mocy nad spektrogramem. Na Rysunku 4 próg został ustawiony na -55 dB.
7. Na dole okna dialogowego ustaw wartość „Reject if peak amplitude is less than” na 1 dB poniżej progu wyznaczonego w poprzednim kroku. Te dwie wartości powinny być teraz stosowane dla wszystkich analizowanych plików dźwiękowych, pod warunkiem, że wszystkie ustawienia nagrywania były identyczne.

4. Identyfikacja wokalizacji

1. Aby oznakować wokalizacje przy użyciu automatycznego progu ustawionego powyżej, należy najpierw utworzyć spektrogram z powyższymi ustawieniami.
2. Ręcznie usuń wszelkie szumy, które spełniają następujące kryteria: 1) zostały błędnie zidentyfikowane jako wokalizacja, 2) wpływają na rozróżnienie początku i/lub końca wokalizacji i/lub 3) zostały błędnie zidentyfikowane jako najwyższa lub najniższa częstotliwość w wokalizacji (wskazane odpowiednio przez górną i dolną czerwoną linię). Alternatywnie, czasy rozpoczęcia/zakończenia etykiet wokalizacji można dostosować ręcznie po utworzeniu trwałych etykiet w kroku 4.5 poniżej. Szumy wpływające na pomiary wysokich i niskich częstotliwości muszą jednak zostać usunięte ręcznie.
3. W niektórych przypadkach wokalizacja nie będzie mogła zostać oddzielona od otaczających szumów, takich jak dźwięk ściółki podczas poruszania się. W takich przypadkach sygnał nie może zostać dokładnie przeanalizowany i należy go usunąć.
4. Po zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji na stałe usuń usunięte sekcje spektrogramu z pliku dźwiękowego, wybierając opcję „Remove erased spectrogram sections from waveform…” z rozwijanego menu Tools. Jeśli ta komenda nie zostanie wykonana przed zamknięciem spektrogramu, wszystkie prace związane z usuwaniem zostaną utracone.
5. Utwórz trwałe etykiety w pliku dźwiękowym, klikając przycisk „edit” w sekcji Element Separation w oknie konfiguracji Automatic Parameter Measurements.
6. Wizualnie i słuchowo przejrzyj każdą oznakowaną wokalizację, aby określić jej kategorię: prosta, modulowana częstotliwościowo (FM) lub harmoniczna. Przypisz odpowiednią etykietę za pomocą zdefiniowanych modułów tekstowych. Przykłady każdej kategorii wokalizacji przedstawiono na Ryc. 5.
7. Zamknij spektrogram, zapisz plik dźwiękowy i przejdź do analizy kolejnego pliku dźwiękowego.

5. Pomiary akustyczne

1. Po zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji w plikach dźwiękowych, użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego (Tools: Batch Processing), aby automatycznie zmierzyć parametry akustyczne wszystkich plików.
2. W oknie dialogowym przetwarzania wsadowego wybierz z menu rozwijanego opcję „Automatic Parameter Measurements”.
3. Zaznacz pole wyboru „process all files in the selected folder”, następnie kliknij przycisk „folder” i wybierz folder, w którym zapisano pliki dźwiękowe.
4. Kliknij „Start”, a każdy plik zostanie automatycznie przeanalizowany zgodnie z ustawieniami ostatnio zastosowanymi w oknie dialogowym konfiguracji Automatic Parameter Measurement.
5. Pomiary zostaną zapisane w pliku tekstowym, który można zdefiniować za pomocą polecenia DDE Parameters/Log File Setting. Ten plik tekstowy można następnie zaimportować do programu do analizy statystycznej.

6. Reprezentatywne wyniki:

Wokalizacje ultradźwiękowe szczurów ulegają zmianom pod wpływem procesów fizjologicznych związanych ze starzeniem oraz w modelach choroby Parkinsona indukowanych 6-OHDA. ¹³ Typowo obserwuje się obniżenie jakości wokalizacji ultradźwiękowych, co objawia się redukcją następujących ilościowych parametrów akustycznych: szerokości pasma, częstotliwości szczytowej, czasu trwania oraz intensywności. Rycina 6 przedstawia wokalizacje z modulacją częstotliwości u szczura w modelu PD w trzech różnych punktach czasowych: w stanie wyjściowym, po indukcji PD oraz po treningu wokalizacji. W stanie PD sygnał wykazuje redukcję szerokości pasma, czasu trwania i intensywności. Dodatkowo modulacja częstotliwości stała się nieregularna.

Oprócz degradacji specyficznych parametrów akustycznych, obserwujemy również mniejszą ogólną złożoność rodzajów emitowanych wokalizacji u szczurów w starszym wieku oraz z parkinsonizmem. Na przykład, po indukowaniu PD szczur emituje większą liczbę prostych sygnałów i mniejszą liczbę sygnałów modulowanych częstotliwością. Po treningu wokalizacji wiele parametrów akustycznych, takich jak czas trwania i intensywność, zbliża się do poziomów bazowych, a liczba złożonych sygnałów wzrasta (Rycina 6). Szczury w starszym wieku wykazują podobną degradację parametrów akustycznych w swoich wokalizacjach ultradźwiękowych. Obecnie badamy efekty treningu wokalnego u szczurów w starszym wieku.

