Method Article

Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do stosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego

DOI:

10.3791/2844

⸱

July 21st, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metalizację, oczyszczanie i charakterystykę kompleksów lantanowców. Opisane tutaj kompleksy mogą być sprzężone z makrocząsteczkami, aby umożliwić śledzenie tych cząsteczek za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligandy na bazie poliaminopolikarboksylanu są powszechnie używane do chelatowania jonów lantanowców, a powstałe kompleksy są przydatny jako środki kontrastowe do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Wiele dostępnych na rynku ligandów jest szczególnie przydatnych, ponieważ zawierają Grupy funkcyjne, które pozwalają na szybką, wysoką czystość i wysoką wydajność koniugacji z makrocząsteczkami i biomolekułami za pośrednictwem amino-reaktywnych aktywowane estry i grupy izotiocyjanianowe lub maleimidy reagujące z tiolami. Podczas gdy metalizacja tych ligandów jest uważana za powszechną wiedzy z zakresu chemii biokoniugacji, subtelne różnice w procedurach metalizacji muszą być brane pod uwagę przy wybór metalowych materiałów wyjściowych. Ponadto istnieje wiele opcji oczyszczania i charakteryzowania, a wybór najbardziej Skuteczna procedura częściowo zależy od doboru materiałów wyjściowych. Te subtelne różnice są często zaniedbywane w publikowanych Protokołów. W tym przypadku naszym celem jest zademonstrowanie powszechnych metod metalizacji, oczyszczania i charakterystyki kompleksów lantanowców które mogą być stosowane jako środki kontrastowe do rezonansu magnetycznego (ryc. 1). Oczekujemy, że niniejsza publikacja umożliwi naukowcom zajmującym się biomedycyną włączenie reakcji kompleksowania lantanowców do ich repertuaru powszechnie stosowanych reakcji poprzez ułatwienie wyboru materiałów wyjściowych i metody oczyszczania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metalizacja przy użyciu soli LnCl3

  1. Rozpuść ligand w wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 30-265 mM. Kwas pentaoctowy ligandu 2-(4-izotiocyjanobenzylo)-dietylenotriaminy (p-SCN-Bn-DTPA) został użyty w tym filmie w stężeniu 73 mM.
  2. Dostosować pH roztworu liganda do poziomu między 5,5 a 7,0, dodając 1 M NH4OH. W tym filmie użyto 0,2 ml roztworu 1 M NH4OH.
  3. Rozpuścić 1-2 równoważniki LnCl3 w wodzie, aby otrzymać roztwór o stężeniu 5-1000 mM. W tym filmie EuCl3 i GdCl3 stosowano w stężeniach 111 mM. Nadmiar metalu jest często używany do doprowadzenia metalizacji do końca i w konsekwencji uprość oczyszczanie.
  4. Dodać roztwór LnCl3 do roztworu liganda, mieszając.
  5. Po dodaniu LnCl3 dostosować pH otrzymanej mieszaniny reakcyjnej do poziomu od 5,5 do 7,0, dodając 0,2 M NH4OH. A w tym filmie użyto łącznie 0,5 ml 0,2 M roztworu NH4OH. Jeśli twój ligand zawiera wrażliwe na kwasy grupy funkcyjne, dostosuj pH wielokrotnie na tym etapie. UWAGA - Jeśli roztwór stanie się zbyt zasadowy, wszelkie wrażliwe na zasady grupy funkcyjne, takie jak izotiocyjanian, stanie się bezużyteczny do koniugacji.
  6. Monitoruj reakcję za pomocą pomiarów pH. Reakcja jest zakończona, gdy pH pozostaje stałe.

2. Badanie podnoszące pH (nie jest to uwzględnione w tym filmie, ale jest dobre dla ligandów bez grup funkcyjnych wrażliwych na zasady)

  1. Dodać skoncentrowany NH4OH do mieszaniny reakcyjnej, aby dostosować pH do ≥11. Ten krok wytrąci wszelkie nieskompleksowane metal jako nierozpuszczalny wodorotlenek.
  2. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,2 μm. Jeżeli mieszanina reakcyjna zatka filtr, odwirowanie i dekantacja przed Zalecane jest filtrowanie.
  3. Jeśli dializa nie zostanie przeprowadzona, należy usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (zalecane jest odparowanie obrotowe lub liofilizacja).
  4. Kroki 2.1-2.3 można powtórzyć, jeśli pozostaje wolny lantanowiec.

