Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Podsumowanie

W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę badania skuteczności leków z wykorzystaniem chirurgicznych preparatów guzów mózgu, nazwaną „metodą eksplantatu guza”. Dzięki tej metodzie możemy ocenić skuteczność leków bez naruszania mikrośrodowiska guzów litych. Aby potwierdzić wiarygodność tej metody, przedstawiamy reprezentatywne dane z badania naszego preparatu glejaka traktowanego obecnie stosowanym w pierwszej linii chemioterapii temozolomidem.

Streszczenie

Obecne terapie glejaka złośliwego wykazują jedynie działanie paliatywne. Przeszkodą w rozwoju terapeutycznym jest rozbieżność między skutecznością określaną przez obecne testy efektywności leków a skutecznością u pacjentów. W związku z tym, w fazie przedklinicznej niezbędne są nowe i niezawodne metody oceny skuteczności leków. Hodowle in vitro tkanek nowotworowych, w tym linie komórkowe, wykazują znaczne zmiany fenotypowe, genetyczne i epigenetyczne komórek rakowych spowodowane sztucznym środowiskiem hodowli komórkowej, co może nie odzwierciedlać biologii oryginalnych guzów in situ. Modele ksenoprzeszczepów u myszy z niedoborem odporności również mają swoje ograniczenia, takie jak brak układu odpornościowego oraz międzygatunkowe rozbieżności genetyczne i epigenetyczne w mikrośrodowisku. W niniejszej pracy prezentujemy nową metodę wykorzystującą preparaty chirurgiczne glejaka złośliwego w formie nierozdzielonych bloków nowotworowych do oceny efektów leczenia. Aby zwalidować tę metodę, opisano dane uzyskane przy zastosowaniu obecnego leku chemioterapeutycznego pierwszego rzutu, temozolomidu (TMZ).

W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy świeżo pobrane chirurgiczne preparaty złośliwego glejaka. Przeprowadziliśmy wewnątrznowotworowe wstrzyknięcia TMZ lub innych potencjalnych leków, po czym nastąpiła inkubacja i analiza preparatów chirurgicznych. W niniejszej pracy dążyliśmy do opracowania metody eksplantacji tkanki nowotworowej jako platformy do określania skuteczności nowych terapii przeciwnowotworowych, tak aby umożliwić przezwyciężenie przynajmniej części obecnych ograniczeń i wypełnienie istniejącej luki między aktualnymi danymi eksperymentalnymi a skutecznością działania w guzie rzeczywistego pacjenta. Metoda ta może mieć potencjał przyspieszenia identyfikacji nowych środków chemioterapeutycznych do leczenia nowotworów litych.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek

1. Pożywkę przygotowano, stosując 10% FBS (16140-071- GIBCO) w DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042- Invitrogen) z 0,6% roztworem agaru oczyszczonego, granulowanego (1.01614.1000- EMD). Przez cały czas trwania eksperymentu zachowano warunki sterylne.
2. W celu przygotowania pożywki do 45mL DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042- Invitrogen) dodano 5mL FBS (16140-071- GIBCO), uzyskując objętość końcową 50mL. Przygotowaną pożywkę przechowywano w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C.
3. Roztwór agaru przygotowano metodą ogrzewania w kuchence mikrofalowej. 0,3 grama agaru granulowanego rozpuszczono w 50mL wody destylowanej za pomocą kuchenki mikrofalowej. Roztwór agaru schłodzono do temperatury 37°C, umieszczając go w kąpieli wodnej.
4. Przygotowano roztwór zapasowy, używając równych objętości pożywek z kroków 1.2 i 1.3. Stosunek 0,6% agaru (0,5mL) do pożywki 10% FBS-D-MEM/F-12 (0,5mL) wynosił 1:1, co dało całkowitą objętość 1mL w każdym dołku płytek 6-dołkowych.