Rycina 1. Liczba wokalizacji na sesję (cel osiągnięty przez wszystkie szczury w każdym tygodniu) oraz częstotliwość wokalizacji (przedstawiono średnią i błąd standardowy) wzrastają w ciągu 6-tygodniowego okresu treningowego w grupie szczurów Fischer 344/Brown Norway F1 zarówno młodych (9 mo), jak i starych (32 mo).

Rysunek 2. Reprezentatywne wokalizacje dla każdej z trzech kategorii wokalizacji 50 kHz; (A) proste, (B) modulowane częstotliwościowo i (C) harmoniczne.

Rysunek 3. Reprezentatywne wokalizacje z modulacją częstotliwości u jednego szczura w stanie (A) bazowym, (B) po indukcji PD oraz (C) po treningu wokalizacji.

Dyskusja

Wokalizacje ultradźwiękowe u szczurów wydają się być podatne na procesy starzenia oraz choroby, takie jak choroba Parkinsona. Wokalizacje te stanowią behawioralny model funkcji głosowej, obejmujący deficyty towarzyszące zmianom fizjologicznym wynikającym z choroby i starzenia się. Ponadto zmiany akustyczne w wokalizacjach ultradźwiękowych są łatwo mierzalne i mierzalne ilościowo. Co więcej, wokalizacje ultradźwiękowe mogą być modyfikowane poprzez interwencje behawioralne. W związku z tym wokalizacje ultradźwiękowe szczurów stanowią przydatny model do badania wpływu chorób, starzenia się oraz interwencji terapeutycznych zarówno na zachowanie, jak i na leżące u ich podstaw mechanizmy neurobiologiczne.

Nasza metoda treningu wokalnego wykorzystuje bodziec warunkowy (kliknięcie) powiązany z pozytywnym wzmocnieniem (nagrodą w postaci wody lub pokarmu). Kliknięcie, po którym następuje nagroda, służy do wzmacniania wokalizacji o rosnącym stopniu złożoności. Wokalizacje złożone definiujemy jako takie, które zawierają komponent „trela” (modulowany częstotliwościowo) (Rycina 5B), w przeciwieństwie do tych, które są „płaskie” i utrzymują pojedynczą częstotliwość (Rycina 5A). Ten komponent modulowany częstotliwościowo jest łatwo identyfikowalny dzięki swojemu sinusoidalnemu wyglądowi. Choć wokalizacje 50-kHz mogą być w pełni sinusoidalne (Rycina 5B), często spotyka się bardziej złożone wokalizacje 50-kHz, które składają się częściowo z tego komponentu modulowanego częstotliwościowo, a także z dużych skoków częstotliwości lub krótkiego komponentu płaskiego. Te bardziej złożone wokalizacje mogą mieć krótkie przerwy trwające mniej niż 10 ms między komponentami, lecz są uznawane za pojedynczą wokalizację. Chociaż możliwa jest dalsza szczegółowa subklasyfikacja tych wokalizacji w trybie offline,¹⁴ wszystkie wokalizacje 50-kHz zawierające komponent modulowany częstotliwościowo klasyfikujemy jako złożone, aby ograniczyć potrzebę subiektywnej klasyfikacji online oraz zmniejszyć zmienność wzmocnienia. W pracy we własnym laboratorium istotne jest wybranie sposobu klasyfikacji i analizy danych zgodnie z projektem badania, który jest odpowiedni dla celu prowadzonej pracy.

Podczas stosowania tego protokołu należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Przede wszystkim, mimo jednorodności genetycznej i spójności proceduralnej, szczury wykazują zmienną reakcję na trening. Niektóre szczury naturalnie wokalizują częściej niż inne,⁵ lub są bardziej motywowane ekspozycją na samicę niż nagrodą w postaci pokarmu lub wody. Jednym ze sposobów uwzględnienia tej zmienności jest badanie zmian w parametrach akustycznych od wokalizacji bazowych poszczególnych szczurów do ich wokalizacji po wywołaniu zmiany (lesji) i po treningu. Chociaż nie jest to omawiane w niniejszym protokole, stosujemy również testy behawioralne w celu ilościowego określenia zainteresowania samicą, takie jak czas do momentu wejścia na samicę (latency to mount). Ponadto, w zależności od wieku i poziomu aktywności poszczególnych szczurów, podczas treningu na klatce domowej może być wymagana górna osłona z drutu, aby zapobiec ucieczce. Pomimo indywidualnej zmienności, z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół u różnych szczepów i w różnym wieku, aby poprawić wokalizacje w stosunku do poziomu bazowego każdego osobnika.