3. Diagnostyka dializ

  1. Przyciąć rurkę do dializy na odpowiednią długość (postępuj zgodnie z wytycznymi producenta), aby utrzymać objętość próbki, pozostawiając dodatkową długość (około 10% objętości próbki). W tym filmie zastosowano membranę o masie cząsteczkowej 100-500 daltonów (MWCO), ale w razie potrzeby można użyć większych rurek MWCO, jeśli koniugacja jest wykonywana przed metalizacją. W razie potrzeby kasety do dializy mogą być również używane jako alternatywa dla rurek dializacyjnych.
  2. W razie potrzeby w oparciu o wytyczne producenta, namocz przecięty przewód dializacyjny w wodzie na 15 minut w temperaturze otoczenia.
  3. Napełnij zbiornik dializacyjny (w tym filmie użyto zlewki o pojemności 1 l) wodą (dializatem). Objętość dializatu powinna być około 100 razy większa niż objętość próbki.
  4. Złożyć dwukrotnie jeden koniec rurki i zabezpieczyć złożoną część rurki za pomocą zacisku do dializy. Owinąć koniec zamknięcia gumową opaską, aby upewnić się, że pozostaje zamknięte podczas dializy.
  5. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez filtr 0,2 μm i załadować filtrat do Otwarty koniec rurki uważając, aby nie rozerwać rurki. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca nad głową, aby zamknąć rurkę.
  6. Złóż dwukrotnie pozostały otwarty koniec rurki, zabezpiecz zamknięciem i owiń zamknięcie gumką, jak w kroku 3.4.
  7. Przymocować szklaną fiolkę z powietrzem do zacisku na jednym końcu rurki do dializy za pomocą gumowej opaski. Podłączyć fiolkę zawierającą piasek do drugiego zacisku. Fiolki te zapewniają, że rurka pozostaje zanurzona w dializacie.
  8. Umieścić pełną rurkę w zbiorniku dializacyjnym zawierającym dializat
    9. .
  9. Wymieszać dializ za pomocą magnetycznej płytki mieszającej z małą prędkością (bez wirowania) w temperaturze otoczenia.
  10. Zmieniaj dializat 3 razy w ciągu dnia (w tym filmie dialilat był zmieniany po 2,5, 6,5 i 11,5 godzinie), a następnie pozwól dializie kontynuować się przez noc (w sumie 20-28 godzin dializy).
  11. Wyjąć rurkę do dializy z dializatu i ostrożnie otworzyć jedno zamknięcie, aby usunąć próbkę. Przemyć rurkę do dializy 3x wodą i połączyć popłuczyny z próbką.
  12. Usuń wodę pod zmniejszonym ciśnieniem. W tym filmie zastosowano liofilizację.

4. Ocena obecności wolnego metalu

  1. Rozpuścić kompleks metalowy w buforze octanowym (przygotowanie buforu: Rozpuścić 1,4 ml kwasu octowego w 400 ml wody, dostosować pH do 5,8 za pomocą 1 M NH4OH i dodać wodę, aby uzyskać całkowitą objętość 500 ml) i dodać wskaźnik pomarańczy ksylenolowej (16 μM w buforze pH 5,8). W tym kontekście wideo, 0,3 mg kompleksu rozpuszczono w 0,3 ml buforu i dodano 3 ml roztworu wskaźnikowego.
  2. Wykryj obecność wolnego metalu poprzez obserwację zmiany koloru wskaźnika z żółtego na fioletowy.
  3. W razie potrzeby ilość wolnego metalu można określić ilościowo, tworząc krzywą kalibracyjną1. Alternatywnie, barwnik arsenazo III może należy stosować zamiast oranżu ksylenolowego2. Jeśli pozostaje wolny metal, próbka powinna być dalej oczyszczana za pomocą dializy, kolumny odsalającej lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przed charakterystyką.

