Artykuł metodologiczny

Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do zastosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2844

⸱

21 lipca 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy proces metalacji, oczyszczania i charakterystyki kompleksów lantanowców. Opisane tutaj kompleksy mogą być sprzęgane z makrocząsteczkami, co umożliwia śledzenie tych cząsteczek za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym.

Streszczenie

Ligandy oparte na poliaminopolikarboksylanach są powszechnie stosowane do chelatowania jonów lantanowców, a otrzymane w ten sposób kompleksy są użyteczne jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym (MRI). Wiele dostępnych komercyjnie ligandów jest szczególnie przydatnych, ponieważ zawierają one grupy funkcyjne umożliwiające szybką, wysokiej czystości i wysokowydajną koniugację z makrocząsteczkami i biomolekułami za pomocą aktywowanych estrów reaktywnych wobec amin, grup izotiocyjanianowych lub maleimidów reaktywnych wobec tioli. Chociaż metalacja tych ligandów jest uważana za wiedzę powszechną w dziedzinie chemii biokoniugacji, przy wyborze substratów metalicznych należy wziąć pod uwagę subtelne różnice w procedurach metalacji. Ponadto istnieje wiele opcji oczyszczania i charakteryzacji, a wybór najskuteczniejszej procedury zależy częściowo od wyboru substratów. Te subtelne różnice są często pomijane w publikowanych protokołach. Naszym celem jest tutaj zaprezentowanie powszechnych metod metalacji, oczyszczania i charakteryzacji kompleksów lantanowców, które mogą być stosowane jako środki kontrastowe w MRI (Rysunek 1). Spodziewamy się, że niniejsza publikacja umożliwi naukowcom z obszaru nauk biomedycznych włączenie reakcji kompleksowania lantanowców do ich zestawu powszechnie stosowanych reakcji poprzez ułatwienie wyboru substratów i metod oczyszczania.

Protokół

1. Metalowanie z wykorzystaniem soli LnCl3

  1. Rozpuścić ligand w wodzie w celu przygotowania roztworu o stężeniu 30-265 mM. W tym filmie zastosowano ligand kwas 2-(4-izotiocyjanatobenzylo)-dietylenotriaminopentaoctowy (p-SCN-Bn-DTPA) w stężeniu 73 mM.
  2. Dostosować pH roztworu ligandu do wartości między 5,5 a 7,0, dodając 1 M NH4OH. W tym filmie wykorzystano 0,2 mL roztworu 1 M NH4OH.
  3. Rozpuścić 1-2 ekwiwalenty LnCl3 w wodzie, aby otrzymać roztwór o stężeniu 5-1000 mM. W tym filmie użyto EuCl3 oraz GdCl3 w stężeniu 111 mM. Nadmiar metalu jest często stosowany, aby doprowadzić proces metalacji do końca, a w konsekwencji uprościć oczyszczanie.
  4. Dodać roztwór LnCl3 do roztworu ligandu podczas mieszania.
  5. Po dodaniu LnCl3 dostosować pH otrzymanej mieszaniny reakcyjnej do wartości między 5,5 a 7,0, dodając 0,2 M NH4OH. W tym filmie łącznie zużyto 0,5 mL roztworu 0,2 M NH4OH. Jeśli ligand zawiera grupy funkcyjne wrażliwe na kwasy, należy wielokrotnie korygować pH podczas tego etapu. OSTROŻNIE – jeśli roztwór stanie się zbyt zasadowy, wszelkie grupy funkcyjne wrażliwe na zasady, takie jak izotiocyjanian, staną się nieprzydatne do koniugacji.
  6. Monitorować przebieg reakcji poprzez pomiary pH. Reakcja jest zakończona, gdy wartość pH pozostanie stała.

2. Opracowanie z podwyższeniem pH (nieujęte w tym filmie, ale zalecane dla ligandów bez grup funkcyjnych wrażliwych na działanie zasad)

  1. Do mieszaniny reakcyjnej dodać stężony NH4OH, aby dostosować pH do wartości ≥11. Krok ten spowoduje wytrącenie wszelkich nieskompleksowanych metali w postaci nierozpuszczalnego wodorotlenku.
  2. Nadfiltr przefiltrować przez filtr 0,2 μm. Jeśli mieszanina reakcyjna zapycha filtr, zaleca się wirowanie i zlanie cieczy przed filtrowaniem.
  3. Jeśli dializa nie będzie przeprowadzana, usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (zaleca się odparowanie obrotowe lub liofilizację).
  4. Kroki 2.1-2.3 można powtórzyć, jeśli w próbce pozostały wolne lantanowce.