2. Obróbka tkanek

1. Tkanki z glejaka wielopostaciowego (GBM) zostały otrzymane bezpośrednio po operacji z Zakładu Patomorfologii. Tkanka została sklasyfikowana jako GBM przez Zakład Patomorfologii.
2. Tkankę ostrożnie przeniesiono pęsetą na płytkę Petriego i trzykrotnie przemyto lodowatym 5 mL 1XPBS.
3. Z rozczłonkowanych próbek wycięto seryjne sekcje w celu utworzenia bloków nowotworowych (o średnicy ok. 10 mm), używając skalpela (Feather-2976#10) i pęsety (Fisher Scientific).
4. Bloki przeniesiono do płytki 6-dołkowej. Każdy dołek zawierał 1 mL pożywki wymienionej w punkcie 1.4. Tkanka miała zapewniony odpowiedni dostęp powietrza w celu zachowania jej żywotności.
5. Bloki nowotworowe wstrzyknięto następnie DMSO (5%) lub TMZ (2,5 nM) i inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2. W celu zapewnienia jednorodności traktowania, 0,1 mL DMSO (5%) lub TMZ wstrzyknięto trzykrotnie w różnych miejscach bloków nowotworowych. Lek wstrzykiwano za pomocą strzykawki insulinowej 1 mL 0,37X12,7 mm 28G1/2 (Comfort point-26027).
6. Po 16 godzinach bloki trzykrotnie przemyto 5 mL 1XPBS. Po przemyciu bloki utrwalono w 10 mL 10% v/v formaliny (Ricca chemical company) przez 24 godziny w probówkach 50 mL (Basix-5539802), a następnie przygotowano do wykonania 4 μm przekrojów zatopionych w parafinie.
7. Przekroje utrwalone formaliną umieszczono w zlewce na mieszalce magnetycznej bez ogrzewania („NO HEAT”) i poddano obróbce w kolejnych roztworach przez 30 minut w każdym z nich: 30% etanol, 50% etanol, 75% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol oraz ksylen.
8. Tkankę osuszono ręcznikami papierowymi i umieszczono w roztopionej parafinie (58 do 60 °C, parafina Fisher Paraplast) na 30 minut.
9. Tkankę zatopiono w formach przy użyciu parafiny Surgipath Blue Ribbon, a następnie schłodzono zatopioną tkankę do temperatury pokojowej.
10. Wykonano 4 μm przekroje tkankowe zatopione w parafinie i umieszczono je na szkiełkach Fisher Plus.

3. Immunohistochemia

Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. ¹

1. Deparafinizacja i rehydratacja Umieścić preparaty w statiwie i wykonać następujące kroki: ksylen 3x5 minut (3 razy po 5 minut), etanol 100% 3x5 minut, etanol 95% 1x5 minut, etanol 70% 1x5 minut, płukanie w bieżącej wodzie z kranu przez 3 minuty.
2. Odmaskowywanie antygenów za pomocą termicznej regeneracji epitopów Zanurzyć preparaty w 1X buforze cytrynianowym (Thermo scientific-AP9003-500) rozcieńczonym wodą destylowaną w zlewce szklanej. Gotować przez 15 minut na płycie grzewczej (należy upewnić się, że skrawki nie odkleiły się od szkiełka). Schłodzić roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Płukać preparaty w 1X PBS 3x5 minut.
3. Inhibicja endogennych nadtlenków Zanurzyć preparaty w metanolu (Fisher Scientific-A-452-4) z 0,3% nadtlenkiem wodoru (Fisher Scientific- BP2633-500- rozcieńczonym w wodzie destylowanej) w zlewce szklanej przez 15 minut. Płukać w 1X PBS 3x5 minut.
4. Blokowanie Przykryć tkanki 10% normalnym surowicą kozią. Przenieść preparaty do wilgotnej komory i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć preparaty w 1X PBS 3x5 minut.
5. Przeciwciało pierwszorzędowe Skrawki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujących stężeniach: swoiste dla ludzi Caspase-3 (1:1 000, R&D systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) rozcieńczonymi w 1X PBS. Następnego dnia płukać preparaty w 1X PBS 3x10 minut.
6. Reakcja z przeciwciałem drugorzędowym Przykryć tkanki 2-3 kroplami przeciwciała drugorzędowego znakowanego HRP (envision systems). Umieścić preparaty w wilgotnej komorze i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć w 1X PBS 3x10 minut.
7. Detekcja Wywołać przy użyciu zestawu chromogenu DAB (Vector laboratories-SK-4100) do detekcji przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z protokołem producenta.
8. Barwienie kontrastowe Zanurzyć preparaty w hematoksylinie (10-15 sekund, należy upewnić się, że nie zdominowano sygnału DAB). Płukać w bieżącej wodzie z kranu przez 3 minuty.
9. Dehydratacja Zanurzyć preparaty w następującej kolejności: etanol 70% przez 5 minut, etanol 95% przez 5 minut, etanol 100% 3x5 minut, ksylen 3x5 minut.
10. Przykryć preparaty szkiełkami przy użyciu medium montażowego permount (Fisher Scientific-SP-15-100).
11. Zdjęcia wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus (DP-72).3.11). We wszystkich eksperymentach specyficzność znakowania potwierdzono za pomocą kontroli negatywnej bez przeciwciała pierwszorzędowego.