5. Wyznaczanie liczby koordynacyjnej wody (q)

  1. Przygotować roztwór kompleksu zawierającego EuIII (~1 mM) wH2Oi inny roztwór o tym samym stężeniu w H 2 O D2O. Przed analizą roztwórD2Omusi zostać odparowany i trzykrotnie rozpuszczony wD2Ow celu usunięcia pozostałości H2O.
  2. Dodaj roztwór wodny do czystej kuwety i umieść kuwetę w spektrofluorometrze.
  3. Wykonaj skany wzbudzenia i emisji, aby określić maksima dla każdego z nich (odpowiednio ~395 nm i ~595 nm).
  4. Przeprowadzić eksperyment z zanikiem czasowym fosforescencji, stosując następujące parametry: długości fal wzbudzenia i emisji wyznaczone na podstawie Krok 5.3, Szerokości szczeliny wzbudzenia i emisji (5 nm), liczba błysków (100), opóźnienie początkowe (0,01 ms), maksymalne opóźnienie (13 ms) i opóźnienie przyrost (0,1 ms). Te warunki są odpowiednie dla większości kompleksów, ale maksymalne wartości opóźnienia i przyrostu można zwiększyć lub zmniejszyła się w przypadku gatunków o wyjątkowo długim lub bardzo krótkim czasie rozkładu.
  5. Powtórzyć krok 5.4 z roztworemD2Oprzygotowanym w kroku 5.1.
  6. Na podstawie danych dotyczących zaniku luminescencji uzyskanych w 5.4 i 5.5 wykreśl naturalny logarytm intensywności w funkcji czasu. Nachylenie tych linii wynosi szybkość zaniku (τ-1) (rysunek 2). W tym filmie wideo program Microsoft Excel 2007 został użyty do wygenerowania wykresów logarytmu naturalnego na podstawie nieprzetworzonych danych. Użyj szybkości zaniku w równaniu opracowanym przez Horrocksa i współpracowników (równanie 1)3. Jeśli twój ligand zawiera grupy OH lub NH skoordynowane z metalem, równanie należy zmodyfikować przed użyciem3.

eq 1:   figure-protocol-1

6. Pomiary relaksacyjności

  1. W analizatorze czasu relaksacji wybrać żądany tryb aplikacji: T1 (czas relaksacji podłużnej) lub T2 (czas relaksacji poprzecznej).
  2. Przygotować serię próbek, które zawierają różne stężenia kompleksu zawierającego GdIII w wodnym rozpuszczalniku. W tym filmie jako rozpuszczalnik użyto wody i przygotowano roztwory 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 i 0 mM. Można użyć innych wodnych rozpuszczalników lub, ale ważne jest, aby użyć rozpuszczalnika jako ślepej próby. Ostateczna objętość próbki jest specyficzna dla używanego instrumentu.
  3. Umieść próbkę w instrumencie i pozostaw ją na 5 minut, aby zrównoważyła się z temperaturą instrumentu (37 °C na tym filmie).
  4. Określ czas relaksacji (w jednostkach s), dostosowując parametry oprogramowania w celu uzyskania gładkiej krzywej wykładniczej dla T1 lub T2 (reprezentatywne krzywe dla T1 i T2 pokazano na rysunku 3).
  5. Powtórzyć kroki 6.3 i 6.4 dla wszystkich próbek, w tym dla próby ślepej.
  6. Obliczyć odwrotność zmierzonych wartości T1 lub T2 w jednostkach s-1.
  7. Wykreślić wartości T 1-1 lub T 2-1 w funkcji stężenia GdIII (w jednostkach mM). Ze względu na higroskopijny charakter kompleksów zawierających GdIII, należy potwierdzić stężenie GdIII za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej lub spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie. Dopasuj działkę do linii prostej. Reprezentatywny wykres pokazano na rysunku 4.
  8. Nachylenie dopasowanej linii jest relaksywnością (r1 lub r2 odpowiednio dla T1 i T2) i ma jednostki mM-1 s-1.