3. Proces dializy

  1. Odciąć membranę do dializy o odpowiedniej długości (zgodnie z wytycznymi producenta), aby pomieściła objętość próbki, pozostawiając dodatkowy zapas (około 10% objętości próbki). W tym filmie zastosowano membranę z progiem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 100-500 daltonów, jednak w przypadku przeprowadzenia konjugacji przed metalacją można zastosować membrany o większym MWCO. Alternatywnie można użyć kaset do dializy.
  2. Jeśli jest to wymagane zgodnie z wytycznymi producenta, namoczyć odciętą membranę w wodzie przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Napełnić naczynie do dializy (w tym filmie użyto zlewki o pojemności 1 L) wodą (dializatem). Objętość dializatu powinna być około 100-krotnie większa od objętości próbki.
  4. Złożyć dwukrotnie jeden koniec membrany i zabezpieczyć złożoną część za pomocą zacisku do dializy. Owinąć koniec zacisku gumką recepturką, aby upewnić się, że pozostanie on zamknięty podczas dializy.
  5. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez filtr 0,2 μm i wprowadzić naciągnięty filtr do otwartego końca membrany, uważając, aby jej nie przerwać. Należy pozostawić wystarczającą wolną przestrzeń, aby móc zamknąć membranę.
  6. Złożyć dwukrotnie pozostały otwarty koniec membrany, zabezpieczyć zaciskiem i owinąć go gumką recepturką, analogicznie do kroku 3.4.
  7. Przymocować gumką recepturką szklaną fiolkę wypełnioną powietrzem do zacisku na jednym końcu membrany do dializy. Do drugiego zacisku przymocować fiolkę wypełnioną piaskiem. Fiolki te zapewniają zanurzenie membrany w dializacie.
  8. Umieścić wypełnioną membranę w naczyniu do dializy zawierającym dializat.
  9. Mieszać dializat za pomocą mieszadła magnetycznego z niską prędkością obrotową (bez tworzenia wirów) w temperaturze pokojowej.
  10. Wymienić dializat 3x w ciągu doby (w tym filmie dializat wymieniano po 2,5, 6,5 i 11,5 h), a następnie kontynuować dializę przez noc (łącznie przez 20-28 h).
  11. Wyjąć membranę do dializy z dializatu i ostrożnie otworzyć jeden zacisk, aby pobrać próbkę. Przemyć membranę 3x wodą i połączyć popłuczyny z próbką.
  12. Usunąć wodę pod zmniejszonym ciśnieniem. W tym filmie zastosowano liofilizację.

4. Ocena obecności wolnego metalu

  1. Rozpuścić kompleks metalu w buforze octanowym (przygotowanie buforu: rozpuścić 1,4 mL kwasu octowego w 400 mL wody, dostosować pH do 5,8 za pomocą 1 M NH4OH i dodać wodę do uzyskania objętości całkowitej 500 mL), a następnie dodać wskaźnik pomarańcz ksylenolowy (16 μM w buforze o pH 5,8). W tym filmie 0,3 mg kompleksu rozpuszczono w 0,3 mL buforu i dodano 3 mL roztworu wskaźnika.
  2. Wykryć obecność wolnego metalu poprzez obserwację zmiany barwy wskaźnika z żółtej na fioletową.
  3. W razie potrzeby ilość wolnego metalu można określić ilościowo poprzez sporządzenie krzywej kalibracyjnej1. Alternatywnie zamiast pomarańczowego ksylenolu można użyć barwnika arsenazo III2. Jeśli w próbce pozostaje wolny metal, przed charakterystyką należy ją dodatkowo oczyścić za pomocą dializy, kolumny odsalającej lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