Szczury są wrażliwe na pozornie niewielkie zmiany w środowisku, takie jak zapachy, temperatura i obecność różnych osób. Należy starać się unikać stosowania pachnących produktów do pielęgnacji osobistej, takich jak balsamów, produktów do włosów i perfum. Przed przystąpieniem do szkolenia osoba przeprowadzająca badanie musi czuć się swobodnie w interakcji ze szczurami i podczas ich manipulacji. Co więcej, wszelkie niespójności w składzie personelu lub warunkach środowiskowych mogą wpłynąć na reakcję wokalną szczurów.

Ponieważ szczury są zwierzętami nocnymi, powinny być utrzymywane w odwróconym cyklu świetlnym, aby trening mógł odbywać się w ciemnej fazie ich cyklu, kiedy są one najbardziej aktywne. W pomieszczeniu treningowym stosujemy oświetlenie czerwonym światłem. Ponadto, jeśli w trakcie treningu stosowana jest nagroda w postaci wody, dostęp szczurów do wody powinien być ograniczony. Nasze szczury mają ograniczony dostęp do wody przez 21 godzin przed sesją treningową. Ustalono, że trzygodzinny dostęp do wody to najmniej restrykcyjny okres, który pozwala na wykorzystanie wody jako wzmocnienia w badaniach behawioralnych, nie powodując przy tym istotnego pogorszenia stanu zdrowia lub dobrostanu zwierząt, co zostało zatwierdzone przez naszą Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Szczury otrzymują dostęp do wody w losowych odstępach czasu (od 10 do 30 minut) po treningu, a następnie mają swobodny dostęp do wody przez trzy godziny w ciemnej fazie swojego cyklu świetlnego. Szczury należy codziennie sprawdzać pod kątem oznak odwodnienia oraz ważyć co drugi dzień, aby upewnić się, że nie nastąpiła znaczna utrata masy ciała (powyżej 10%). Ograniczenie dostępu do pokarmu nie jest konieczne w przypadku stosowania smakołyków jako nagrody. W sprzedaży dostępne są specjalistyczne przysmaki dla szczurów, jednak stwierdziliśmy, że niewielki kawałek słodkich płatków śniadaniowych stanowi skuteczną nagrodę.

Jak wspomniano powyżej, samice szczurów w okresie ruj wywołują silniejszą reakcję wokalną samców niż samice nieprzyjmujące seksualnie. Utrzymując w kolonii dużą liczbę samic, istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że każdego dnia przynajmniej jedna samica będzie w okresie ruj. Jednak ruj u samic szczurów można również wywołać farmakologicznie poprzez podskórne wstrzyknięcie 10 μg β-estradiolu w 0,1 cc sterylnego oleju sezamowego na 48 h przed treningiem, a następnie 500 μg progesteronu w 0,1 cc sterylnego oleju sezamowego na 4 h przed treningiem. Ponadto samce szczurów, które nie miały wcześniej kontaktu z samicami, muszą zdobyć doświadczenie seksualne przed treningiem wokalnym. Osiąga się to poprzez umieszczenie w klatce samca samicy wykazującej oznaki przyjmowania seksualnego (gwałtowne ruchy, lordoza, drżenie uszu) aż do momentu, gdy samiec wejdzie na samicę i ejakuluje. Samce mogą nie wchodzić na samice podczas pierwszych kilku sesji; samicę można usunąć po tym, jak samiec wykaże zainteresowanie, węsząc i/lub goniąc samicę po klatce. Zdobywanie doświadczenia seksualnego przeprowadza się raz dziennie przez dwa tygodnie. Okres ten stanowi również okazję dla szczurów do habituacji do eksperymentatora(ów) oraz pomieszczenia nagraniowego.

Jednym z ograniczeń tej metody jest subiektywność określania typu wokalizacji. Dodatkowo czynnik ten ogranicza szybkość gromadzenia danych, ponieważ każde zawołanie musi zostać niezależnie zbadane i zaklasyfikowane ręcznie. Z tym wiąże się znaczenie posiadania doświadczonych oceniających, którzy przeszli spójne szkolenie w zakresie identyfikacji wokalizacji. W obrębie własnego laboratorium należy ocenić zarówno niezawodność wewnątrzoceniającą, jak i międzyoceniającą.

Podsumowując, wokalizacje ultradźwiękowe u gryzoni są wykorzystywane w wielu różnych modelach do badania zależności między mózgiem a zachowaniem, w tym stanów emocjonalnych, nagrody i uzależnień oraz stanów chorobowych, takich jak autyzm.^6,14-16 Ta nowatorska metoda umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw ukierunkowanego treningu wokalnego w leczeniu deficytów głosu w procesie starzenia oraz w chorobie Parkinsona. Metoda ta ma potencjał do zastosowania w innych modelach chorób wpływających na komunikację i głos.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kondensacyjny mikrofon ultradźwiękowy CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101