4. Reprezentatywne wyniki:

Zebrano preparaty chirurgiczne z wielopostaciowego glejaka (GBM). Pacjenci zostali poddani pierwszej operacji bez uprzedniej chemioterapii, w tym z użyciem temozolomidu (TMZ). Obraz MRI w obrazowaniu T1 z kontrastem gadolinowym na Rysunku 1a wykazał obecność wzmocnionego kontrastowo guza w prawym płacie czołowym przed operacją. Obraz pooperacyjny (Rysunek 1b) potwierdził częściową resekcję zmiany po zabiegu. Tkanki chirurgiczne przekazano do Zakładu Patomorfologii w celu postawienia diagnozy klinicznej, a pozostałe preparaty poddano procedurze pozyskiwania tkanek zgodnie z zatwierdzonym protokołem Institutional Review Board (IRB) w Ohio State University Medical Center. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazało obecność martwicy, komórek tworzących palisady oraz proliferacji mikro naczyniowej (Rysunek 1-c). W ten sposób guzy te zdiagnozowano histopatologicznie jako GBM. Warto zauważyć, że eksplanty guzów po inkubacji bez TMZ do 48 godzin zachowały cytoarchitekturę GBM. Z kolei przy inkubacji trwającej 72 godziny lub dłużej zaobserwowano zwiększoną liczbę kondensacji jąder w preparatach, co sugeruje rozpoczęcie procesu apoptozy w niektórych komórkach nowotworowych. W konsekwencji tkanki guzowe po dłuższej inkubacji zawierały ogniskowe obszary ubytku komórek nowotworowych, które obserwowano preferencyjnie w obrębie i wokół obszarów martwicy (dane niepokazane).

Aby zbadać, czy te próbki eksplantów guza mogą być wiarygodnie wykorzystane do testowania skuteczności leków, przetestowano efekt leczenia TMZ. Rycina 2 przedstawia przebieg eksperymentów w niniejszym badaniu. Niedawne badanie wskazało, że wewnątrzguzała podaż TMZ wywiera silniejszy wpływ na kontrolę wzrostu glejaka złośliwego niż systemiczne podawanie tego leku ². Po 16-godzinnej inkubacji eksplanty zatopiono w parafinie i przygotowano seryjne przekroje do barwienia. Immunohistochemia tkanek GBM leczonych TMZ wykazała istotną redukcję komórek nowotworowych wykazujących obecność Ki-67 w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Z kolei immunohistochemia z użyciem markera apoptozy, Kaspazy-3, nie wykazała żadnej istotnej różnicy między preparatami glejaka leczonymi TMZ a próbkami kontrolnymi (Rycina 3).