5. Wyznaczanie liczby cząsteczek wody w sferze koordynacyjnej (q)

  1. Przygotować roztwór kompleksu zawierającego EuIII (~1 mM) w H2O oraz drugi roztwór o tym samym stężeniu w D2O. Przed analizą roztwór w D2O musi zostać odparowany i rozpuszczony w D2O trzykrotnie w celu usunięcia resztkowej H2O.
  2. Wlać roztwór wodny do czystej kuwety, a następnie umieścić kuwetę w spektrofluorometrze.
  3. Wykonać skanowanie wzbudzenia i emisji w celu wyznaczenia maksimów dla każdego z nich (odpowiednio ~395 nm i ~595 nm).
  4. Przeprowadzić eksperyment pomiaru czasu zaniku fosforescencji, stosując następujące parametry: długości fal wzbudzenia i emisji wyznaczone w kroku 5.3, szerokości szczelin wzbudzenia i emisji (5 nm), liczbę błysków (100), opóźnienie początkowe (0.01 ms), opóźnienie maksymalne (13 ms) oraz przyrost opóźnienia (0.1 ms). Warunki te są odpowiednie dla większości kompleksów, jednak wartości maksymalnego opóźnienia i przyrostu można zwiększyć lub zmniejszyć dla związków o ekstremalnie długich lub ekstremalnie krótkich czasach zaniku.
  5. Powtórzyć krok 5.4 z roztworem w D2O przygotowanym w kroku 5.1.
  6. Na podstawie danych zaniku luminescencji uzyskanych w punktach 5.4 i 5.5 narysować wykres logarytmu naturalnego intensywności w funkcji czasu. Nachylenie tych linii stanowi szybkość zaniku (τ-1) (Rysunek 2). W tym filmie do wygenerowania wykresów logarytmu naturalnego z surowych danych użyto programu Microsoft Excel 2007. Wykorzystać szybkości zaniku w równaniu opracowanym przez Horrocksa i współpracowników (równanie 1)3. Jeśli ligand zawiera grupy OH lub NH skoordynowane z metalem, równanie musi zostać zmodyfikowane przed użyciem3.

rów. 1:   figure-protocol-1

6. Pomiary relaksywności

  1. Wybierz odpowiedni tryb aplikacji w analizatorze czasu relaksacji: T1 (czas relaksacji podłużnej) lub T2 (czas relaksacji poprzecznej).
  2. Przygotuj serię próbek zawierających różne stężenia kompleksu z GdIII w rozpuszczalniku wodnym. W tym filmie jako rozpuszczalnik zastosowano wodę i przygotowano roztwory o stężeniach 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 oraz 0 mM. Można zastosować inne rozpuszczalniki wodne lub bufory, jednak ważne jest użycie rozpuszczalnika jako próbki ślepej. Końcowa objętość próbki zależy od używanego urządzenia.
  3. Umieść próbkę w urządzeniu i odczekaj 5 min, aby wyrównała ona temperaturę urządzenia (w tym filmie 37 °C).
  4. Wyznacz czas relaksacji (w jednostkach s), dostosowując parametry oprogramowania w celu uzyskania gładkiej krzywej wykładniczej dla T1 lub T2 (reprezentatywne krzywe dla T1 i T2 przedstawiono na rysunku 3).
  5. Powtórz kroki 6.3 i 6.4 dla wszystkich próbek, w tym dla próbki ślepej.
  6. Oblicz odwrotność zmierzonych wartości T1 lub T2 w jednostkach s-1.
  7. Przedstaw wartości T1-1 lub T2-1 w funkcji stężenia GdIII (w jednostkach mM). Ze względu na higroskopijną naturę kompleksów zawierających GdIII, potwierdź stężenie GdIII za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej lub spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną. Dopasuj do wykresu linię prostą. Reprezentatywny wykres przedstawiono na rysunku 4.
  8. Nachylenie dopasowanej prostej stanowi relaksywność (r1 lub r2 odpowiednio dla T1 i T2) i jest wyrażona w jednostkach mM-1s-1.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne dane dla poszczególnych kroków tego protokołu zostały zamieszczone w sekcji Tabele i Rysunki. Oprócz opisanego w protokole wyznaczenia liczby koordynacyjnej wody oraz charakterystyki relaksacyjności, istotne jest scharakteryzowanie produktów końcowych przy użyciu standardowych technik chemicznych. Tożsamość związku można potwierdzić za pomocą spektrometrii mas; reprezentatywne widma mas pokazujące diagnostyczne wzorce izotopowe dla kompleksów zawierających GdIII i EuIII przedstawiono na Rysunku 5. Ponadto, w przypadku kompleksów zawierających lantanowce inne niż GdIII, do identyfikacji produktu można wykorzystać spektroskopię NMR. W celu oceny czystości kompleksu można zastosować HPLC, analizę elementarną lub obie te metody.