7. Reprezentatywne wyniki

Dane reprezentatywne dla kroków w tym protokole zostały zawarte w sekcji Tabele i Rysunki. Oprócz liczby koordynacyjnej wody i charakterystyki relaksacyjności opisanej w protokole, ważne jest scharakteryzowanie produktów końcowych przy użyciu standardowych technik chemicznych. Tożsamość związku można uzyskać za pomocą spektrometrii mas i reprezentatywnych widm masowych przedstawiające diagnostyczne wzorce izotopowe dla kompleksów zawierających GdIII i EuIII przedstawiono na rysunku 5. Ponadto, w przypadku kompleksów zawierających lantanowców innych niż GdIII, spektroskopia NMR może być stosowana do identyfikacji produktu. Aby scharakteryzować czystość kompleksu, można zastosować HPLC lub analizę elementarną, lub oba te elementy.

figure-protocol-2
Rysunek 1. Ogólny schemat metalizacji i oczyszczania: Schemat przedstawiający ogólną procedurę metalizacji i powody wyboru różnych dróg oczyszczania.

figure-protocol-3
Rysunek 2. Wykres natężenia luminescencji: Reprezentatywny wykres naturalnego logarytmu intensywności w funkcji czasu z sekcji 5. Nachylenia linii wygenerowanych z podobnych krzywych uzyskanych dla wody i roztworów D2O są używane z równaniem 1 do scharakteryzowania liczby koordynacyjnej wody kompleksów zawierających EuIII.

figure-protocol-4
Rysunek 3. Krzywe czasu zaniku relaksacji: Reprezentatywne dane dla (po lewej) akwizycji T1 i (po prawej) T2. Odchylenia od tych kształtów krzywych dałyby niewiarygodne dane.

figure-protocol-5
Rysunek 4. Oznaczanie relaksacyjności: Reprezentatywny wykres 1/T1 w funkcji stężenia GdIII. Nachylenie dopasowanej linii jest relaksacyjne i ma jednostki mM-1 s-1.

figure-protocol-6
Rysunek 5. Widma masowe: Reprezentatywne widma masowe przedstawiające wzorce izotopów diagnostycznych dla (po lewej) kompleksów zawierających GdIII i (po prawej) kompleksów zawierających EuIII. Czarne piki Gaussa reprezentują teoretyczny rozkład izotopów, a czerwone linie to rzeczywiste dane.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę publikacji, które zawierają środki kontrastowe na bazie lantanowców4-14, ważne jest, aby zachować ostrożność przy przygotowywaniu, oczyszczaniu i charakteryzowaniu produktów, aby zapewnić powtarzalne i porównywalne wyniki. Kompleksy te są często uważane za trudne do oczyszczenia i scharakteryzowania w stosunku do cząsteczek organicznych ze względu na ich paramagnetyczny charakter i czułość dowolnych grup funkcyjnych, które można wykorzystać do biokoniugacji. Opisaliśmy powszech...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy funduszom startowym z Wayne State University (MJA), grantowi z American Foundation for Aging Research (SMV) oraz Pathway to Independence Career Transition Award (R00EB007129) z National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the National Institutes of Health (MJA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EuCl3∙ 6H2OSigma-Aldrich203254-5G
p-SCN-Bn-DTPAMakrocykliczneB-305
Wodorotlenek amonuEMD MilliporeAX1303-3
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) Membrana do dializy - 500 DMWCO Fisher Scientific68-671-24
Millipore IC Millex-LG Jednostki filtrująceFisher ScientificSLLG C13 NL
sól tetrasodowa pomarańczy ksylenolowejAlfa Aesar41379
kwas octowyFluka49199
D2OCambridge Isotope LaboratoriesOczyszczacz wody DLM-4-25
ELGAPurelab Ultra
wysokowydajna chromatografia cieczowa i spektrometria masShimadzu CorporationLCMS-2010EV
Spektrofotometr UV-vis
Miernik pH Fisher Scientific10-030-133
Instruments IncFluoromax-4
Kalkulator masy cząsteczkowej wersja 6.46 autorstwa Matthew Monr–, pobrany 17 października 2009 r.figure-materials-1 http://ncrr.pnl.gov/software/Kalkulator
Analizator czasu relaksacji Bruker Corporation mq60 minispec Liofilizator Fisher Scientific 20-624-00092 Spektrofluorometr Hanna Instruments HI 221 Horiba masy cząsteczkowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lanthanide ComplexesMRI Contrast AgentsMetalation ProcedureDialysis PurificationRelaxivity MeasurementsWater Coordination NumberFree Metal DetectionMass Spectrometry CharacterizationLuminescence Decay AnalysisRelaxation Time Analysis

Related Articles