Efekt terapeutyczny TMZ został następnie scharakteryzowany poprzez połączenie tego testu z eksplantatami z hodowlą in vitro lub cytometrią przepływową. W szczególności dążono do określenia wpływu na komórki nowotworowe o właściwościach macierzystych (SCLTC). W związku z tym, po leczeniu wewnątrzguza TMZ, przeprowadzono test tworzenia sfer oraz cytometrię przepływową tych eksplantatów guza. Próbki leczone TMZ rozdzielono na pojedyncze komórki, które następnie wysiano w niskiej gęstości (1 komórka na mikrolitr lub mniej) na płytkach 96-dołkowych w medium beztłuszczowym uzupełnionym o bFGF i EGF. W grupie kontrolnej tworzenie sfer nowotworowych z eksplantatów guza zaobserwowano po 7-dniowej inkubacji. Z uwagi na to, że tworzenie sfer jest cechą SCLTC^{3 4}, zmiany w liczbie sfer nowotworowych po leczeniu lekiem wskazują na wpływ na SCLTC. Podobnie, w celu weryfikacji wpływu na SCLTC, przeprowadzono cytometrię przepływową rozdzielonych eksplantatów guza z zastosowaniem markera powierzchniowego komórek CD133. Jeśli SCLTC w heterogenicznych komórkach nowotworowych w GBM są selektywnie eliminowane przez leczenie lekiem, można przewidywać, że cytometria przepływowa wykaże spadek frakcji CD133-dodatniej po zastosowaniu leczenia (dane nie pokazano).

Rysunek 1. Obrazy rezonansu magnetycznego (MRI) pacjenta z GBM. Reprezentatywne obrazy przed operacją (Rysunek 1a) oraz po operacji (Rysunek 1b). Rysunek 1c przedstawia barwienie H&E świeżej próbki tkanki GBM. Powiększenie oryginalne, 40X.

Rycina 2. Schemat przepływu eksperymentu z wykorzystaniem hodowli blokowej. Rycina 2a. Obraz świeżego materiału chirurgicznego GBM otrzymanego z oddziału patomorfologii. Rycina 2b przedstawia sekcję bloku guza na małe fragmenty o rozmiarze 10mm przy użyciu skalpela chirurgicznego. Rycina 2c przedstawia podawanie leku (TMZ) do bloków guza za pomocą strzykawki insulinowej.

Rycina 3. Immunohistochemia. Immunohistochemia bloków tkankowych GBM po wstrzyknięciu DMSO lub TMZ z użyciem przeciwciał przeciwko aktywowanej Caspase-3 oraz Ki67. Do barwienia jąder komórkowych użyto hematoksyliny. Powiększenie oryginalne, 40X.

Dyskusja

Istnieje rozbieżność między skutecznością leków w obecnych przedklinicznych modelach doświadczalnych a ich skutecznością u pacjentów. W szczególności w dziedzinie badań nad guzami mózgu wymagane są nowe i niezawodne metody, które pomogłyby wypełnić istniejącą lukę między oceną leków za pomocą obecnych metod a ich skutecznością u pacjentów. Opisany w niniejszym badaniu test stanowi dodatkowe wsparcie, jeśli nie rozwiązanie, ułatwiające niwelowanie rozbieżności między danymi eksperymentalnymi a wynikami u chorych pacjentów.

Hodowle komórkowe in vitro preferencyjnie namnażają określone typy komórek nowotworowych niezależnie od warunków hodowli i reprezentują jedynie subpopulację całego guza. ⁵ Dodatkowo w przypadku długotrwałych hodowli komórkowych nieunikniona jest transformacja genetyczna i fenotypowa podczas sztucznego namnażania komórek. Jedną z głównych przeszkód w leczeniu złośliwego glejaka jest heterogenność komórek nowotworowych, zarówno w obrębie pojedynczego guza, jak i pomiędzy próbkami nowotworowymi ^{6, 7}. W związku z tym selektywne wzbogacanie określonej populacji komórek nowotworowych, niezależnie od ich typu, może nie być odpowiednią metodą określania skuteczności środków chemioterapeutycznych wobec heterogennych komórek nowotworowych. ^{8 9} Każdy model zwierzęcy guzów mózgu pochodzący z subpopulacji komórek nowotworowych rzuca światło na skuteczność leku w odniesieniu do tej subpopulacji, a nie do całego guza.