figure-protocol-2
Rycina 1. Ogólny schemat metalacji i oczyszczania: Schemat przedstawiający ogólną procedurę metalacji oraz powody wyboru różnych dróg oczyszczania.

figure-protocol-3
Rysunek 2. Wykres natężenia luminescencji: Reprezentatywny wykres logarytmu naturalnego natężenia w funkcji czasu z sekcji 5. Nachylenia linii wyznaczonych z podobnych krzywych uzyskanych dla roztworów w wodzie i D2O są wykorzystywane w równaniu 1 do określenia liczby cząsteczek wody w sferze koordynacyjnej kompleksów zawierających EuIII.

figure-protocol-4
Rysunek 3. Krzywe czasu zaniku relaksacji: Reprezentatywne dane dla akwizycji T1 (lewo) i T2 (prawo). Odchylenia od kształtu tych krzywych prowadziłyby do uzyskania niewiarygodnych danych.

figure-protocol-5
Rycina 4. Wyznaczanie relaksywności: reprezentatywny wykres zależności 1/T1 od stężenia GdIII. Nachylenie dopasowanej linii odpowiada relaksywności i jest wyrażone w jednostkach mM-1s-1.

figure-protocol-6
Rysunek 5. Widma mas: Reprezentatywne widma mas wykazujące diagnostyczne wzorce izotopowe dla kompleksów zawierających GdIII (po lewej) oraz kompleksów zawierających EuIII (po prawej). Czarne piki Gaussa reprezentują teoretyczny rozkład izotopowy, a czerwone linie są rzeczywistymi danymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę publikacji obejmujących środki kontrastowe oparte na lantanowcach4-14, istotne jest, aby zachować szczególną staranność podczas przygotowywania, oczyszczania i charakteryzacji produktów w celu zapewnienia powtarzalnych i porównywalnych wyników. Kompleksy te są często uznawane za trudniejsze do oczyszczenia i scharakteryzowania w porównaniu z cząsteczkami organicznymi ze względu na ich paramagnetyczny charakter oraz wrażliwość grup funkcyjnych, które mogłyby zostać wykorzystane d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Wyrażamy wdzięczność za fundusze startowe z Wayne State University (MJA), grant z American Foundation for Aging Research (SMV) oraz Pathway to Independence Career Transition Award (R00EB007129) z National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering w ramach National Institutes of Health (MJA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EuCl₃3∙6 h2OSigma-Aldrich203254-5G
p-SCN-Bn-DTPAMakrocykleB-305
wodorotlenek amonuEMD MilliporeAX1303-3
Membrana do dializy z estru celulozy (CE) Spectra/Por Biotech - MWCO 500 DFisher Scientific68-671-24
Jednostki filtrujące Millipore IC Millex-LGFisher ScientificSLLG C13 NL
sól tetrasodowa pomarańczowego ksylenoluAlfa Aesar41379
kwas octowyFluka49199
D2OCambridge Isotope LaboratoriesDLM-4-25
oczyszczacz wodyELGAPurelab Ultra
wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria masShimadzu CorporationLCMS-2010EV
analizator czasu relaksacjiBruker CorporationMQ60 MiniSpec
Spektrofotometr UV-VisFisher Scientific20-624-00092
liofilizatorFisher Scientific10-030-133
pH-metrHanna InstrumentsHI 221
spektrofluorometrHoriba Instruments IncFluoromax-4
Kalkulator masy cząsteczkowej wersja 6.46 autorstwa Matthew Monra–, pobrano 17 października 2009 r.figure-materials-1 http://ncrr.pnl.gov/software/Kalkulator masy cząsteczkowej

Bibliografia

  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rodki kontrastowe do MRIprocedura metalacjioczyszczanie poprzez dializpomiary relaksywno ciliczba koordynacyjna wodydetekcja wolnych jon w metalicharakterystyka metod spektrometrii masanaliza zaniku luminescencjianaliza czasu relaksacji

Powiązane artykuły