Z drugiej strony, metoda ta z wykorzystaniem eksplantów guza wciąż posiada kilka ograniczeń. Jednym z nich jest stosunkowo krótki okres leczenia. Ponieważ uważa się, że komórki nowotworowe z czasem nabywają oporności na większość, jeśli nie wszystkie terapie, początkowa kontrola krótkoterminowego wzrostu komórek guza może nie odzwierciedlać długoterminowego rokowania pacjenta, co niedawno zgłoszono w przypadku bevacizumabu, czynnika antyangiogennego ¹⁰. Zatem w toku dalszych badań konieczne jest usprawnienie protokołu tego testu z eksplantami w celu dłuższej konserwacji tkanek. Inną kwestią jest specyficzny wpływ badanego leku na SCLTC w guzie. Biorąc pod uwagę, że SCLTC są stosunkowo oporne na obecne terapie złośliwego glejaka, uzasadnione jest poszukiwanie nowych leków przeciwnowotworowych, które skutecznie eliminują SCLTC. W związku z tym obecnie dążymy do połączenia tego testu z eksplantami z późniejszymi badaniami in vitro, takimi jak test tworzenia neurosfer (dane nie pokazano). Spodziewamy się, że dzięki tym połączonym testom dowiemy się więcej o efektach, o ile takie wystąpią, kandydata na lek w stosunku do SCLTC. Wreszcie, użycie małych bloków próbek guza może nie odzwierciedlać całej populacji komórek nowotworowych, co ma miejsce w przypadku konwencjonalnych linii komórkowych nowotworu lub kultur pierwotnych z preparatów chirurgicznych. Pomijając te kwestie, zachowanie zrębu guza, w tym niszy naczyniowej, jest pomocne w charakteryzacji czynników środowiskowych dla komórek nowotworowych. Dlatego test ten może mieć potencjał do oceny dowolnych strategii terapeutycznych w warunkach bardziej zbliżonych fizjologicznie.

W niniejszej pracy opracowaliśmy test skuteczności leków z wykorzystaniem eksplantów z chirurgicznych preparatów GBM. W przypadku badanych preparatów chirurgicznych stwierdzono, że bezpośrednie wstrzyknięcie TMZ ogranicza proliferację w próbkach GBM. Metoda ta, oparta na eksplantach tkankowych, jest teoretycznie możliwa do zastosowania w przypadku innych nowotworów litych i stanowi narzędzie do określania skuteczności leku w odniesieniu do guza konkretnego pacjenta, co w nadziei pomoże uniknąć kolejnych niepowodzeń w badaniach klinicznych nad nowotworami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana ciepłem	GIBCO, by Life Technologies	16140-071
D-MEM/F-12 (1X) ciecz 1:1	Invitrogen	10565-042
Agar-agar oczyszczony, granulowany	EMD Millipore	1.01614.1000
DPBS do barwienia	Invitrogen	14190
Hematoksylina	Richard-Allan Scientific	7211
10% w/v formalina Caspase-3	Ricca Chemical Company	3810
Caspase-3	R&D Systems	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
System Envision – anty-mysi	Dako	2012-07
System Envision – anty-króliczy	Dako	2011-12
Zestaw DAB	Vector Laboratories	SK-4100
Tabela 1. Materiały.
Płytka 6-dołkowa	Greiner Bio-One	657160
Szkiełko Petriego	VWR international	25384-302
Pipeta serologiczna	Axygen Scientific
Kapturki z filtrem	USA Scientific, Inc.
Wkładka Netwell z siatką poliestrową 500 μm	Costar	3480
Macierz Matrigel	BD Biosciences	354230
Strzykawka BD 10 mL	BD Biosciences	309604
Igła podskórna z aluminiowym piastem	Tyco Healthcare, Covidien	2000029
Flask do hodowli tkankowych	Corning
Probówki wirówkowe	Basix	5539800
Probówki o cienkich ściankach	Eton	1107A
Chirurgiczne ostrze ze stali nierdzewnej	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2976#10
Strzykawka insulinowa	Comfort point	26027
Probówka 50 mL z płaskim dnem i zakrętką	Basix	5539802
Mikroskop sekcyjny	Tritech Research, Inc.
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus Corporation	DP-72
Pinceta	Fisher Scientific
Tabela 2. Sprzęt.